Fkh1/2 Path
FORKHEAD-LIKE и МИТОЗЫ
The fork'ed path to mitosis Paul Jorgensen, Mike Tyers Genome Biology 2000 1(3): reviews1022.1-1022.4 http://genomebiology.com/2000/1/3/reviews/1022/
Transcriptional circuits in the cell cycle Канонические фазы клеточного цикла - G1, S, G2 и M - предопределяются частично с помощью специфических транскрипционных программ (Рис. 1а). (Рис.1.) \| The transcriptional wiring diagram of the budding yeast cell cycle Т.к. в онтогенетичестких иерархиях экспрессия гена в одной стадии клеточного цикла часто предопределяется с помощью предыдущей экспрессии необходимых транскрипционных факторов на предыдущей стадии. Напр., в клеточном цикле дрожжей, G1/S-специфический транскрипционный фактор Swi4 максимально экспрессируется в M/G1 фазе, а M/G1 транскрипционные факторы Swi5 и Ace2 достигают пика в G2/M фазе (Рис. 1с). Стадиоспецифические программы транскрипции в клеточном цикле связаны др с др тонкими взаимодействиями транскрипционных факторов, активностью cyclin-dependent kinase (CDK) и ubiquitin-зависимым протеолизом. В почкующихся дрожжах, одиночная CDK, Cdc28, активируется в G1 фазе тремя G1 циклинами (Cln1-Cln3), которые инициируют вступление в клеточный цикл и снова в поздней фазе с помощью различных членов семейства из шести B-type циклинов (Clb1-Clb6), которые управляют репликацией ДНК, элонгацией веретена и митозом. Точное время протеолитической деградации циклинов и др регуляторов клеточного цикла с помощью убиквитиновой системы лежит на активности CDK в поздней G1 фазе и выключает их в конце митоза. Как часть этого регуляторного циркуита циклины сами формируют критические элементы G1/S и G2/M транскрипционных программ, часто обозначаемых как CLN2 и CLB2 кластеры, соотв. Транскрипционный ландшафт клеточного цикла доминирует с помощью этих двух больших блоков генной экспрессии, которые управляются разными cyclin-Cdc28 активностями. Индукция 120 или около того генов в CLN2 кластере диктуется в первую очередь активностью Cln3-Cdc28, которые стимулируют G1/S транскрипционные факторы Swi4, Swi6 и Mbp1. Сходным образом, Clb1/2-Cdc28 активность управляет экспрессией примерно 33 генов в CLB2 кластере, вклюяая сами CLB1 и CLB2 и гены, кодирующие др важные митотические регуляторы, такие как CDC20, SWI5 и ACE2. В отсутствие Clb1/2, клетки арестовываются на границе G2/M и неспособны выполнять G2/M транскрипционную программу. Эта позитивная петля обратной связи Clb1/2-Cdc28 активности и CLB1/2 транскрипции помогает эффективному принятию решения о вступлении в митоз. Деградация Clb циклинов в конце митозов устраняет позитивную петлю обратной связи и тем самым делает возможным посторное вступление в G1фазу. В то время как G1/S транскрипционные факторы анализируются давно, факторы, которые управляют CLB2 кластером еще предстоит изучить, хотя некоторые биохимические характеристики известны. DNA footprinting анализ промотора SWI5 указывает на то, что его периодическая экспрессия покоится на связывании повсеместного MADS-box транскрипционного фактора, Mcm1, в комбинации с активностью, называемой 'Swi five factor', или SFF. Почти все промоторы CLB2 кластера содержат связывающий сайт для Mcm1-SFF, обозначаемый как Swi5-factor responsive element, или SFRE. Установлено, что SFF является комплексом forkhead-подобных транскрипционных факторов Fkh1 и Fkh2, и др транскрипционного активатора Ndd1. (Рис.2.) \| Regulation of the CLB2 cluster by SFF	The unmasking of SFF Идентификация SFF базируется на анализе генов, регулирующих клеточный цикл, которые достигают вершины экспрессии в S фазе, непосредственно перед активацией кластера CLB2. FKH1 один из таких генов. Отметив, что транскрипционные активаторы одного кластера часто экспрессируются в предыдущей волне транскрипции, было предположено, что Fkh1 м.б. кандидатом на роль SFF. Факторы транскрипции forkhead-like часто контролируют работу программ развития у metazoans. Факт, что геном дрожжей кодирует очень сходный гомолог, Fkh2, сделал возможной идентификацию SFF с помощью генетических подходов. Анализ FKH1 и FKH2 генов показал, что они не только необходимы для регулируемой экспрессии CLB2 кластера, но и являются двумя факторами, связывающими сиквенс элемент, который сопоставим с SFRE. Генетический анализ функции FKH1/2 выявил их роль в G2/M переходе. Независимо Fkh2 был также идентифицирован непосредственно путем очистки белков, которые связываются с SFRE последовательностью. Доказательства, что Fkh1/2 формируют часть SFF противоречивы. Установлено, что Fkh1 и Fkh2 соединяются с CLB2 и SWI5 промоторными областями in vivo, но не с мутантными промоторами, в которых отсутствует SFRE сайт. Учитывая центральную роль Fkh1/2 в митотической экспрессии циклинов, не является неожиданным то, что fkh1 fkh2 двойные мутантные линии обнаруживают тяжелую задержку G2/M и имеют pseudohyphal growth фенотип, оба - результат дефекта активности митотической Cdc28 киназы. Из двух генов, FKH2 , по-видимому, отвечает за большую часть SFF активности. Наконец, м. предсказать, что отсутствие активности SFF в fkh1 fkh2 линиях вызывает эффект домино, при котором нижестоящий кластер SIC1 генов не способен собственно oscillate потому. что Swi5 и Ace2 обычно запускаемые с помощью CLB2 кластера, экспрессируются плохо. Имеется в SFF больше, чем только Fkh1 и Fkh2. Хотя кластер CLB2 теряет свою нормальную периодичность в fkh1 fkh2 мутантных клетках, клатсер все еще экспрессируется на низком коституитивном уровне. С помощью интерференции, подобно до транкриционным факторам, таким как E2F-1, Fkh1/2 могут выполнять как активирующей, так и репрессорной функцией. В соответствии с этой возможностью, по-видимому, Fkh1/2 и Mcm1 остаются связанными с CLB2 и SWI5 промоторами в течение всего клеточного цикла. Др., еще не установленный белок, который очищается вместе с Fkh2, м.б. ответственен за репрессию вне G2/M окна. Что, если не Fkh1/2 связывание отвечает за cell-cycle-регулируемую транскрипцию кластера CLB2? Периодичность активности SFF, по-видимому, обусловлена Ndd1, транскрипционным фактором, необходимым для экспрессии CLB1/2. NDD1 был открыт как высоко-копийный супрессор аллеля cdc28-1N , который специфически дефектен по митотической Cdc28 активности. В противоположность Fkh1/2, Ndd1 существенен для G2/M перехода, является скорость-лимитирующим активатором экспрессии CLB1/2 и SWI5 генов и оладает трансактивирующей функцией, если слит с с гетерологическим ДНК-связывающим доменом. Ndd1 в конечном счете ассоциирует с CLB2 и SWI5 промоторами in vivo, Mcm1-Fkh1/2-зависимым способом. Пик экспрессии NDD1 как раз перед пиком для кластера CLB2 и вообще, стабильность Ndd1 белка регулируется также и во время клеточного цикла, будучи нестабильной с поздней анафазы по конца G1 фазы, подобно Clb белкам. Наконец, вывод о том, что Fkh1/2 также влияют на репрессию транскрипции подтверждается тем, что потеря функции Fkh обходит потребность в Ndd1. Согласно модели (Рис. 2) до экспрессии Ndd1, комплекс Mcm1-Fkh1/2 соединяется с SFRE сайтами на промоторах генов в кластере CLB2 где он, по-видимому, обеспечивает репрессию транскрипции. Как только клетка заканчивает S фазу, Ndd1 рекрутируется на Mcm1-Fkh1/2 платформу, смещая при этом предполагаемую репрессивную machinery и в то же самое время рекрутируя RNA polymerase II holoenzyme, чтобы активровать транскрипцию. Эта модель вызывает вопрос - как Ndd1 взаимодействие с Mcm1- Fkh1/2 контролируется с помощью Clb1/2-Cdc28 активности? Захватывающая возможность в структуре Fkh1 и Fkh2. Помимо ДНК-связывающих доменов, Fkh1 и Fkh2 содержат forkhead-associated (FHA) домен, для соединения с фосфосериновыми пептидными мотивами. Возможно, что Clb1/2-Cdc28 киназы фосфорилируют Ndd1, который содержит многочисленные Cdc28 consensus сайты и тем самым управляет их связыванием с FHA доменами в Fkh1/2. Или, Fkh2 фосфорилирует сам себя непосредственно перед митозом, возможно, при этом, что внутримолекулярные взаимодействия между фосфорилированными остатками и FHA доменом м. регулировать ассоциацию Fkh1/2 с Ndd1. Down the fork'ed path Идентификация предполагаемой репрессионной machinery, которая ассоциирует с Fkh1/2, и выяснение, как она устраняется с помощью Ndd1, важны для понимания переключения с транскрипционной репрессии к активации на G2/M границе. Запуск SFF-зависимой транскрипции остается мистическим, но логика ведет к Fkh1 и Fkh2, указывая на то, что факторы, которые регулируют экспрессию FKH1/2 и NDD1 м. помочь определить начало транскрипции нижестоящего CLB2 кластера. В самом деле, FKH1/2 и NDD1 являются кандидатами в члены cell-cycle-регулируемого "кластера 14" S фазы. В конце митоза отставка CLB2 кластера вносит вклад в катастрофический коллапс Clb-Cdc28 киназной активности, необходимый lzk выхода из митоза и повторного вступления в G1 фазу. Ndd1 деградация, по-видимому, ускоряет этот процесс, т.к. деструкция Ndd1 совпадает с активацией anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), ubiquitin ligase, которая маркирует многочисленные митотические регуляторы на протеолиз с помощью 26S протеасом. Элиминируется ли Ndd1 с помощью APC/C или др. пути, нужны исследования последствия мутационной стабилизации Ndd1. Наконец, загадочная связь между низкой активностью Clb1/2-Cdc28 и pseudohyphal ростом в ответ м. проясниться после выяснения регуляции SFF. В любом случае, идентификация Fkh1, Fkh2 и Ndd1 как ключевых компонентов SFF заполняет пробел в клеточном цикле почкующихся дрожжей (Рис. 1c).

The unmasking of SFF

Идентификация SFF базируется на анализе генов, регулирующих клеточный цикл, которые достигают вершины экспрессии в S фазе, непосредственно перед активацией кластера CLB2. FKH1 один из таких генов. Отметив, что транскрипционные активаторы одного кластера часто экспрессируются в предыдущей волне транскрипции, было предположено, что Fkh1 м.б. кандидатом на роль SFF. Факторы транскрипции forkhead-like часто контролируют работу программ развития у metazoans. Факт, что геном дрожжей кодирует очень сходный гомолог, Fkh2, сделал возможной идентификацию SFF с помощью генетических подходов. Анализ FKH1 и FKH2 генов показал, что они не только необходимы для регулируемой экспрессии CLB2 кластера, но и являются двумя факторами, связывающими сиквенс элемент, который сопоставим с SFRE. Генетический анализ функции FKH1/2 выявил их роль в G2/M переходе. Независимо Fkh2 был также идентифицирован непосредственно путем очистки белков, которые связываются с SFRE последовательностью.

Доказательства, что Fkh1/2 формируют часть SFF противоречивы. Установлено, что Fkh1 и Fkh2 соединяются с CLB2 и SWI5 промоторными областями in vivo, но не с мутантными промоторами, в которых отсутствует SFRE сайт. Учитывая центральную роль Fkh1/2 в митотической экспрессии циклинов, не является неожиданным то, что fkh1 fkh2 двойные мутантные линии обнаруживают тяжелую задержку G2/M и имеют pseudohyphal growth фенотип, оба - результат дефекта активности митотической Cdc28 киназы. Из двух генов, FKH2 , по-видимому, отвечает за большую часть SFF активности. Наконец, м. предсказать, что отсутствие активности SFF в fkh1 fkh2 линиях вызывает эффект домино, при котором нижестоящий кластер SIC1 генов не способен собственно oscillate потому. что Swi5 и Ace2 обычно запускаемые с помощью CLB2 кластера, экспрессируются плохо.

Имеется в SFF больше, чем только Fkh1 и Fkh2. Хотя кластер CLB2 теряет свою нормальную периодичность в fkh1 fkh2 мутантных клетках, клатсер все еще экспрессируется на низком коституитивном уровне. С помощью интерференции, подобно до транкриционным факторам, таким как E2F-1, Fkh1/2 могут выполнять как активирующей, так и репрессорной функцией. В соответствии с этой возможностью, по-видимому, Fkh1/2 и Mcm1 остаются связанными с CLB2 и SWI5 промоторами в течение всего клеточного цикла. Др., еще не установленный белок, который очищается вместе с Fkh2, м.б. ответственен за репрессию вне G2/M окна.

Что, если не Fkh1/2 связывание отвечает за cell-cycle-регулируемую транскрипцию кластера CLB2? Периодичность активности SFF, по-видимому, обусловлена Ndd1, транскрипционным фактором, необходимым для экспрессии CLB1/2. NDD1 был открыт как высоко-копийный супрессор аллеля cdc28-1N , который специфически дефектен по митотической Cdc28 активности. В противоположность Fkh1/2, Ndd1 существенен для G2/M перехода, является скорость-лимитирующим активатором экспрессии CLB1/2 и SWI5 генов и оладает трансактивирующей функцией, если слит с с гетерологическим ДНК-связывающим доменом. Ndd1 в конечном счете ассоциирует с CLB2 и SWI5 промоторами in vivo, Mcm1-Fkh1/2-зависимым способом. Пик экспрессии NDD1 как раз перед пиком для кластера CLB2 и вообще, стабильность Ndd1 белка регулируется также и во время клеточного цикла, будучи нестабильной с поздней анафазы по конца G1 фазы, подобно Clb белкам. Наконец, вывод о том, что Fkh1/2 также влияют на репрессию транскрипции подтверждается тем, что потеря функции Fkh обходит потребность в Ndd1.

Согласно модели (Рис. 2) до экспрессии Ndd1, комплекс Mcm1-Fkh1/2 соединяется с SFRE сайтами на промоторах генов в кластере CLB2 где он, по-видимому, обеспечивает репрессию транскрипции. Как только клетка заканчивает S фазу, Ndd1 рекрутируется на Mcm1-Fkh1/2 платформу, смещая при этом предполагаемую репрессивную machinery и в то же самое время рекрутируя RNA polymerase II holoenzyme, чтобы активровать транскрипцию. Эта модель вызывает вопрос - как Ndd1 взаимодействие с Mcm1- Fkh1/2 контролируется с помощью Clb1/2-Cdc28 активности? Захватывающая возможность в структуре Fkh1 и Fkh2. Помимо ДНК-связывающих доменов, Fkh1 и Fkh2 содержат forkhead-associated (FHA) домен, для соединения с фосфосериновыми пептидными мотивами. Возможно, что Clb1/2-Cdc28 киназы фосфорилируют Ndd1, который содержит многочисленные Cdc28 consensus сайты и тем самым управляет их связыванием с FHA доменами в Fkh1/2. Или, Fkh2 фосфорилирует сам себя непосредственно перед митозом, возможно, при этом, что внутримолекулярные взаимодействия между фосфорилированными остатками и FHA доменом м. регулировать ассоциацию Fkh1/2 с Ndd1.

Down the fork'ed path

Идентификация предполагаемой репрессионной machinery, которая ассоциирует с Fkh1/2, и выяснение, как она устраняется с помощью Ndd1, важны для понимания переключения с транскрипционной репрессии к активации на G2/M границе. Запуск SFF-зависимой транскрипции остается мистическим, но логика ведет к Fkh1 и Fkh2, указывая на то, что факторы, которые регулируют экспрессию FKH1/2 и NDD1 м. помочь определить начало транскрипции нижестоящего CLB2 кластера. В самом деле, FKH1/2 и NDD1 являются кандидатами в члены cell-cycle-регулируемого "кластера 14" S фазы.

В конце митоза отставка CLB2 кластера вносит вклад в катастрофический коллапс Clb-Cdc28 киназной активности, необходимый lzk выхода из митоза и повторного вступления в G1 фазу. Ndd1 деградация, по-видимому, ускоряет этот процесс, т.к. деструкция Ndd1 совпадает с активацией anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), ubiquitin ligase, которая маркирует многочисленные митотические регуляторы на протеолиз с помощью 26S протеасом. Элиминируется ли Ndd1 с помощью APC/C или др. пути, нужны исследования последствия мутационной стабилизации Ndd1. Наконец, загадочная связь между низкой активностью Clb1/2-Cdc28 и pseudohyphal ростом в ответ м. проясниться после выяснения регуляции SFF. В любом случае, идентификация Fkh1, Fkh2 и Ndd1 как ключевых компонентов SFF заполняет пробел в клеточном цикле почкующихся дрожжей (Рис. 1c).

The fork'ed path to mitosis

Transcriptional circuits in the cell cycle

The unmasking of SFF

Down the fork'ed path