Ацетилированные по законсервированным лизиновым остаткам в ε-amino группах хвостов гистоны обычно ассоциируют с транскрипционно активным хроматином, деацетилированные с неактивным. Ацетилирование также важно для репликации и сборки нуклеосом, упаковки в хроматин высшего порядка и для взаимодействий негистоновых белков с нуклеосомами. В частности, высоко законсервированные лизины в положении 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и лизины 5, 8,12 и 16 гистона Н4, часто являются мишенями для модификаций. Нейтрализация основного заряда гистоновых хвостов ацетилированием снижает их сродство с ДНК и меняет histone:histone взаимодействия между соседними нуклеосомами, а также взаимодействия гистонов с др. регуляторными белками. Это делает возможной транскрипцию. Однако ацетилирование лизина 12 в гистоне H4 связано с транскрипционным молчанием ( silencing) у дрожжей и Drosophila, а некоторые acetyltransferases, такие как Sas3 и Hat1,связаны с silencing у дрожжей.

Было установлено, что законсервированный регулятор транскрипции Gcn5 обладает histone acetyltransferase (HAT) активностью. Gcn5 дрожжей и человека и ортолог белка человека, PCAF, ассоциированы с др. транскрипционными адпторами или коактиваторами в мультисубъединичные комплексы, которые регулируют специфичность и соединение Gcn5 с промоторами-мишенями. Gcn5 и PCAF обычно модифицируют лизин 14 гистона H3. Однако эти энзимы м. модифицировать и более широкий спектр лизинов. Анализ нативного комплекса, содержащего Gcn5, дрожжевого 'SAGA' высоко законсервированного комплекса, показал, что он содержит большое количество коактиваторов транскрипции из Spt, Ada, TAF и Tra1 семейств, которые преимущественно модифицируют нуклеосомные гистоны H3 и H2B. Локальный фокус ацетилирования создается, когда эта активность специфически поставляется промоторам кислыми активаторами или в результате действия АТФ-зависимого SWI/SNF хроматин-ремодулирующего комплекса. Последний благодаря 'разрыхлению' нуклеосом позволяет транскрипционным факторам добраться до своих мишеней внутри хроматина.

HATs

Далее было установлено, что многочисленные коактиваторные белки также обладают HAT активностью и являются компонентами комплексов высокого молекулярного веса, содержащих транскрипционные регуляторы. Известно несколько семейств acetyltransferases, свыше 20 энзимов, которые генерируют специфические паттерны ацетилирования свободных и/или ассоциированных с нуклеосомами гистонов. первым семейством HATs является GNATсверхсемейство (Gcn5-related N-acetytransferases), которое включает белки, участвующие или связанные с инициацией транскипции (Gcn5 и PCAF), элонгацией (Elp3), депозицией гистонов и теломерным молчанием (Hat1). Семейство p300/CBP HAT представлено высоко родственными p300 и CBP белками, которые обладают общими гомологичными последовательностями с GNATs. HAT активность p300 и CBP необходима для их роли в трансактивации, они ассоциируют с др. acetyltransferases, указывая тем самым, что множественные HAT м. б. привлечены к кооперативному действию во время активации генов.

Семейство MYST HATs включает членов MOZ (онкоген человека), Ybf2/Sas3, Sas2 и Tip60. Один тип транслокаций, ассоциированный с острой миэлоидной лейкемией, сливает MOZ in-frame с CBP acetyltransferase; возникающий leukemogenesis является следствием аберрантого ацетилирования хроматина. Гомологом MOZ у дрожжей является Sas3, каталитическая субъединица нуклеосомного специфичного для Н3 HAT комплекса, NuA3. предполагается, что этот комплекс участвует в транскрипционной элонгации и репликации и в silencing дрожжевых локусов HM типов спаривания. В отличие от SAGA, комплекс NuA3 не рекрутируется дрожжевыми промоторами с помощью кислых активаторов. Интересно, что нуклеосомы, задерживающие транскрипционную элонгацию, м. преодолеть этот барьер с помощью РНК полимеразы и ацетилирования нуклеосом с помощью Elp3-зависимого elongator или Sas3-зависимого NuA3 комплекса.

Важная дрожжевая Esa1 acetyltransferase является членом семейства MYST, которое преимущественно модифицирует гистоны H4 и H2A внутри NuA4 HAT комплекса. Esa1 и Gcn5 участвуют в регуляции гена PHO5, который кодирует кислую фосфатазу, вызывая распространенное ацетилирование области в 4.25 kb вокруг PHO5 гена, что ведет к открытию хроматина промотора. Хотя этому ацетилированию противостоит паттерн распространенного деацетилирования, предоставление этих HATs промотору делает возможным временное и локализованное увеличиение ацильных групп, достаточное для стимуляции транскрипции. Esa1 является гомологом Drosophila MOF белка, который катализирует ацетилирование лизина 16 H4 на X хромосоме самцов и последующее двухкратное увеличение транскрипции (дозовая компенсация). Комплекс NuA4 содержит ряд компонентов, найденных также в комплексе Tip60 человека, который функционирует в ответ на повреждение ДНК и регуляции апоптоза.Наконец, член MYST семейства HBO1 является первой HAT, ассоциированной с белковым комплексом, который связывается с ДНК в месте репликации, указывая тем самым на роль ацетилирования во многих аспектах метаболизма хроматина.

Др. acetyltransferases сгруппированы как базовые транскрипционные факторы, такие как TAFII250 компонент комплекса TFIID или как ядерные кофакторы гормональных рецепторов, такие как ACTR и SRC1. Многие HATs модифицируют др. транскрипционные факторы, такие как супрессор опухолей р53 и базовые транскрипционные факторы TFIIE и TFIIF.

Модификация гистоновых хвостов ацетилированием облегчает доступ транскрипционным факторам к ДНК благодаря структурным изменениям в нуклеосомах или в расположении нуклеосом. Ацетилированные гистоны специфически распознаются др. белками. Bromodomain, обнаруженный в транскрипционных факторах и HATs таких как TAFII250, PCAF и GCN5 является белковым доменом, который позволяет преимущественно распознавать хвосты гистонов, когда они ацетилированы по определенным лизиновым остаткам (Рис. 1)

(Рис.1.) | A model for the generation of transcriptionally active и inactive chromatin domains by post-translational histone modification.

Сходным образом, др.модификации гистонов являются сайтами связывания др. специализированных белковых доменов, это согласуется с гипотезой, что паттерны ковалентных гистоновых модификаций формируют платформы, распознаваемые др. белками и используемые для трансдукции нижестоящих событий. Предполагается, что ацетилирование гистонов м. предшествовать использованию АТФ-зависимых хроматин-ремоделирующих активностей во время активации транскрипции. Gcn5 м. участовать в стабилизации связывания SWI/SNFс промотором и это взаимодействие, по-видимому, обеспечивается бромодоменом Gcn5. Более того, привлечение Gcn5 и ацетилирование гистонов предшествуют рекрутированию комплекса SWI/SNF во время активации промотора interferon-?, а трансактивация с помощью RAR/RXR ядерных рецепторов использует ацетилирование гистонов предже, чем начнет дейстовать SWI/SNF человека.

HDACs

Идентифицировано большое число histone deacetylases (HDACs), многие из которых действуют как корепрессоры транскрипции. Дрожжевые HDACs Rpd3 и Hda1 рекрутируются с помощью репрессорных белков в промоторы, вызывая локальное деацетилирование хроматина. Специализированные регионы хроматина, такие как теломеры, центромеры и молчащие локусы типос спаривания у дрожжей, транскрипционно неактивны и формируют гипоацетилированные подобные гетерохроматину домены. Ингибирование активности HDAC и инактивирование мест гипоацетилирования в гистоне H4 вызывает разрушение таких высоко конденсированных (гетерохроматических) областей. У дрожжей формирование гетерохроматина обеспечивается Sir2, Sir3 и Sir4 silencing белками. Установлено, что Sir2 обладает NAD-зависимой HDAC активностью и, возможно, NAD-зависимой histone-ribosylation активностью. Деацетилирование лизина 16 H4, по-видимому, важно для взаимодействия Sir3 и Sir4 белков и последующего распространения гетерохроматина.

Histone phosphorylation

Фосфорилирование серина 10 гистона H3 коррелирует с активацией генов в клетках млекопитающих и с индукцией транскрипции во время хит-шоковой реакции у Drosophila. Покоящиеся фибробасты, обработанные epidermal growth factor, быстро фосфорилируются по серину 10, что совпадает с индукцией раннего ответа генов, таких как c-fos. Это фосфорилирование катализируется с помощью Rsk-2 kinase, а клетки от пациентов с Rsk-2-дефицитом (Coffin-Lowry Syndrome) не подвергаются фосфорилированию по серину 10 или индукции c-fos в ответ на EGF.

Добавление негативно заряженных фосфатных групп в хвосты гистонов нейтрализует их базовый заряд и снижает их сродство к ДНК. Более того, некоторые acetyltransferases обладают повышенной HAT активностью на серин 10-фосфорилированном субстраете, а мутации серина 10 снижают активацию регулируемых Gcn5 генов. Т.обр., фосфорилирование м. участвовать в активации транскрипции, стимулируя HAT активность того же самого гистонового хвоста . Так, фосфоацетилирование гистона H3 нуклеосом, ассоциированных с c-fos- и c-jun, влияет на их активацию.

Фосфорилирование H2A коррелирует с кондесацией митотических хромосом и снова serine 10 играет ключевую роль. Мутация serine 10 в Tetrahymena гистонах обусловливает аномальную конденсацию хромосм и неправильное разделение хромосом в анафазе. Киназа Ipl1/aurora у дрожжей и нематод и NIMA киназа у Aspergillus nidulans регулируют фосфорилирование H3 serine 10. Нормальная экспрессия обоих энзимов коррелирует с митозами и они м. прямо модифицировать серин 10 гистона Н3. Нарушение регуляции Ipl1 или NIMA ведет к нарушению конденсации хромосом или сегрегации. Предполагается, что протеин фосфатаза Glc7/PP1 дефосфорилирует H3 после митоза.

Фосфорилирование H3 происходит после активации сигнального пути в ответ на повреждение ДНК. Напр., законсервированный мотив (ASQE, in the single-letter amino-acid code) , обнаруживаемый на С-конце дрожжевого H2A и варианта H2A млекопитающих, H2A.X , быстро фосфорилируется в ответ на действие ДНК-повреждаюещего агента. Идентифицирован серин 139 как место для такой модификации, его фосфорилирование в ответ на поврежение зависит от phosphatidylinositol-3-OH киназы Mec1у дрожжей. Mec1-зависимое фосфорилирование серина 139, по-видимому, необходимо для эффективной негомологичной end-joining репарации ДНК.

Histone methylation

Гистон H3 аргинин-специфичная histone methyltransferase (HMT) CARM1 взаимодействует и кооперирует с steroid-hormone-receptor coactivator GRIP-1 при активации транскрипции. Было установлено, что в гистонах преимущественно метилируются в H3 лизины 4, 9 и 27, а в H4 лизин 20. Модифицированные лизины обладают способностью быть mono-, di- или tri- метилироваными.

Гетерохроматин, обогащенный человеческим SUV39H1, мышиным Suv39h1 и дрожжевым Clr4 белками, обнаруживает метилированный лизин 9 гистона H3. Избыточная экспрессия SUV39H1 индуцирует эктопический гетерохроматин в эухроматине. Это уазывает на то, что метилирование H3 lysine 9 м. генерировать хроматиновую архитектуру, с которой предпочитают связываться др. специфичные для гетерохроматина белки. Члены семейства SUV39H1 являются гомологами ассоциированных с хроматином белков Drosophila SU(VAR)3-9 и Schizosaccharomyces pombe Clr4, которые являются супрессорами position-effect variegation. Все три белка являются членами SET-доменового семейства белков. Гетрохроматиновый белок HP1 колокализуется с SUV39H1 в гетерохроматине, где он обеспечивает silencing генов. HP1 и гомолог S. pombe Swi6 специфически связываются с высоким сродством с H3. который метилирован по лизину 9 с помощью семейства SUV39H HMTs ( Рис.1). Специфичность такого распознавания подтверждается тем фактом, что метилированный H3 лизин 4 не связывается с HP1. Эволюционно законсервированные chromodomain области HP1 обеспечивают взаимодействие с methyl lysine 9. У S. pombe, метилазная активность Clr4 необходима для рекрутирования Swi6 , обеспечивающего молчание гетерохроматина и транскрипцинное молчание. Метилирование лизина 9 взаимодействует с фосфорилированием соседнего серина 10 с помощью Ipl1/aurora киназы, которое ингибировано до ацетилирования лизина 9. Т.обр., немодифицированные хвосты м. подвергаться SUV39H1-опосредованному метилированию и затем распространению гетерохроматина.

Кроме того гистоновые хвосты м. подвергаиться FLA-рибозилированию и ubiquination. Напр., С-концы гистонов H2B убиквитинируются у дрожжей Rad6-зависимым способом. Потеря сайта ubiquination ведет к дефектам митозов и мейоза. Транаскрипционный фактор TAFII250, histone acetyltransferas модифицирует линкерный гистон H1 с помощью monoubiquitination, и эта модификация необходима для полной активации транскрипционного фактора Dorsal.

Хроматин состоит из нуклеосом, которые сами состоят из 145–147 пар оснований ДНК, накрученных вокруг октамерного стержня, содержащего по две молекулы каждого из гистонов H2A, H2B, H3 и H4 (Fig. 1). Линкерный гистон, H1, стабилизирует ансамбль октамерного сердечника в структуру высшего порядка (Рис.1.) . Каждый стержневой гистон содержит С-терминальный, очень спирализованный глобулярный домен, в который вовлечено около 75% аминокислотного содержимого и который формирует нижнюю часть стержня нуклеосомной частицы. Остальная N-терминальная часть стержневых гистоновых белков содержит гибкую и высоко щелочную хвостовую область, которая сильно законсервирована у разных видов и является местом разного рода пост-трансляционных модификаций, включая methylation, ADP-ribosylation, phosphorylation, ubiquitylation и acetylation.

Наиболее изучено ацетилирование гистонов. В отсутствие модификации щелочные гистоновые хвосты тесно ассоциируют с кислой основой ДНК, что закрывает доступ к ДНК активаторам транскрипции. Если происходит ацетилирование лизина, то общий заряд N-терминального хвоста смягчается и тем самым ослабляется ассоциация гистоновых хвастов с ДНК и, возможно, меняется также конформация самой стержневой нуклеосомной частицы. что облегчает доступ транскрипционным факторам. Напротив, деацетилирование гистонов усиливает ассоциацию гистоновых хвостов с ДНК, приводя к репрессии транскрипции. Установлено также, что ацетилирование гистонов увеличивает α-спиральное содержимое гистоновых хвостов нуклеосомы, что м. влиять на конформационное состояние хроматина.

Однако ацетилирование гистонов, как оказалось, не оказывает ожидаемого основного ингибирующего эффекта на взаимодействия гистонов с ДНК и стимулирующего эффекта, обеспечивающего доступ транскрипционным факторам. Bryan Turner первым предположил, что ацетилирование гистоновых хвостов обеспечивает им эпигенетические маркеры, с помощью которых уровень активности генов м. поддерживаться от одного клеточного поколения к другому. Strahl и Allis продвинули эту гипотезу на шаг далее, предположив, что разные паттерны модификации гистонов (результат acetylation, phosphorylation, methylation и др. пост-трансляционных модификаций) действуют последовательно или в комбинации для формирования 'histone code', который считывается с помощью др. белков, чтобы вызвать определенные нижестоящие транскрипционные события.

Большинство пост-трансляционных модификаций гистонов обеспечивается белками, которые первоначально были описаны как ко-активаторы или ко-репрессоры транскрипции. Сначала полагали, что ко-активаторы образуют мостики синергичных коммуникаций между RNA polymerase II, общей транскрипционной кухней (machinery) (куда входят TFIID содержащие TATA-binding protein (TBP) и ассоциированные факторы (TAFs), а также др. TFII компоненты) и сиквенс-специфическими ДНК-связывающими транскрипционными активаторами. Действительно, известно множество ко-активаторов потенцирующих транскрипцию путем модификации гистоновых хвостов. Напр., дрожжевой Gcn5 белок, компонент предполагаемого адапторного комплекса, который взаимодействует функционально и физически с вышестоящими ДНК-связывающими белками и с общим транскрипционным фактором TBP. Gcn5, как было показано позднее, является каталитической субъединицей двух in vivo histone acetyltransferase (HAT) комплексов дрожжей, Ada (Ada-содержащий HAT комплекс) и SAGA (Spt–Ada–Gcn5-acetyltransferase). Аналогично, лиганд-связывающие домены NUCLEAR HORMONE RECEPTOR COREPRESSORS обеспечивают репресию транскрипции путем прямого привлечения N-CoR (nuclear receptor corepressor) и очень близкого к нему SMRT (silencing mediator of retinoid X receptor и thyroid receptor) белка. Эти белки рекрутируют гистоновые deacetylases (HDACs) 1 и 2 репрессии транскрипции.

Большинство, если не все, эти хроматин-регулирующие активности действуют через большой гетеромерный протеиновый комплекс, который включает белковые субъединицы. содержащие энзимные и не-энзимные белковые модули (Рис. 2). Большинство из этих белковых модулей содержит области, которые обнаруживают законсервированные последовательности, общие с др. белками регуляторами транскрипции, и некоторые из этих законсервированных областей обладают определенными функциональными активностями

(Табл.1) | Protein modules in chromatin regulation

(Рис.2.) | Chromatin-regulatory proteins и their associated modules.

В обзоре автор уделяет основное внимание модулям, регулирующим хроматин, обеспечивающим ацетилирование гистонов для активации транскрипции, метилированию гистонов для сборки HETEROCHROMATIN и транскрипционному молчанию (silencing).

Histone acetylation и gene activation

Был клонирован HAT (Histon AcetylTransferese) энзим Tetrahymena, гомолог ранее идентифицированного Gcn5 транскрипционного co-activator/adaptor дрожжей. Функциональная характеристика Gcn5 мутантов выявила прямую корреляцию между способностью белка ацетилировать гистоны и его способностью активировать транскрипцию. Затем были открыты многочисленные HATs, такие как глобальный регулятор транскрипции, CREB (cyclic AMP response element binding protein)-связывающий белок (CBP)/p300 (a 300-kDa protein homologous to CBP), и TAF_II250 TBP-associated factor of the TFIID генеральный комплекс транскрипционных факторов.

Почти параллельно с открытием HATs было идентифицировано несколько HDAC энзимов, чья активность коррелировала с репрессией транскрипции.Было установлено, что BROMODOMAIN , который обычно обнаруживается у белков, регулирующих транскрипцию, с разными связанными с транскрипцией функциями (и, в частности, обнаружен у многих HATs), обладает сродством к гистонам, которые имеют acetyl-lysine.

Histone acetyltransferases.

Белки, содержащие HAT модули распадаются на несколько различных семейств.Обнаружено высокое сходство последовательностей внутри этих семейств, но незначительное сходство между семействами. HAT семейства включают Gcn5/PCAF (p300/CBP-associated factor), CBP/p300, TAF_II250/TAF_II130, и steroid-receptor co-activator (SRC) семейства, помимо прочих (Табл. 2). Размеры HAT модуля различаются у разных семейств, а сами HAT модули появляются в контексте др. законсервированных белковых модулей (Рис.2.) Более того, разные HAT семейства, по-видимому, выполняют определенные биологические активности. Напр., Gcn5/PCAF (p300/CBP-associated factor) HAT семейство - это ко-активаторы для субнабора генов, тогда как члены CBP/p300 HAT семейства являются более общими активаторами экспрессии генов. Напротив, некоторые члены MYST (MOZ, YBF2/SAS3, SAS2, Tip60) семейства HATs участвуют в silencing. Наконец, разные HAT семейства обладают различной определенной специфичностью к гистоновому субстрату. Напр., рекомбинантные члены Gcn5/PCAF семейства преимущественно ацетилируют lysine (Lys) 14 в гистоне H3, тогда как члены семейства MYST обнаруживают предпочтение к некоторым лизинам гистона H4. Однако член семейства MYST, Sas3, отклоняется от этого общего правила. Напротив, CBP/p300 HAT семейство более разнородно. Некоторые HATs, включая CBP/p300 и PCAF, обладают внутренне присущей ацетилтрансферазной активностью транскрипционных факторов и, во многих случаях, ацетилирование усиливает ДНК-связывающее сродство затрагиваемых белков.

(Табл.2) | HAT families и their transcription-related functions

Несмотря на различия между различными HAT семействами, имеется и нечто общее. Во-первых, все HAT белки, которые были охарактеризованы in vivo ассоциируют с большими мультипротеиновыми комплексами. Напр., Gcn5 zskztncz частью, по крайней мере, двух мультипротеиновых комплексов, Ada и SAGA, а Esa1, член MYST семейства, является каталитической субъединицей специфичного для гистона H4 NuA4 (nucleosome acetyltransferase of histone H4) HAT комплекса. Во-вторых, хотя рекомбинантные белки могут ацетилировать свободные гистоны, нуклеосомное ацетилирование происходит только в контексте in vivo HAT комплексов, и субстратная специфичность модулируется в контексте этих комплексов. Напр., рекомбинантный Gcn5 преимущественно ацетилирует Lys14 гистона H3, но он м. также ацетилировать (в меньшей степени) Lys8 и Lys16 гистона H4. Однако, в отношении Ada и SAGA комплексов, число сайтов, которые ацетилируются на нуклеосомном H3 расщирено, и гистон H2B также является субстратом.

Сравнение HAT доменов Gcn5/PCAF семейства, MYST семейства (напр., Esa1) и nucleosome-deposition-related HAT, HAT1, выявило структурную гомологию в центральном стержневом домене, который важен для связывания и катализа acetyl-coenzyme-A (CoA) кофактора (Рис. 3). В общем же, N- и С-терминальные области этого стержневого домена обнаруживают структурную дивергенцию. Однако, несмотря на это три HAT белка гомологичны своими α-helix–loop областями, расположенными непосредственно N-терминальнее стержневого домена и α-helix–loop областями непосредственно С-терминальнее стрежневого домена, указывая тем самым на одинаковый способ связывания гистонового субстрата. Четвертичная структура Tetrahymena Gcn5, в комплексе с CoA и гистоновым H3 пептидом, показывает, что эти структурно законсервированные области являются важными для связывания с гистоновым субстратом. Так, 11-аминокислотный пептид гистона H3 (центрированный вокруг Lys14 гистона H3) принимает случайно скрученную структуру и связывается с выраженным белковым расщепом (cleft) Gcn5 белка, выше стержневого домена, и фланкируется на противоложных сайтах с помощью N- и C-терминальных сегментов белка (Рис.3b). Следовательно, стержневая гистон-связывающая складка и в др. более дивергентных HAT модулях м.б. структурно законсервированной, тогда как дивергентные последовательности внутри складки м.б. обусловлены специфичностью связывания гистонового субстрата.

(Рис.3.) | Overall structure of HAT domain module.

Детальный анализ взаимодействий между HAT модулем Gcn5 и пептидом гистона H3 показал, что большинство из этих взаимодействий использует стержневой пептид гистона H3, только с 4 остатками, участвующими в sequence-discriminatory контактах. Следовательно, д.б. и др. участники, отвечающие за специфичность к гистоновому субстрату HAT модулей.

Bromodomains.

Bromodomain - область примерно в 110 -аминокислот, которая законсервирована у эукариот и обычно обнаруживается у белков, регулирующих транскрипцию (Табл.1). Эти домены обнаруживаются обычно по одному на белок, но иногда их два рядом.

Bromodomains часто обнаруживаются в контексте белков, которые содержат и др. законсервированные домены, особенно у энзимных HATs и хроматин-ремодулирующих белков. Напр., Gcn5/PCAF, p300/CBP и TAF_II250 HAT семейства содержат bromodomains. Более того, BRG1, Swi2 и Sth1, которые являются каталитическими субъединицами АТФ-зависимых хроматин-ремодулирующих комплексов, содержат по одиночному bromodomain. Делеция bromodomains у Gcn5 или p300 комплексов ведет к слабым нарушениям нуклеосомного ацетилирования и регуляции транскрипции. В случае Gcn5,комплексы обнаруживают дефекты в регуляции транскрипции, сходные с таковыми у Gcn5 HAT-дефектных мутаций. Более того, делеция bromodomains у Sth1 или Bdf1 гомологов TAF_II250 нарушает их функцию. Следовательно, bromodomains м. выполнять важную транскрипционную функцию, возможно скоррелированную с HAT активностью.

Показано. что bromodomain Gcn5 взаимодействует in vitro с N-концом гистона H4. Как и предполагалось, bromodomain содержит 4 α-спирали, обозначаемые Z, A, B и C (Рис. 4), расположенные антипараллельно для образования пучка из 4-х спиралей с левосторонним закручмванием. Эта структурная организация помещает ZA и BC петли на одном конце молекулы, а AB петлю и N- и C-терминальные концы на противоположном конце молекулы. ZA и BC петли принимают определенную структуру, а вместе образуют гидрофобный карман на конце 4-спирального пучка, оппозитно N- и C-концов молекулы (Рис.4b).

(Рис.4.) | Structure of the bromodomain module.

Благодаря присутствию bromodomains в семействе GCN5/PCAF HAT белков, которые выбирают лизиновые остатки для ацетилирования, удалось протестировать гипотезу, согласно которой bromodomain of PCAF взаимодействует с лизином и/или acetyl-lysine. NMR titration эксперименты выявили, что PCAF bromodomain на самом деле взаимодействует с пептидом в 13 аминокислот гистона H4, который ацетилируется по Lys8. Более того, установлено, что только ограниченное количество белковых остатков движется для взаимодействия с пептидом и что это движение зависит от ацетилирования лизина в пептиде-мишени. Остатки bromodomain, которые перемещаются для связывания ацетилированного по лизину пептида, были локализованы вблизи годрофобного кармана между ZA и BC петлями (Рис. 4b). Каждый из этих остатков, выстилающих гидрофибный карман bromodomain, высоко законсервирован в bromodomains. Показано, что bromodomain м. функционировать как acetyl-lysine-распознающий модуль; это подтверждается структурным и функциональным анализом двойного bromodomain у TAF_II250. Полностью ацетилированный пептид связывается с двойным bromodomain со stoichiometry 1:1, и с повышенным сродством (константа диссоциации 1.4 μM) если более одного ацетилированного пептида гистона H4 (константа диссоциации 39 μM). Структурные и функциональные данные по bromodomains PCAF и TAF_II250 указывают на то, что bromodomain является acetyl-lysine-связывающим модулем и на то. что это свойство bromodomains имеет важное функциональное значение.

Gcn5 bromodomain, связывает хвостовой пептид H4 (остатки 15–29), в котором ацетилируется Lys16 (Рис.4а). Остатки, содержащие acetyl-lysine происходят исключительно из ZA и BC петель bromodomain, а структура указывает на то, что электростатическая среда acetyl-lysine-связывающего кармана будет непригодной для связывания не-ацетилированного лизинового остатка. Неожиданным свойством этой структуры являются лишь 4 остатка из 15 пептида гистона H4, возможно отражающие врожденную слабую субстратную специфичность с помощью изолированного bromodomain. Это позволяет предполагать связь между HAT и bromodomain модулями.

Kinases.

Установлено, что фосфорилирование гистона H3 в c-fos- и c-jun-ассоциированных нуклеосомах коррелирует с активацией генов. Более того, фосфорилирование и ацетилирование происходит в одном и том же гистоновом хвосте, указывая на функциональную связь между двумя модификациями гистонов. Установлено, что фосфорилирование H3 коррелирует также с индукцией транскрипции локусов теплового шока.

Выявлена прямая функциональная связь между фосфорилированием серина 10 и ацетилированием Lys14 гистона H3. In vitro ацетилирование Lys14 усиливается в 5-10 раз, когда гистоновый хвост пре-фосфорилирован по Ser10. Этот эффект фосфорилирования обнаруживается у Gcn5/PCAF и CBP/p300 семейств HATs, но не у Esa1 члена MYST HAT семейства. Стимуляция in vivo клеток млекопитающих с помощью epidermal growth factor (EGF) вызывает быстрое и последовательное фосфорилирование и ацетилирование гистона H3, и эти модифицированные гистоны преимущественно ассоциируют с EGF-активированным c-fos промотором. Gcn5 мутация, разрушающая эффект фосфорилирования, как и мутации гистона H3 Ser10 снижают активность того же самого набора Gcn5-зависимых промоторов. Следовательно, транскрипционная активация некоторых Gcn5-зависимых генов нуждается в фосфорилировании гистона H3 по Ser10 перед ацетилированием Lys14.

Фосфорилирование H3 по Ser10 с помощью IPL1/AURORA KINASE также коррелирует с конденсацией хромосом и собственно с трансмиссией хромосом во время митозов.

В свете того как HAT, bromodomain и kinase protein модули участвуют в зависимой от ацетилирования гистонов активации транскрипции, м.б. предложена модель того, как м. координироваться активности этих модулей (Рис. 5). Эта координация м.б. сходной с типичным путем передачи kinase/phosphatase сигнала, в котором каскад событий ведет к активации транскрипции. Согласно одной модели сиквенс-специфические ДНК-связывающие активаторы в свою очередь рекрутируют гистоновые киназы для фосфорилирования Ser10 гистона H3. Комплекс HAT м.б. также рекрутирован для ацетилирования самих активаторов или др. сайтов на гистонах. Gcn5 HAT комплекс затем рекрутируется промотором благодаря комбинации взаимодействий между Gcn5 bromodomain с acetyl-lysine (или transcriptional activator или гистоновым хвостом скорее, чем гистоном отличным от H3), и Gcn5 HAT доменом и phosphoserine 10. Фосфорилирование Ser10 гистона H3 затем способствует ацетилированию tLys14 гистона H3. Возможно, что bromodomain Gcn5 — или др. белка — иакже облегчает высвобождение acetyl-lysine продукта из реакции ацетилирования Gcn5. Дважды модифицированный хвост H3 мю затем обеспечивать перестройку хроматина, рекрутируя RNA polymerase II и общую кухню транскрипционных факторов для инициации транскрипции.

(Рис.5.) | Model for cooperation of the HAT, kinase и bromodomain modules for transcriptional activation.

В некоторой точке во время этого каскада событий могут функционировать АТФ-зависимые комплексы ремоделирования нуклеосом, такие как SWI/SNF (switch/sucrose non-fermenting), хотя хронологическая последовательность ремоделирования нуклеосом и модификаций гистоновых хвостов м.б. promoter- и/или cell cycle-зависимой. Показано, что SWI/SNF комплекс необходим для последующего присоединения HAT комплексов, но возможен и обратный порядок митозов, когда хромосомы нуждаются в деконденсации. Интересно, что Swi2 субъединица SWI/SNF комплекса содержит bromodomain, это м. указывать на механизм, с помощью которого ацетилирование гистона м вести к bromodomain-опосредованному рекрутированию комплекса SWI/SNF для ремоделирования хроматина.

Assembly of higher-order chromatin

Одинаково важным для активации генов является молчание генов во время формирования высокого порядка гетерохромтина, а также конденсации и сегрегации хромосом. Молчание -результат образования гетерохроматина, высоко конденсированной формы хроматина в определенных местах, таких как silencer ДНК элементы или TELOMERES , структуры, сохраняющиеся в течение всего клеточного цикла. EUCHROMATIC ДНК содержит большинство структурных генов. Она конденсируется в метафазе и декондесируется во время интерфазы, делая возможной транскрипцию. Известна способность молчания эухроматиновых регионов ДНК при перемещении в juxtaposition к гетерохроматину в результате перестройки хромосом или транспозиции (position-effect variegation, PEV). Молчание эухроматиновых генов обнаруживается также если они помещаются внутрь или рядом с дрожжевыми молчащими MATING TYPE LOCI .

SET domains.

Идентифицирована группа генов Su(var) ('suppressors of variegation'). Субнабор этих генов кодирует ассоциированные с гетерохроматином белки, он включает и Su(var)3-9 семейство белков. Члены этого семейства содержат N-терминальный CHROMODOMAIN и С-терминальный SET (Su(var)3-9, Enhancer of zeste, Trithorax) домен. Хотя HP1 (heterochromatin-associated protein 1), как известно, направляет этот белок в гетерохроматин, роль SET домена неизвестна.

Было показано, что Su(var)3-9 гомолог у человека (SUV39H1) и мыши (Suv39h1) кодирует SET-domain-зависимую гистоновую метилтрансферазу, которая селективно метилирует гистон H3. Метилирование избирательно по Lys9. Хотя SET домен существенен для активности метилтрансферазы, богатые цистеином области, непосредственно фланкирующие SET домен, также необходимы для ее активности. Хотя метилтрансферазная активность обнаруживается и у других SET доменовых белков, которые содержат эти богатые цистеином регионы, она не обнаруживается у белков, не содержащих богатых цистеином регионов. Итак метилтрансферазная активность ограничивается субнабором SET протеиновых модулей.

Было установлено, что метилирование и ацетилирование Lys9 взаимоисключающие. Метилирование Lys9 ингибирует фосфорилирование Ser10, н не ацетилирование Lys14. Так, метилирование Lys9 коррелирует с молчанием генов, тогда как фосфорилирование Ser10 и ацетилирование Lys9 коррелируют с транскрипционной активностью. Однако не все модификации гистонов дивергентны, следовательно, гистоновый код более сложен и одни и те же модификации м. вести как к дивергентным транскрипционным исходам в зависимости от 'modification context.'

Chromodomains.

Интересно, что chromodomain у HP1, кодируемый кроме того супрессором мозаичного эффекта положения(Su(var)205), селективнос связывается с высоким сродством с метилированым Lys9 (но не с метилированным Lys 4) гистона H3. Точковая мутация в chromodomain — нарушающая gene-silencing activity of HP1 — устраняет его способность связывать methyl-lysine. Было установлено, что у S. pombe, метилазная активность Clr4 (S. pombe гомолог Suv39h1) необходима для корректной локализации Swi6 (S. pombe гомолога HP1) на гетерохроматине, и для генного silencing. Наконец, было показано, что in vivo ассоциация гетерохроматина с HP1 теряется первичными фибробластами у Suv39h1 double-null мышей, но восстанавливается после введения SUV39H1 methyltransferase. Было также показано, что метилирование Lys9 гистона H3 с помощью Clr4 и распознавание этой модификации с помощью Swi6 в первую очередь касается молчащих гетерохроматиновых областей. Специфичное для гистона H3 деацетилирование Lys14 с помощью S. pombe гистоновой деацетилазы, Clr3, необходимо для метилирования Lys9 гистона H3. Эти результаты подтверждают модель ступенчатого установления молчания генов гетерохроматина, при этом гистоновая деацетилаза и SET модуль работают кооперативно, чтобы деацетилировать Lys 14 и метилировать Lys9 гистона H3, это ведет к привлечению HP1 (через его chromodomain модуль) в гетерохроматин, чтобы обеспечить молчание генов.

Способность распознавать метилированный лизин не является прирожденным свойстовм chromodomains, т.к. chromodomains из Polycomb (M33), Mi-2 и Suv39h1 не связываются столь тесно с метилированными лизиновыми остатками. Это говорит о том. что хромодоменовые модули, такие как те, что найдены в SET-domain-содержащих белках, м. иметь др. хроматин-регуляторные активности. И действительно, было показано, что хромодомен гистоновой ацетилтрансферазы MYST семейства, MOF (males-absent on the first), взаимодействует специфически с РНК компонентом ассоциированного с хромосомами комплекса, отвечающего за DOSAGE COMPENSATION у Drosophila.

Анализ структуры chromodomain MOD1 (mouse modifier protein 1) выявил компактный глобулярный домен, содержащий N-терминальную three-stranded anti-parallel β-sheet упакованную С-терминальную α-спираль (Рис. 6a). Гидрофобная борозда, предназначенная для связывания метилированного лизина (Рис. 6b), находится на поверхности, расположенной между N-концом спирали и поверхностью β-sheet сети. некоторые гидрофобные остатки, выстилающие эту борозду, законсервированы в HP1 chromodomain, а мутация двух остатков молчание генов, определяемое HP1. Хромодомен MOD1 имеет ту же самую HISTONE FOLD , что и малые гистон-подобные ДНК-связывающие белки, которые участвуют в формировании структуры хроматина у archaebacteria (Sac7d и Sso7d). Значит возможно, что и chromodomain HP1 также м. связывать ДНК в контексте хроматина, хотя распределение поверхностного заряда в хромодомене MOD1 несовместимо со связыванием ДНК.

(Рис.6.) | Structure of the chromodomain module.

HP1 белок кроме того содержит С-терминальный CHROMOSHADOW DOMAIN , который обнаруживает последовательности, гомологичные chromodomain, и существенен для HP1 функции, т.к. укороченный мутантный HP1 без части chromoshadow домена не локализуется ни в гетерохроматине, ни в эухромтине, ни в теломерах. Сhromo-shadow домен обеспечивает взаимодействие с некоторыми транскрипционными регуляторными белками, идентифицирован консенсусный пентапептид в распознающих последовательностях упомянутых выше транскрипционных факторов и некоторых др. потенциальных мишенях. NMR анализ структуры chromoshadow домена HP1 выявил структуру, гомологичную chromodomain; но в отличие от chromodomain, который является мономерным, chromoshadow домен димерный. Следовательно, chromo- и chromoshadow домены, по-видимому, выполняют определенные протеин- и/или гистон-распознающие функции, хотя механизм, с помощью которого эти функции координируются у HP1 для обеспечения gene silencing и/или стабилизации гетерохроматина, еще предстоит выяснить.

Methylation.

Если семейство SU(VAR)3-9 белков обеспечивает формирование молчащего гетерохроматина через метилирование Lys9 гистона H3, то метилирование Lys4 гистона H3 коррелирует с транскрипционно активными ядрами у Tetrahymena. Кроме того, и др.метилтрансферазы м. участвовать в активации генов. Так, CARM-1 (co-activator-associated arginine methyltransferase 1), взаимодействующая с GRIP1/TIF2 nuclear hormone receptor co-activator, обнаруживает гомлогию с arginine methyltransferases и м. селективно метилировать гистон H3. Родственная PRMT1 (protein arginine methyltransferase 1) преимущественно метилирует H4. Мутации, нарушающие метилтрансферазную активность CARM-1, нарушают также ее способность ко-активировать транскрипцию. Следовательно, метилирование гистонов м. б. необходимым и для активирования генов и подобно histone acetyltransferases, разные methyltransferases м. обладать разной гистон-связывающей специфичностью.

Other protein modules that manipulate histones

Некоторые др. законсервированные белковые модули выполняют ферментативные функции. Сюда входит АТФ-зависимый модуль комплекса ремоделирования хроматина, такого как SWI/SNF, который участвует как в активации, так и репресси транскрипции и модуль гистоновой деацетилазы HDACs 1–7, чья активность ассоциирована с репрессией транскрипции. Хотя энзиматическая активность этих модулей охарактеризована, однако их субстрат-специфичность, взаимосвязь их активности с активностью др. chromatin-regulatory модулей, не установлены. NURD (nuclesome remodelling и histone deacetylase) комплекс обладает как АТФ-зависимой ремоделирующей, так и гистон-деацетилазной активностью, последняя м.б. связана с ремоделированием хроматина.

Могут иметь значение и др. белковые модули. Так, большинство транскрипционных регуляторов содержит богатые цистеином цинк-связывающие домены, которые обеспечивают межбелковые взаимодействия. RING и PHD (plant homeodomain) модули обнаружены и среди др. молекул, в основном транскрипционных репрессоров. Некоторые RING finger белки обеспечивают активность E3 ubiquitin ligase и эта активность зависит от самого RING finger. Возможно, RING finger домен м. участвовать в ubiquitylation гистонов. SANT (Swi3, Ada2, N-CoR и TFIIIB B) модуль предполагаемого ДНК-связывающего домена обнаруживается у некоторых белков в транскрипционных co-activator или corepressor комплексах. многие transcriptional-regulatory комплексы включают белки, которые содержат histone-fold модули, для помощи этим комплексам конкурировать с гистоновыми белками за ассоциацию с ДНК. Напр., некоторые ассоциированные белки комплекса TBP-containing TFIID basal transcription factor содержат histone-fold модули.

Остается неясным, как модификации N-терминальных гистоновых хвостов и активность законсервированных транскрипционных регуляторных модулей скоординированы и как такая координация ведет к регуляции хроматина и экспрессии генов. Важно установить таже последовательность многих chromatin-regulatory событий.

A tale of histone modifications

Histone acetylation