Deadenylation-dependent мРНК decay

Принципиальный путь мРНК-деградации у дрожжей и высших эукариот инициируется удалением 3' poly(A) хвоста (Рис.1). Две отдельные deadenylating активности идентифицированы у дрожжей. poly(A)-связывающий белок Pab1-зависимый Pan2/ Pan3 (poly(A) nuclease) комплекс отстригает новоиспеченный poly(A) хвост в ядре перед экспортом, но он м. участовать и в цитоплазматическом деаденилировании. Вторая деаденилирующая активность приписывается двум транскрипционным регуляторам (carbon catabolite repression 4 (Ccr4)/ Ccr4-associated factor (Caf1)). Хотя Ccr4/Caf1 и необходим для оптимальной poly(A) nuclease активности in vivo и in vitro , однако прямл не доказано, что он является компонентом деаденилирующей активности. И Pan2/Pan3 и Ccr4/Caf1 комплексы д.б. разрушены, чтобы повлиять на скорость деаденилирования in vivo, (redundancy).

Удаление Poly(A) запускает быстрое расщепление 5' cap с помощью decapping энзима ( Dcp1). Идентифицировано несколько decapping факторов, включая Dcp2 , Vps16 , Pat1 и Lsm белки (Табл.1) Мутации каждого из генов, кодирующих эти факторы, предупреждают decapping. После decapping тело транскрипта деградируется с помощью 5' exonuclease Xrn1. Имеются 3' exonuclease активности у дрожжей, но они, по-видимому, выполняют лишь минорные функции в нормальном распаде мРНК

(Табл.1) | Factors required for мРНК decapping in yeast

Deadenylation-зависимый распад мРНК важен для регуляции стабильности транскриптов в клетках млекопитающих. Poly(A)-специфическая deadenylating nuclease — первоначально названная DAN, но потом обозначена PARN (poly(A) ribonuclease) — охарактеризована из клеток млекопитающих и ооцитов Xenopus laevis. Последующие ступени распада мРНК лучше изучены у дрожжей. Однако, промежуточные продукты распада decapped мРНК выделены и из клеток печени мышей. Decapping активность, которая м.б. ингибирована с помощью poly(A) хвоста охарактеризована также в экстрактах клеток HeLa. Пока неясно, деградирует ли РНК с деаденилированным телом и decapped с помощью 5' или 3' exonucleases. Хотя у млекопитающих идентифицированы гомологи дрожжевой Xrn1 exoribonuclease, лишь 3' exonuclease активность обнаруживается in vitro.

Poly(A) хвост ингибирует распад мРНК благодаря своему взаимодействию с poly(A)-binding protein ( PABP) (Рис.2). Связав poly(A), PABP взаимодействует со специфической областью инициирующего трансляцию фактора eIF4G, который в свою очередь формирует четвертичный комплекс с cap-связывающим белком eIF4E (Рис. 2). Этот комплекс circularizes мРНК in vitro³⁴, м. способствовать трансляции и м. одновременно стабилизировать мРНКs, перекрывая доступ deadenylating и decapping энзимам. Показано, что доступность 5' cap для deadenylating и decapping активностей м.б. основным детерминантом стабильности мРНК. PABP ингибирует деаденилирование у млекопитающих в cell-free assays и когда избыточно экспрессируется в ооцитах Xenopus, это согласуется с его функцией негативного регулятора деаденилирования. Линии дрожжей с отсутствием гена PAB1 действительно обнаруживают низкий уровень деаденилирования, это подтвержает предположение, что Pab1 м. вность вклад в оптимальное poly(A) укорочение.

(Рис.2.) | The deadenylase as an inhibitor of translation initiation и decapping.

Биохимические исследования показали, что deadenylating nuclease PARN связывается непосредственно с 5' cap структурой на субстрате РНК и that это взаимодействие стимулирует активность deadenylase in vitro и in vivo. Кроме того, как CAP ANALOGUES так и eIF4E мнгибируют PARN in vitro в результате конкуренции за связывание с 5' cap. Интересно, что cap аналоги стимулируют decapping активность, предупреждая связывание PARN и eIF4E. Итак, инициальное событие должно дестабилизировать poly(A)–PABP и cap–eIF4E комплексы, позволяя PARN связываться одновременно как 5' шапочкой, так и the 3' poly(A) хвостом. Это м. ингибировать decapping, даже если разрушен троичный eIF4E, eIF4G и PABP комплекс. После окончания деаденидлования PARN диссоциирует и decapping энзим м. снова распознавать cap. Следовательно, эффективность трансляции мРНК м.б. напрямую связана с распадом мРНК decay, и оба процесса детерминируются взаимодействиями, концентрирующимися на 5' шапочке и 3' poly(A) хвосте.

Translation и мРНК turnover

Если ингибирование инициации трансляции дестабилитзирует мРНКs, то ингибирование трансляционной элонгации, напр., cycloheximide способствует стабилизации мРНК. Вообще взаимодействие факторов инициации с мРНК редуцировано во время трансляционной элонгации или терминации и обеспечивает доступ к компонентам разложения.

Мутации в гене PAB1 у дрожжей ведут к преждевременному decapping мРНКs, очевидно потому что Pab1 необходим для poly(A) tail–cap взаимодействия, которое предупреждает decapping. Мутации в PAT1, DCP1 или Lsm1 , редуцируют decapping, и м. супрессировать летальность делеции pab1 deletion. Белки eIF4E и eIF4G также участвуют в ингибировании распада мРНК, т.к. мутации этих факторов ускоряют деаденилирование и decapping. Взаимодействие рекомбинантного eIF4E с cap м. ингибировать decapping in vitro, очевидно блокируя доступ Dcp1 к cap.

Ингибирование decapping с помощью poly(A) хвоста целиком обеспечивается взаимодействием Pab1 с eIF4F комплексом. A ts аллель eIF4E (cdc33–42), который редуцирует взаимодействие с cap, не вызывает преждевремнного decapping, а лишь более быстрый обмен. Удаление eIF4E с cap путем конкуренции с cap аналогами не устраняет ингибирования decapping с помощью poly(A) хвоста в экстрактах млекопитающих. Dcp1 и eIF4G взаимодействуют (биохимически и генетически), увеличивая возможность того, что eIF4G обеспечивает decapping путем привлечения Dcp1.

**Regulating мРНК decay by cis-acting elements**

Несколько элементов м. регулировать скорость обмена транскриптов, способствуя (destabilizer elements) или ингибируя (stabilizer elements) распад. Наиболее звестен A+U-rich element (ARE), обнаруженный в UNTRANSLATED REGIONS (3' UTRs) некоторых мРНКs, кодирующих цитокины, прото-онкогены и ростовые факторы
(Box 1)

Box 1 | A+U-rich elements и their associated factors

Имеется несколько классов ARE со слегка отличающимися последовательностями, которые характеризуют их способность обоеспечивать быстрое деаденилирование и последующий распад транскрипта. Субнабор AREs внутри определенных мРНКs м. также обеспечивать стабилизацию мРНК в присутствии опредленных стимулов.

Группа ARE-связывающих белков охарактеризована и клонирована, включая AUF1/hnRNPD, huR, TIA-1 и tristetraprolin (Box 1) . Связываение этих факторов с транскриптами, несущими ARE м. вызывать или негативный или позитивный эффект на такие различные процессы как стабильность, трансляция и субклеточная локализация мРНК. ARE, следовательно, м. рассматривать как важный регулятор функции мРНК на разных ступенях жизни транскрипта. Напр., связывание HuR стабилизирует некоторые ARE-содержащие мРНКs in vivo и in vitro. Напротив, связывание некоторых изоформ AUF1 коррелирует с нестабильностью транскриптов в нормальных условиях, но м. усиливать стабильность мРНК при стрессе, напр., хитшоке. Tristetraprolin также способствует распаду ARE-содержащего tumour necrosis factor (TNF)-α и granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) транскрипты. Нокаутные мыши с делецией гена tristetraprolin обнаруживают усиление стбильности TNF-α и GM-CSF мРНКs, и обнаруживают множественные симптомы воспаления, следствие избыточной экспрессии TNF-α.

Неясно как связывание RNA-binding белков нарушает скорость распада мРНК (Рис. 3). Возможно, что ARE–белковые комплексы нарушают взаимодействие между PABP и poly(A), или между eIF4E и the 5' cap, обеспечивая доступ к PARN. Или ARE-связывающие белки м. взаимодейстовать непосредственно с deadenylase, модулируя ее активность. ARE м. также ускорять decapping в отсутствие deadenylation in vitro, указывая тем самым, что они м. стимулировать deadenylation-зависимый обмен на многих ступенях пути распда.

(Рис.3.) | Model for how the A+U-rich element mediates stability и instability.

Sequence элементы также м. стабилизировать мРНКs, ингибируя специфические пути деградации. Напр., транскрипты α-globin содержат богатый цистеином элемент в 3' UTR, который образует ядро формирующегося стабилизирующего α-комплекса, который содержит белки α-комплекса α-CP-1 и α-CP-2. Этот комплекс защищает α-globin мРНК от deadenylation-зависящего распада и endoribonucleolytic расщепления (Box 2)

Box 2 | Endoribonucleolytic decay

α-stability комплекс взаимодействует кооперативно с PABP , так что оба обнаруживают высокое сродство к мРНК. Усиление стабильности poly(A)–PABP комплекса возможно ингибирует деаденилирование.

Cis-действующие жлементы, которые модулируют стабильность транскрптов обнаружены также в 5' UNTRANSLATED REGION (5' UTR) и кодирующей области мРНКs. В некоторых случаях эти элементы действуют совместно с 3' UTR элемнтами, чтобы регулировать распад мРНК decay. Напр., c-fos мРНК содержит как ARE в 3' UTR так и дестабилизирующие последовательности, major protein-coding-region determinant (mCRD) с его кодирующей областью. Комплекс из 5 белков (PABP, PABP-interacting protein (PAIP), AUF1, NS1-associated protein ( NSAP1) и Unr (Upstream of N-ras)) образуют ансамбли на mCRD и способствуют быстрому деаденилированию и распаду мРНК. mCRD нуждается, по крайней мере, в 450 нуклеотидах проксимальнее poly(A) хвоста и нуждается в непрерывной трансляции для своей дестабилизирующей функции. Предложена модель, согласно которой транзит рибосом через mCRD элемент разрушает комплекс и запускает процесс распада. В таком случае, mCRD комплекс м. защищать нетранслируемую c-fos мРНК от быстрого деаденилированием вызванного распада, чему способствует ARE в ее 3' UTR.

What triggers changes in мРНК stability?

Несколько сигнальных путей участвует в регуляции распада специфических мРНКs. Interleukin-2 ( IL2) мРНК, напр., имеет детерминанты стабильности на 5' и 3' UTRs. Эти последовательности действуют в согласии, регулируя стабильность в ответ на различные внеклеточрные стимулы, такие как форболовый эфир, липополисахариды и ионофоры кальция. В нестимулированных Т клетках IL-2 мРНК врожденно нестабильна. Эта нестабильность нуждается в присутствии ARE в 3' UTR. После активации T-cell мРНК стабилизируется с помощью c-Jun amino-terminal kinase (JNK) сигнального пути — JNK-responsive element (JRE) в 5' UTR IL-2 взаимодействует с двумя факторами, nucleolin и YB-1. Хотя связывание обоих белков необходимо для стабилизации IL-2 мРНК, они, по-видимому, не являются непосредственными мишенями для JNK пути,т.к. они связываются с JRE как в нестимулированных, так и активированных Т клетках. Оба, nucleolin и YB-1 обладают RNA-unfolding активностью и возможно ремодулируют РНК, позволяя связывать JNK-активированный стабилизационный фактор.

Напротив, путь JNK не обеспечивает стабилизацию IL-6 или IL-8 мРНКs, которые однако содержат AREs в своих 3' UTRs. Индуцированная цитокинами стабилизация этих транскриптов, по-видимому, нуждается в p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) пути, т.к. постоянная активациякиназ этого пути (напр., MEKK1, MKK6, MK2) воспроизводит стабилизирующий эффект воздействия цитокином. GM-CSF и c-fos мРНКs (с AREs) также стабилизируются с помощью этих активированных киназ. Другая ARE-содержащая мРНК, cox-2, м.б. дестабилизирована с помощью глюкокортикоида dexamethasone, который ингибирует p38 MAPK путь. Следовательно, p38 MAPK путь участвует в общей регуляции ARE-зависимой стабильности мРНК . Однако, повышение уровня внутриклеточного кальция (разными стимулами в разных типах клеток, включая не-иммунные ) стабилизирует ARE-содержащие транскрипты — очевидно в результате нарушения активности или компонентов распада или факторов стабильности. Т.обр., ARE-опосредованная стабилизация мРНК является неспецифичной или для иммунных или interleukin мРНКs.

Nonsense-mediated decay

Имеются строгие доказательства связи между трансляцией и турновером в nonsense-mediated decay (NMD) пути. Этот путь гарантирует, что мРНКs, несущие преждевременнй стоп кодон, элиминируются как матрицы для трансляции. Субстраты для NMD включают мутантные мРНКs, а также некоторые транскрипты дикого типа, содержащие upstream открытую рамку считывания, которая мимикрирует кодоны преждевременной терминации. Стоп кодоны подробно исследованы у дрожжей при трансляционной терминации с быстрым независимым от деаденилирования decapping (Рис. 4). Те же decapping энзимы гидролизуют cap структуры и при зависимом от аденилирования пути распада, но по крайней мере некоторые регуляторные факторы отличны. Напр., мутации с потерей функции в Lsm белках и Pat1 не затрагивают NMD (Табл. 1).

(Рис.4.) | Nonsense-mediated мРНК decay.

Четыре фактора — Upf1, Upf2, Upf3 и Hrp1 — существенны для NMD в дрожжах. Все взаимодействуют с translation-release factor RF3, и участвуют в супрессии нонсенс кодонов (Табл. 1). Предполагается, что надзирающий 'surveillance' комплекс (состоящий из Upf белков) ассоциирует с release факторами при окончании трансляции. После гидролиза peptidyl–tRNA мостика комплекс сканирует нижестоящую часть транскрипта на наличие сигнала, который вызывал преждевременное окончание.

У дрожжей этот сигнал состоит из слабо законсервированного DOWNSTREAM SEQUENCE ELEMENT (DSE). Hrp1, изменчивый HETEROLOGOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN (hnRNP)-подобный фактор, взаимодействует специфически с DSE и Upf1. ts аллель Hrp1 стабилизирует транскрипты, содержащие nonsense и предупреждает связывание Upf1. Возможно, что Hrp1 действует как 'молекулярный тэг (tag)' , который способствует направлению nonsense-содержащих транскриптов на быструю NMD. Когда DSE располагается в нормальных кодирующих последовательностях, то Hrp1–DSE взаимодействие будет нарушено транзитом рибосом. Но если трансляция заканчивается преждевременно, то DSE оказывается в нетранслируемой области и связь с Hrp1 сохраняется. Hrp1 участвует также в poly(A)-site селекции pre-мРНКs в ядре. Итак, Hrp1 м. связываться во время процессинга РНК и экспортироваться в цитоплазму, т.к. связан с транскриптом.

Хотя nonsense-опосредованный распад и происходит у высших организмов, пути его менее охарактеризованы. Некоторые гены (smg-1 - smg-7) у Caenorhabditis elegans are необходимы для NMD, и, если мутантны, то позволяют обычно рецессивным nonsense-аллелям гена unc-54 действовать доминантно путем стабилизации nonsense-содержащей мРНК и позволяя ей синтезировать цитотоксический, укороченный unc-54 белок. Ген smg-2 кодирует фосфопротеин гомологичный Upf1, smg-7 кодирует новый белок, негомологичный дрожжевому, а smg-4 гомолог Upf3 дрожжей.

Человеческий гомолог Upf1 ( UPF1, кодируемый RENT1/HUPF1 геном) имеет сходные ферментативные характеристики и подобно SMG-2 является фосфопротеином. Экспрессия доминантно-негативного UPF1 in vivo нарушает быстрый распад nonsense-содержащих мРНКs (functional conservation). У человека идентифицированы и гомологи Upf2 и Upf3 дрожжей и они скорее всего функционально им эквивалентны. Если UPF2 или UPF3 слит MS2 COAT PROTEIN и экспрессируются вместе in vivo с β-globin мРНК , несущей MS2-связывающие сайты в своей 3' UTR, то они м. способствовать быстрому распаду так, как это происходит при преждевременном стоп-кодоне. Хотя UPF1 является цитоплазматическим и ассоциирует с POLYSOMES , UPF2 локализуется на околоядерной мембране, а UPF3 курсирует между ядром и цитоплазмой. Это указывает на то, что UPF3 м. ассоциировать с формирующимся транскриптом в ядре и оставаться связанным во время экспорта из ядра и вообще взаимодействует с UPF2 на ядерной мембране. Согласно одной из гипотез первый раунд трансляции происходит, когда мРНК еще транслоцируется через ядерную пору. Это м. объяснить неясность, где происходит NMD в ядре или цитоплазме.

Имеются некоторые доказательства DSE-подобных последовательностей (также наз. fail-safe sequences) в клетках млекопитающих, функционирующим подобно дрожжевым DSEs. Предполагается, что маркерный белок откладывается в splice junction во время сплайсинга. Этот маркерный белок д. играть ту же самую роль, что Hrp1 у дрожжей и взаимодействовать с надзирающим комплексом, чтобы запускать NMD. Согласуется с этим то, что UPF3 ассоциирует с spliced мРНК in vivo, но не с unspliced транскриптами. Т.к. UPF3 является челночным белком , то он м. действовать как splicing-зависимый маркер. Идентифицированы и некоторые др. белки, которые взаимодействуют с мРНК splicing-зависимым образом — Y14 , ALY/REF, SRm160 , RNPS1 и DEK. По крайне мере два из них, Y14 и ALY, экспортируются также в цитоплазму. Предполагается, что они маркируют границы между экзонами, так чтобы надзирающая machinery м. определить является ли стоп-кодон bona fide. Ассоциация этих белков д.б. пререквизитом экспорта мРНК .

Идея, что NMD происходит только во время первого раунда трансляции, м. б. верной. occurs only during the first round of translation might provide a clue. Показано, что у дрожжей nuclear-cap-binding комплекс (CBC) м взаимодействовать с eIF4G и способствовать инициации трансляции. CBC экспортируется с мРНК и заменяется в цитоплазме на eIF4F комплекс, который обычно обеспечивает инициацию трансляции. Вообще ядерный CBC обеспечивает первый раунд трансляции, отличая от последующих раундов. UPF2 белок, который содержит две области со слабой гомологией с translation-initiation factor eIF4G внутри своего eIF4A- и eIF3-связывающего домена. Эти домены, по-видимому, функционально значимы и законсервированы у Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe. Предполагается, что для распознавание преждевременного стоп-кодона белок UPF2 смещает eIF4G из translation-initiation комплекс. Это должно приводить к разрушению cap-binding комплекса и позволять decapping энзимам добираться до 5' cap.

Т.к. факторы инициирующие трансляцию участвуют в регуляции стабильности мРНК , то и факторы распада мРНК, по-видимому, влияют на трансляцию. Напр., взаимодействие PARN млекопитающих с 5' cap , по-видимоу, конкурирует с eIF4E связыванием и ингибирует инициацию трансляции. Эта 'invasion of the closed loop' м.б. на самом деле инициальным событием, которое запускает деаденилирование и последующее decapping. Подтверждается это decapping фактором Pat1 у дрожжей, который обнаруживает дефекты инициации трансляции.

ОБОРОТ мРНК

THE CAP-TO-TAIL GUIDE TO mRNA TURNOVER

Links

Deadenylation-dependent мРНК decay

Translation и мРНК turnover

**Regulating мРНК decay by cis-acting elements**

What triggers changes in мРНК stability?

Nonsense-mediated decay