DNA Damage Repair
Cellular Responses to DNA Damage Norbury C.J., Hickson I.D. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. V. 41юЗю 367-401.(2001)
Основными формами повреждений ДНК, возникающих в результате действия эндогенных агентов, являются: (а) гидролитическая depurination, (б) гидролитическое деаминирование цитозинового и 5-метилцитозиновго оснований, (в) образование ковалентных связей с ДНК и (г) оксидативные повреждения оснований и фосфодиэфирных связей ДНК. Подавляющее большинство этих "малых" повреждений репарируется с помощью эксцизионной репарации (base excision repair (BER)).	BASE EXCISION REPAIR (Рис.1.) \| Схема пути эксцизионной репарации оснований Поврежденное основание (А) вырезается с помощью ДНК гликозилазы в результате возникает апуриновый/апиримидиновый сайт. После расщепления апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой путь раздваивается на ветвь одиночных нуклеотидов и ветвть длинных участков. BER путь показан на рис. 1. ДНК гликозилазы, из которых несколько классов распознают аномальные основания ДНК и катализируют гидролитическое расщепление N-glycosyl мостикa, связывающий основание с сахаром. После образования apurinic/apyrimidinic (AP) сайта в большинстве случаев путь BER м. позволить использовать общий набор белков. АР эндонуклеазы и фосфодиэстеразы генерируют одиночные нуклеотидные пробелы, содержащие 3' hydroxyl и 5' фосфат окончания, которые позволяют ДНК полимеразе заполнить пробел. Наконец, ДНК лигаза м. залечить оставшиеся царапины. Имеются и вариации на эту тему. Во-первых, вместо АР эндонуклеазой расщеплениия фосфодиэфирных мостиков 5' в АР сайте м. некоторые гликозилазы удалять поврежденные основаня и расщеплять фосфодиэфирные мостики 3'бдавая в результате АР сайт в результате β-элиминации (т.наз. АР лиаз). В этом случает ненасыщенные фрагменты сахаров слева от 3' сайт в разрыва удаляются с помощью фосфодиэстеразы, создавая необходимый пробел в один нуклеотид. Одним из источныиков этого действия фосфодиэстаразы является вторая активность, осуществляемая АР эндонуклеазой. Вторым вариантом в BER является то, что для ступени полимеризации BER используется пробелы более одного нуклеотида. Это т.наз. "long-patch" путь, приблизительно подвергаются эксцизии 2-10- нуклеотидов и замещаются путем комбинированного действия ДНК полимеразы (обычно Polδ или ε, но возможно Polβ), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), replication factor С (КА-С) и эндонуклеаза, которая расщепляет "flap" структуру (FEN-1). Путь long-patch ? gj-видимому, предоминирует, когда репарация инициируется на oxidized или восстановительном АР сайте, генерируемом Х-лучами или химическими агентами, тогда как путь репарации пробелов в один нуклеотид запускается, если генерируется "регулярный" АР сайт. На этом пути ЧКСС1 белок управляет специфическими взаимодействиями с Polβ и ДНК лигазой III и, следовательно, рекрутируются эти лигазы в места начала репарации. При long-patch BER разрывы очевидно залечиваются ДНК лигазой I. Белковые компоененты пути BER законсервированы структурно и функционально. DNA Glycosylases for Repair of "Inappropriate" DNA Bases Несоответствующие основания? это те, что обычно обнаруживаются в ДНК, такие как урацил, а также нормальные основания в несоответствующем контексте, такие тимидин, возникающий в результате деаминирования 5-мктил цитозина. Урацил возникает в ДНК благодаря деаминированию цитозиновых остатков или включению dUTP во время репликации ДНК. Uracil DNA glycosylase (UDG) вырезает урациловые остатки из ДНК, но не из РНК. Очевидно из-за этого возникает потребность в эффективном распознавании урацила и тимидина в ДНК, которые очень сходны по структуре. UDG имеет малую гибкость в отношении специфичности к субстрату, она ограничивается урацилом и его дериватами, такими как 5' fluorouracil. Благодаря форме кармана активного сайта мишень урациловый нуклеотид м. адоптировать неспиральную конформацию.Этот механизм "nucleotide flipping" законсервирован в отношении действия нескольких BER энзимов. Клетки человека содердат др. UDG активность, обозначаемую hSMUG1, которая предпочитает ssДНК содержащие урациловые остатки в качестве субстрата. LYR у большинства организмов, включая и человека, содержит цитозиновые остатки, метилированные в положении С⁵. После деаминирования 5-метилцитозина образуется тимин, давая неправильную пару G:Т. Для исправления этого дефекта репаративная система должна исправить ее в G:С, а тимидиновый остаток в А:Т парах не должне служить в качестве субстрата. Гликозилаза, отвечающая за репарацию неправильной пары G:Т, является тимидин ДНК гликозилазой. Однако она неспецифична для тимидиновых остатков, т.к. распознает также урацил, который неправильно спаривается с гуанином. Эта "урацил гликозилазная" активность законсервирована у организмов, которые не метилируют цитозиновые остатки. Glycosylases for Repair of Oxidized DNA Bases Окисление оснований в клеточной ДНК м. возникать в результате воздействия ионизирующей радиации, радиомиметических хим. в-в и внутриклеточных видов реактивного кислорода (reactive oxygen species (ROS)). У E.coli окисленные пурины вырезаются с помощью FPG белка(известного так же как MutM и FAPY glycosylase). FPG удаляет производные открытого имидазольного кольца, такие как FAPY-гуанин и FAPY-аденин и 7,8-duhydro-8 oxoguanine (8-OG) (Рис. 2). (Рис.2.) \| Примеры структур окисленных пуриновых субстратов для FPG/Ogg1 класса энзимов. 8-OG м. неправильно спариваться с А и давать GС->TA трансверсионные мутации. Мутанты fgp обнаруживают повышенную частоту GС->TA мутаций? что связано с дефектом репарации 8-OG. Дрожжи млекопитающие содержат белки, котрые выполняют роль, аналогичную FPG. S.cerevisiae Ogg1 белок обладает субстратной специфичностью, сходной с таковой у FPG, хотя их первичные последовательности неродственны. Вместо этого Ogg1 обнаруживает сходство последовательностей с E.coli эндонуклеазным (endo)III белком. Гомолог Ogg1 у человека вырезает 8-OG? спаренный с цитозином с помощью flipping 8-OG остатка во внеспиральную конфигурацию. Способность Ogg1 различать 8-OG и гуанин связана с одиночным водородным мостиком между активным сайтом глицинового остатка и 8-OG половиной. 8-OG остатки, который изежали репарации перед репликацией ДНК м. неправильно спариваться с аденином. 8-OG:A неправильная пара является довольно слабым субстратом для Ogg1, особенно, если нужно исключить адениновый остаток как матрицу для репарационного синтеза ДНК. Все клетки, следовательно, экспрессируют энзим, который конвертирует 8-OG:A неправильную пару в 8-OG:C благодаря действию аденин гликозилазы. Ген, кодирующий эту активность у E.coli - mutT. Т.к. клетки противодействуют 8-OG остатку в ДНК через комбинированное действие FPG/Ogg1 и MutY, то fpg mutY двойные мутации обнаруживают чрезвычайно высокую частоту GС->TA мутаций. Белок ЬгеН обнаруживает существнное сходство последовательностей с E.coli endoIII, включая законсервированный helix-hairpin-helix (HhH) мотив и цистеиновый остаток, который создает сайт связывания для железо-серного кластера (4Fe-4S)²⁺ типа. MutY также законсервирован, а его гомологу человека MYH имеет очень сходную субстрат специфичность. Endo III вырезает многочисленные окисленныепродукты пиримидинов. Большинство субстратов возникает в результате реакции ROS в 5,6-двойном мостике и включает цитотоксические повреждения, такие как тимидина и цитозина glycols. Однако, endo III распознает также окрытые кольца, контракции колец и продукты фрагментации колец цитозинового и тимидинового остатков (Рис. 3). (Рис.2.) \| Примеры структур окисленных пиримидиновых субстратов для endo III класса энзимов. Почкующиеся дрожжи экспрессируют два гомолога endo III, Ntg1 и Ntg2, первый не содержит характерного железо-серногокластера. Субстрат специфичность этих двух энзимов сходна, но несмотря на это отличается от таковой endo III. Единственнвй гомолог endo III у человека, hNTH1, обладает основным струтктурным мотивом HhH и Fe-S кластером и имеет сходную субстрат специфичность. Glycosylases for Repair of Alkylated Bases Широкий выбор продуктов для алкилирования оснований представлен на рис. 4. (Рис.4.) \| Примеры структур субстратов для 3-MAG класса энзимов. Эти добавки репарируются с помощью гликозилазы, обозначаемой как 3-methyladeninne DNA glycosylase (3-MAG). Два таких энзима, AlkA и Tag известны у E.coli? первый индуцируется как часть адптивного ответа на аклилирование ДНК. Одиночная активность 3-MAG с широкой субстратной спеифичностью, сходная с AlkA существует у эукариот. 3-MAG эффективно вырезает также 1,N,sup>6-ethenoadenine остатки. Репарируя 3-метиладенин и 1,N,sup>6-ethenoadenine остатки in vivo 3-MAG защищает клетки млекопитающи[ отцитотоксических эффектов определенных алкилирующих агентов. Способность AlkA распознавать как позитивно заряженные, так и большое число ароматических субстратов происходит от присутствия многочисленных ароматических боковых цепей, заполняющих каталитическую щель. Кристаллическая структура AlkA указывает на действие механизма flipping нуклеотидов. Алкилирование в положениеи O⁶ гуанина является высоко мутагенным, т.к. O⁶-алкилгуанин с высокой эффективность дает неправильные спаривания с тимидином, что ведет к GC->AT трансцизионным мутациям. Эти повреждения, которые такеж цитотоксичны, репрарируются с помощью законервированного спецализированног белка, O⁶-алкилгуанинДНК алкилилтрансферазы (O⁶-АТ). Экспрессия ее делает клетки резистентными к цитотоксическим и мутагенным эффектам различных алкилирующих агентов, большинство из которых используется для химиотерапии. AP Endonuclease in BER AP эндонуклеазы противодействуют цитотоксическому и мутагенному потенциалу АР сайтов. Эти повреждения возникают благодаря спонтанному гидролизу N-glycosyl мостика, связывающего основание с фосфодиэфирным остовом, вследствие повреждений ДНК алкилирующими агентами или ROS и благодароя действию ДНК гликозилаз. Имеется два больших семейства АР эндонуклеаз, названных exonuclease (exo) III и endo IV семействами, которые происходят от имени двух АР эндонуклеаз у E.coli . AP помимо эндонуклеазной активности обладают фосфодиэстеразной активность для удаления фрагментированный сахарных остатков, такие как фосфогликолатыБ с 3' концов разрывов нитей, индуцированный оксидантами. Эта активность м. также удалять 3' терминальные группы сдева с помощью АР lyases вследствие β-элиминации в АР сайте. АР лиазная активность является свойством endo III и FPG семейств гликозилаз. Каталитический механизм действия обоих семейств АР эндонуклеаз выявлен с помозью рентгеновской кристаллографии. Гомолог человека exo III, HAP1 (APE/Ref-1), обнаруживает структурное сходство с ДНКазой I. Abasic деоксирибоза лежит во внеспиральной конформации и стабилизирует в НАР1 активный сайт путем взаимодействия со специфическими остатками. Выявлено несколько активных сайт остатков необходимы для реакции гидролиза. Структурные исследования endo IV E.coli выявили, что обе abasic деоксирибоза и ее нуклеотид-партнер flipped out из дуплекса. Структурный и сайт-направленный мутагенез показывает, что НАР1 м координировать различные ступени BER процесса через привлечение межбелковых взаимодействияй. НАР1 взаимодействиет и удаляет гликозилазы, который сврязаны с АР сайтами, сгенерироваными с помощью их действия. Более того, вследствие расщепления фосфодиэфирного остова, НАР1 остается связанным с разорванной ДНК до тех пор, пока взаимодействия с Polβ не инициируют последующую фосфодиэстераза/полимеразную ступень, это помогает объяснить, как BER м.б. столь эффективным и быстрым процессом in vivo. Late Stages in BER Polβ м. катализировать как 5' phosphodiesterase, так и полимеризации ступень в BER. Polβ-децифитные клетки мыши показали. что только фосфодиэстеразное действие Polβ существенно для защиты против MMS. Также как и связываясь с HAP1:DNA комплексом, Polβ осуществляет взаимодействия с XRCC1 белком, который , по-видимому. играет роль остова скорее, чем какую-либо специфическую энзимтическую функцию. XRCC1 рекрутирует затем ДНК лигазу III в сайт готовый к репарации. DNA DOUBLE-STRAND BREAK (DSBs) REPAIR DSBs возникают в дНК клетки разными путями, включая ионизирующю радиацию и хим.радиомиметики, посредством взаимодействия репликационной вилкаи с разрывам одиночной нити на матрице и запрограммировано во время мейоза и во время прерстроек геов иммуноглобулинов. Homologous Recombination У S.cerevisiae гомолог. рекомбинация зависимт от RAD52 эпистаза группы генов, которые включают RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RAD59, MRE11 и XRS2. Rad51 является эукариотическим гомологом E.coli RecA, которая инициирует гомологиную рекомбинацию, катализируя гомологичное спаривание и обмен нитей ДНК. Rad51 имеет существенно сниженную каталитическую скорость по сравнению с RecA. Чтобы компенсировать этот кажущийся недостаток эукариотический Rad51 действует совместено с др. белками. Replication Protein A (RPA) усиливает эффективность реакции обмена нитей ДНК, обеспечиваемой Rad51, но только ели добавляется к реакциям после того как Rad51 создаст характерные нуклеопротеиновые филаменты на ssДНК в которой происходит обмен нитей. Rad52 и Rad55/57 гетеродимер, оба противодействуют ингибирующему воздействию RPA, преимущественно за счет обеспечения обмена Rad51 для RPA на ssДНК. Болеетого, Rad54 м. стимулировать катализируемое Rad51 спаривание гомологичных молекул ДНК in vitro. Rad54 является ДНК-зависимой АТФазой семейства Swi/Snf, чья точная рольнеясна. Идентифицировано несколько родственых Rad55/57 белков млекопитающих, но действуют ли они также как их гомологи, неясно. Два из них, XRCC2 и XRCC3 идентифицированы в клетках хомячков, дефектных по DSB-индуцированной гомологичной рекомбинации. Функции гомологичной рекомбинации являются витальными для репарации DSBs. Предполагается, что Rad52 инициирует репарацию двойных разрывов путем связывания ДНК концов. Это связывание защищает ДНК концы от экзонуклеотической атаки и облегчает соединение конец-в-конец. Rad52 затем помещает Rad51 на ДНК благодаря прямому взаимодействию белок:белок. Эта связующая концы функция, возможно, объясняет, почему Rad52 действует также на пути single-strand annealing (SSA). Возможно также, что Rad52 действует частично конкурируя с Ku DNA end-joining комплексом, чтобы направить репарацию двойных разрывов по пути гомологичной рекомбинации вместо NHEJ пути. Y S. cerevisiae RAD52 является существенной для репарации двойных разрывов и гомологичной рекомбинации. Однако, RAD52-/- мыши жизнеспосодны и фертильны и их клетки не обнаруживают нарушений репарации двойных разрывов. RAD54-/- мыши также жизнеспособны и фертильны, несмотря на клеточные дефекты в репарации поперечных сшивок ДНК. Эти мыши гиперчувствительны е рентгеновскому облучению на эмбриональной, но не вхзрослой стадии. Напротив RAD51-/- мыши погибают во время раннего эмбриогенеза. У дрожжей Rad50/Mre11/Xrs2 комплекс осуществляет нуклеазную активность и участвует в резекции двойных разрывов для создания 3' ssДНК хвоста, необходимого для Rad51, чтобы инициировать обмен нитями. Хотя Rad50 и Mre11 белки хорошо законсервированы, то Xrs2 - нет. днако, белок с ограниченным сходством с Xrs2, наз. NBS1 (nibrin), gj-видимому, функциональный аналог Xrs2. NBS1 белок дефектен при ataxia telangieectasia-like disorder, Nijmegen breakage synd. HR в клетках человека, по-видимому, сложенее, чем в дрожжах. Два белка, которые, по-видимому, играют важную роль в репарации двойных разрывов - BRCA1 и BRCA2 - опухолевые супрессоры. Мышиные фибробласты, дефицитные по BRCA1 или BRCA2 обнаруживают чувствительность к ДНК-повреждающим агентам и excessive хромосомным аберрациям. BRCA1 и BRCA2 взаимодействуют непосредственно др с др и RAD51. Предполагается, что они участвуют в трансдукции сигналов от факторов, которые распознают ДНК повреждения к ДНК репаративной кухне. Single-Strand Annealing (SSA) SSA, подобно HR,является процессом воссоединения двойных разрывов, с использованием гомологии между концами соединяемых последовательностей (Рис. 5). (Рис.5.) \| Схема, представляющая три пути репарации двунитчатых разрывов ДНК. Двунитчатые разрывы ДНК, генерируемые рентгеновским облучением или радиомиметиками, подвергаются процессингу по время или негомологичного соединения концами (NHEJ)или рекомбинация-зависимым путем (справа), возможно при конкуренции между Ku70/Ku80 комплексом и Rad52 за связывание с концами. При NHEJ (слева) Ku комплекс привлекает к участию ДНК-РК_cs и XRCC4/ligase IV гетеродимер для эффективного воссоединения. При гомологичной рекомбинации Rad51 привлекается к участию с помощью Rad52 для обеспечения инвазии нити ДНК интактной сестринской хроматиды или гомологичной хромосомы. При однонитчатом annealing резекции и annealing коротких комплементраных последовательностей предшествует trimming некомплементарных ssLYR хвостов и лигация. Однако SSA отличается от HR по способу достижения. ДНК, чтобы соединиться сначала резецируется для создания ssДНК хвостов. Когда резекция проходит достаточно, чтобы выявить комплементарные последовательности, то две ДНК м. затем прокаливаться (annealed) перед лигацией ДНК. Неизбежно SSA обладает потенциалом для создания делеций между повторяющимися последовательностями. SSA нуждается в Rad52 белке у S.cerevisiae, но не в Rad51? что согласуется с отсутствием потребности в инвазии для ДНК-нити. Роль Rad52 вероятно связана с ДНК концами и затрагивет annealing ДНК. SSA нуждается в Rad50, Mre11, Xrs2 белковом комплексе у S.cerevisiae и в функционально аналогиных белках человека: RAD50, MRE11 и NBS1. Вероятно. что это комплекс участвует в рецекции концов ДНК. После резекции и annealing комплементарыне последовательности ДНК, ssDNA хвосты, м.б. приведены в порядок (Рис. 5). Эта стрижка, очевидно, осуществляется структура-специфичной XPF-ERCC1 эндонуклеазой (Rad1/Rad10 у дрожжей) в клетках человека. Nonhomologous End-Joining (NHEJ) NHEJ процесс, с помощью которого dsДНК концы воссоединяются, даже если имеется мало или нет спаривающихся оснований в месте соединения. Этот путь репарации двойных разрывов уникален для эукариот. Законсервированный набор белков, обозначенных как Ku70, Ku80, DNA ligase IV и XRCC4 у человека необходимы для NHEJ. У позвоночных необходима также каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеин киназы (DNA PK_CS). NHEJ имеет отношение не только к репарации dsДНК разрывов, индуцированных повреждаюещими агентами, но и к процессингу разрывов, возникающих во время перестройки генов иммуноглобулинов. Тяжелые комбинированные иммуно-дефициты у мышей ассоциируют с инактивированием DNA PK_CS. Мыши с целенаправленными разрушениями гена Ku80 обнаруживают чувствительность к ренгеновским лучам, имеют тяжелые комбинированные иммунодефициты и повышенные частоты хромосомных аберраций. Разрушение же генов XRCC4 или ДНК лигазы IV ведет к эмбриональной летальности. Очевидно, что эти белки играют назависимую роль вне пути NHEJ. XRCC4/ligase IV гетеродимерные комплексы рекрутируются к ДНК концам с помощью Ku комплекса. ТРУО линеаризованой плазмидной ДНК м.б. осуществлено в бесклеточных экстрактах. CELL CYCLE CHECKPOINTS ACTIVATED IN RESPONSE TO DNA DAMAGE Неспособность к полной репарации перед репликацией или сегрегацией хромосом м. вести к фиксации мутаций в геноме или к непоправимым разрывам хромосом. Следовательно, геномная интеграция сохраняется частично с помощью механизмов, котрые грантируют задержку клеточного цикла до тех пор, пока повреждения ДНК не будут устранены. Эти, т.наз. checkpoint (контрольно-пропускной пункт, КПП) механизмы м.вести к задержке клеточного цикла в G1, G2 или S фазе. Аналогичные механизмы м. задерживать репликацию ДНК у бактерий. Многие компоненты checkpoint не нужны для хода клеточного цикла per se, но вступают в игру, когда ДНК повреждена или блокировна репликация. Кроме того некоторые checkpoint компоненты связаны с активацией репарации, нуклеотидным метаболизмом, поддержанием теломер или индукцией клеточной гибели. КПП впервые выявлены у radiation-sensitive (rad) мутантов дрожжей, которые неспособны задерживать ход митозов после повреждений ДНК. Искусственная задержка клеточного цикла в этом случае достаточна, чтобы откоррекировать повреждения ДНК. Выявлены пути, связывающие продукты checkpoint генов, и охарактеризованы взаимодействия на биохимическом уровне. Mec1/Rad3/ATM/ATR Activation: A Fundamental Eukaryotic Checkpoint Response to DNA Damage Checkpoint гены функционально связаны с теми, что идентифицированы у дрожжей и в мультиклеточных организмах при анализе мутантов, чувствительных к радиации. Хотя имеются отличия в деталях, но в целом организация КПП законсервирована. (Таблица.) \| Большинство checkpoint детерминантов являются фосфопротеинами и/или протеин киназами. Выдающимися среди них являются члены семейства больших киназ, включая S.cerevisiae Mec1, S.pombe Rad3 и белки человека АТМ и ATR. Эти белки принадлежат семейству фосфоинозитид 3-киназ, но фосфорилируют они скорее блковые субстраты, чем липиды. Каждый активируется в ответ на повреждение ДНК и ряд событий фосфорилирования идентифицирован, они зависит от активации этих киназ. Семейство Mec1/Rad3/ATM/ATR действует на раннем этапе checkpoint пути или как детекторы повреждений ДНК или в тесной ассоциации с такими детекторами. В клетках млекопитающих эти киназы активируются неким специфическим для повреждения способом, АТМ специфична для агентов, индуцирующих DNA, DSB, а ATR , вероятно отвечает за повреждения УФЛ. У дроржжей же члены семейства активируются в ответ на широкий круг DNA структур, включая остановку репликационой вилки. Дополнительные checkpoint компоненты? функционирующие сочетанно с Mec1/Rad3/ATM/ATR киназами, идентифицированы у S. pombe? которые включают "checkpoint Rad" белки Rad1, Rad9Sp, Rad17Sp и Hus1, потеря любого из них вызвает чувствительность к радиаии и checkpoint дефекты, очень сходные с теми, что набоюдаются при отсутствии Rad3. Продукты всех этих геновдействуют на общем пути. Большинство из checkpoint белков обладееи низким, но достоверным сходством с белками, участующими в репликации ДНК. Так, Rad1, Rad9Sp и Hus1 родственны акцессорному белку ДНК полимеразц PCNA, тогда как Rad17Sp родственен субъединице RF-C. Это сходство последовательностей отражает физическую ассоциацию Rad1, Rad9Sp и Hus1 в комплексе, как и их эксивалентов у S.cerevisiae и в клетках человека, тогда как Rad17Sp подобно Rad24 у S.cerevisiae, ассоциирует с субъединицей RF-С на хроматине. Во время репликации ДНК RF-С функционирует, загружая PCNA на хроматин. По аналогии м. предположить, что Rad17Sp загружает Rad1/Rad9Sp/Hus1 комплекс на ДНК в ответ на повреждение ДНК. Т.к. PCNA действует путем связывания репликативной полимеразы с ее матрицей, то Rad1/Rad9Sp/Hus1 м. формировать скользящий хомут с двойной функцией: checkpoint сигнализацией и рекрутированием энзимов репарации ДНК. В клетках человека рКФВ17 локализуется в ядрышке и перераспределяется в нуклеоплазму после облучения УФЛ. Модель checkpoint пути представлена детекторами повреждений, передатчикми сигналов и ингибирующими клеточный цикл эффекторами. Но этот механизм не всегда так прямолинеен. Так, у S/cerevisiae выявляется альтернативный checkpoint путь повреждений ДНК, в котором Rad17Sc, Rad24 и Mec3 служат для активации экзонуклеазы ( вообще самой Rad17Sc). Эта нуклеаза снаыала обрабатывает первичные повреждения способом, который ведет к генерации checkpoint сигнала. Имеются данные, что Rad9Sc действует ниже Мес1. Сходным образом Rhp9/Crb2, аналог Rad9Sc у S.pombe, по-видимому. действует ниже Rad3, а индуцируемое повреждением ДНК Rad3-зависимое фосфорилирование Rad26 независит от всех известных checkpoint белков. предполагается, что некоторые из этих событий форсфорилирования отражают активацию контроля петлей обратной связи скорее, чем передачу checkpoint сигнала. Effectors of Checkpoint Rad Pathway Checkpoint сигналы передаются вниз от Mec1/Rad3/ATM/ATR и др. checkpoint Rad белков и фокусируются на серин/треонин протеин каназах, типичными представителями которых являютсz дрожжевые Chk1 и Rad53/Cds1 и их эксиваленты у позвоночных CHK1 и CDS1/CHK2. Потребность в активации этих киназ и результаты их инактивации отличаются внутри и между видами. Chk1 мутанты являются чувствительными к радиации у S.pombe, но не S.cerevisiae, у которых Cds1-подобная киназа, Rad53, выполняет основную checkpoint сигнальную роль после повреждения ДНК. Напротив, у делящихся дрожжей Cds1 активируется специфически во время S фазы и необходима для задержки S-фазы в ответ на повреждения ДНК, но cds1 мутанты не чувствительны к радиации. Идентифицированы различные механизмы ниже этих Ser/Thr киназ, которые трансдуцируют checkpoint сигналы к эффекторным белкам клеточного цикла. У делящихся дрожжей и в клетках человека ключевая митотическая cyclin-dependet kinase, Cdc2, является принципиальной мишенью на checkpoin пути, активируемом в ответ на повреждения ДНК или ингибирование репликации. Cdc2-cyclin И гетеродимеры действуют как триггеры всех основных событий митоза и ингибирования этой протеин киназы достаточно для предупреждения вступления в митоз. Ингиибрование Cdc2-cyclin И в ответ на активацию checkpoint связано с фосфорилированием Cdc2 субъединицы по ингибирующему остатку Thr14 и/или Tyr15. Фосфорилирование в этих сайтах осуществляется принципиально с помощью Wee1 протеин киназы со вторичными активностями, относящимися к киназе Mik1 и Myt1 у S.pombe и в клетках человека, соотв. Эти ингибирующие клеточный цикл киназы являются противовесом Cdc25 протеин фосфатазе, которая активирует Cdc2 путем удаления фосфата с Tyr15. Прерывание перехода между интерфазой и митозом гарантируется механизмами позитивной обратной связи, посредством которых активная Cdc2 обеспечивает как ингибирование Wee1, так и активирование Cdc25. Во время checkpoint ответа на повреждение ДНК активация Chk1 или Свы1 оказывает противположное влияние. Эти киназы фосфорилируют Cdc25 по Ser216, генерируя сигнал распознавания для 14-3-3 белков, которые секвестрируют Cdc25 в цитоплазме (Рис. 6). (Рис.6.) \| Компоненты G2 checkpoint пути при повреждении ДНК.Сигнал о повреждении ДНК передается посредством checkpoint Rad белков и Chk1 протеин киназы. Ингибирование митотического индуктора Cdc2 осуществляется инактивацией Cdc25 и активацуией Wee1. Протеин киназы показны в прямоугольниках. Для простоты использована номенклатура только делящихся дрожжей. Биологическая активность Wee1 также м. быть усилена с помощью Chk1-опосредованного фосфорилирования, и как Wee1, так и Mik1 стабилизируются Chk1-зависимым способом. Важность этих механизмов, которые конвергируют на Thr14/Tyr15 фосфорилировании Cdc2 подчеркивается checkpoint-дефектными фенотипами, индуцированными у S.pombe и в клетках человека с помощью Cdc2 мутантных белков, неспособных к фосфорилированию по данным сайтам. У S.cerevisiae ингибирование Cdc28, гомолога Cdc2, не является важным свойством checkpoint на повреждение ДНК, оно вместо этого оперирует, блокируя начала митотической анафазы. а также выходи из митоза. Эти эффекты соотв. осуществляются через Chk1-зависимую стабилизацию Pds1 белка слипания сестринских хроматид и Rad53-зависимого подавления Cdc5 протеин киназы. Аналогичные механизмы м. оперировать с др. организмах, но они м. маскироваться с помощью Cdc2 пути, который ведет к аресту на ранних стадиях клеточного цикла. BRCA1 опухолевый супрессор является субстратом для АТМ и СНК2, а BRCA1 мутантные клетки дефектны по индуцированному повреждением ДНК G2 аресту, возможно из-за неспособности их подавлять транскрипцию циклина В. Мутантные формы BRCA1 не имеют сайтов АТМ/СНК2-зависимого фосфорилирования и неспособны ревертировать гиперчувствительность к радиации BRCA1-дефицитных линий клеток? уазывая тем самым, что эти события фосфорилирования участвуют в трансдукции checkpoint сигналов. Выявлена связь между checkpoint ДНК повреждения и поддержанием теломер. Укорочение теломер наблюдается у АТМ-/- и checkpoint rad мутантов. Более того, белок Tel1, который принципиально связан с поддержанием теломер, м. частично компенсировать петерю Мее1. Однако имеется отличие между checkpoint и функцией поддержания checkpoint Rad белков у S.pombe, т.к. последняя функция не нуждается в Chk1 или Cds1. Функция поддержания теломер, следоваетльно, м.б. эволюционным предшественником из которого произошел механизм checkpoint повреждений ДНК. Замедление репликации ДНК в ответ на двойные разрывы ДНК является checkpoint Rad и Rad53/Cds1 зависимым у дрожжей и АТМ зависимым в клетках человека, но эффекторные механизмы в этом случае не ясны. NBS1 фосфорилируется с помощью АТМ м дейстовать ниже в этом пути. Вовлечение NBS1 в checkpoint повреждения S-фазы м.б. вторичным по сравнению с его ролью в репарации ДНК. NBS1, подобно Xrs2? своем аналоге у почкующихся дрожжей, ассоциирован с MRE11 и RAD50 , которые необходимы как для репарации двунитчатых разрывов, так и для поддержания теломер. Damage Tolerance and Cell Cycle Resumption У дрожжей неспособность репарировать повреждения ДНК м. сопровождаться повторным вступлением к клеточный цикл при сохранениии разрывов нитей ДНК. Возобновление клеточного цикла в этих условиях нуждается в Ku70, в отсуствие которого сохранившиеся разрывы подвергаются 5'-3' деградации. Сохранение разрывов ДНК обязательно д.б. связано с супрессией ареста клеточного цикла; ssLYR? генерируемая в отсутствие Ku70 запускает checkpoint сигнал, который не м.б. супрессирован таким способом. Согласуются с этим и мутации Mre11 или Rad50? которые редуцируют степень генерации ssДНК, а также супрессируют постоянный арест, наблюдаемый после повреждения у Ku70 мутанов. У S. pombe клеточный цикл, запускаемый вновь после ареста в ответ на checkpoint повреджения ДНК , нуждается в фосфорилировании Crb2 с помощью Cdc2, но неясно опрерируют ли аналогичные механизмы у более сложных организмов. Cell Cycle Checkpoint Roles of p53 DNA-damage checkpoint у высших эукариот нуждается в дополнительных уровнях сложности, не обнаруживаемых у дрожжей. Тетрамерный транскрипционный фактор и супрессор опухолей р53 является центральным в checkpoint контроле у высших эукариот. Потребность в р53 в индуцированном повреждением ДНК G1 аресте значительна, если не обязательна, за счет привлечения транскрипционой индукции ингибитора циклин-зависимой киназы h21^WAF1 , который связывает и ингибируетG1 циклин-зависимую киназу. Активация р53 в ответ на повреждение ДНК и др. стрессы вызывает комплекс посттрансляционных модификаций р53 и его некгативного модулятора MDM-2, который сам индуцируется с помощью р53 на транскрипционном уровне. MDM-2 направляет р53 на протеолиз с помощью убиквитин/протеосомного пути, а подавление этого пути ведет после повреждения ДНК к накоплению р53. Активация р53 участвует также в ДНК повреждением индуцированном G2 аресте, за счет увеличения экспрессии как 14-3-3δ, который секвестрирует Cdc2-cyclin И гетеродимеры в цитоплазме и р21 ^WAF1, который м. ингибировать Cdc2. Транскрипция генов, кодирующих CDC1 и циклин В, м. б. также репрессирована р53-зависимым способом. Этот р53-зависимый механизм действует рараллельно с checkpoint Rad путем. Клетки, лишенные функционального р53, являются, следовательно, полностью во власти checkpoint Rad белков и ведут к менее сильному G2 аресту в ответ на повреждение. Regulation of p53 Following DNA Damage путь р53 возник сравнительно недавно и обладает преимуществами по сравнению с прежде возникшим Rad путем, сигнализирующем о повреждениях ДНК (Рис. 7). (Рис.7.) \| Активация р53 вслествие повреждения ДНК.Активируемая повреждением ДНК протеин киназа АТМ/ATR и CHK1/CHK2 ингибируют р53 антогониста, MDM-2, и актививруют транскрипционную активность р53. Параллельный путь активации использует повреждением ДНК индуцируемое ацетилирование р53 с помощью PCAF и р300/СВР. Активация р53 м. приводить к апоптозу или аресту клеточного цикла в зависимости от клеточного контекста. У человека р53 фосфорилируется по сериновым остаткам 15, 20, 33 и 37 в ответ на повреждение ДНК, потенциально модулируя их взаимодействие с MDM-2. Стабилизация р53 и его фосфорилирование по Ser15, сопровождаемое DNA DSB, АТМ зависимо, тогда как сопровождаемое УФЛ фосфорилирование Ser15 в р53 является АТМ независимым и м.б. блокировано с помощью экспрессии доминантонго негативной формы ATR. Фосфорилирование по Ser15 и Ser37 v/ способствовать взаимодействию р53 с TFIID транскрипционным фактором. Однако, фосфорилирование Ser20 более важно для стабилизации р53. СНК1 и СНК2 фосфорилируют р53 по Ser20? а АТМ/ATR- зависимая активация этих киназ частично объясняет потреность в АТМ/ATR для стабилизации р53. Клетки без СНК2 дефектны по стабилизации р53, а мутации СНК2 зародышевой линии м. вести к Дш-Fraumenti синдрому, который м. также вызываться мутациями зародыевой линии в ТР53 гене, кодирующеи р53. АТМ-зависимое фосфорилирование MDM-2 также модулирует взаимодействие р53-MDM-2 и, следовательно, вносит вклад в стабилизацию р53, индуцируемую повреждением ДНК. Дополнительными ДНК повреждениями индуцированные посттрансляционные модификации р53 происходят в С-терминальной области, которая модулирует сиквенс-специф. ДНК-связывающую активность белка. Фосфорилиование Ser392 стимулирует эту активность и индуцируется с помощью УФЛ, но не ионизирующей радиации. Ser376 и Ser378 фосфорилируются в необлученных клетках, но облучение индуцирует быстрое и АТМ-зависимое фосфорилирование Ser376. Этот размаскированный сайт, с которым соединяется с 14-3-3 белками, приводя к повышенному сексенс-специфическому ДНК соединению с помощью р53. АТМ, по-вивдимому, активирует фосфатазу, которая действует на Ser376. p53 модифицируется ацетилированием Lys320 с помощью PCAF ацетил трансферазы после обработки клеток УФЛ, и ацетилированием Lys373 и Lys382 с помощью з300.СВР в ответ как на радиацию, так и УФЛ. Ацетилирование этих остатков актививрует сиквенс-специф. ДНК-связывающую активность з53 in vitro. Существенно, р53, который фосфорилирован или по Ser15 или Ser33 и Ser37, является предпочтительным субстратом для р300/СВР, тогда как фосфорилирование по Ser378 строго ингибирует ацетилирование с помощью PCAF. Checkpoint Controls and DNA Repair: Further Connections Активация DNA-damage checkpoint у S.cerevisiae ведет к транскрипционной индукции ряда генов, кодирующих белки репарации ДНК. Этот путь нуждается в Dun1 протеин киназе помимо Mec1 и Rad53. Сходные мехенизмы, по-видимому. оперируют и у др. эукариот. АТМ является компоенентом очень большого комплекса, который кроме того содержит BRCA1, MRE11/RAD50/NBS1, BLM геликазу, MSH2, MSH5, MLH1 и RF-C. Этот компелекс потенциально участвует в распознавании различных аномальных структур ДНК, в трансмиссии checkpoint сигналов и в различных аспектах собственно репарации ДНК. CELL DEATH Альтернативой репарации ДНК у многоклеточных организмов является использование апоптического пути. Пороговый уровень повреждений, достаточный для запуска апоптоза сильно зависит от типа клеток. Апоптоз запускается активацией членов специализированного семейства cystein aspartyl proteases, caspases. Активные каспазы являются гетеродимерными, состоящими из большой и малой субъединиц, генерируюемых с помощью опосредованного каспазами расщепления общего прокаспазного белка-предшественника. В клетках человека каспазы 8 и 9 играют ключевцю регуляторную роль в этих каскадах, тогда как др. члены семейства выполяют эффекторную нижестоящую роль (Рис. 8). (Рис.8.) \| Апоптоз, индуцируемый повреждениями ДНК.Инициаторная каспаза м. активировать различные сигналы, включая повреждения ДНК, некоторые из которых передаются с помощью путей, ведущих к активации р53. Высвобождение цитохрома с из митохондрий м. также вносить свой вклад в активацию каспаз посредством связывание APAF-1. Этот процесс обеспечивается с помощью ВАХ. который м. активрован с помощью р53 и ингибируется с помощью BCL-2 и родственными анти-апоптическими белками. Эффекторные каспазы м.б. активированы независимо с помщью активации каспазы 8 вследствие использования FAS рецептора. В некоторых случаях высвобождение цитохрома с из митохондрий является ранней ступенью активации каспазы 9. Цитохром с стимулирует у человека белок APAF-1, структурно сходный с про-апоптическим CED-4 белком у C.elegans, чтобы связаться и активировать прокаспазу 9. BCL-2 является прототипическим членом второго семейства белков с важными функциями в регуляции апоптоза. Его гомолог у C.elegans, кодируется геном ced-9 и функционирует как супрессор CED-3-опосредованной клеточной гибели. Дополнительные родственные BCL-2 белки у млекопитающих играют роль или помогая или супрессируя апоптоз. Члены этого семейства способны формировать гомо- и гетеродимеры и возможно функционируют в превую очередь как регуляторы активации каспаз, частично влияя на высвобождение цитохрома с митохондриями. Receptor-Mediated Cell Death Помимо повреждений ДНК существуют и другие физиологически важные триггеры апоптоза, включая удаление факторов роста, истощение нуклеотидного пула и вовлечение трансмембранных "death receptors" из сверхсемейства tumor necrosis factor (TNF) receptor (Fas или СВ95 или APO1; TNFR). Их внутриклеточные домены имеют общую струкуру, называемую 'death domain". Про-апоптические лиганды для этих рецепторов являются гомотримерными пептидами, которые или растворимы или экспрессируются на поверхности соседних кеток. Индуцированное лигандом кластрирование рецепторов способствует соединению растворимого цитозольного адапторного белка FADD, который в свою очередь обусловливает активацию каспазы 8. Повреждением ДНК индуцированный апоптоз м.б. FAS- и FAS лиганд-зависимым. Следовательно этот death сигнальный путь м. включать и внеклеточные компоненты. h53-Dependet and p53-Independet Apoptosis р53 необходим абсолютно также для некоторый форм апоптоза, таких как повреждениями-ДНК индуцированная гибель типмоцитов in vivo. Потенциальными механизмами проапоптоического эффекта являются р53-обусловленная транскрипционная индукция FAS или BAX и NOXA, которые кодируют про-апоптические члены семейства BCL-2. Индукция с помощью р53 транскрипционного фактора NF-kB также м.б. важной для пути, способствующего гибели, предполагается кроме того существование нетранскрипционной апоптической функции р53. Степень повреждения ДНК м. влиять на степень последующего апоптоза без изменения уровня р53, а некоторые формы апоптоза являются р53-независимыми. В некоторых таких случаях апоптоз являтся результатом индукции FAS лиганда через активацию транскрипционного фактора АР-1, посредством с-Jun N-терминальной киназы. Активация АР-1 и NF-kB, подобно активации р53, не является обязательно про-апоптической. COORDINATING CELL CYCLE CONTROLS, DNA REPAIR, AND APOPTOSIS Повреждением ДНК индуцированный апоптоз м.бю. инициирован с любой точки клеточного цикла, а также в G0. Следовательно, нет облигаторной связи между регуляторами клеточного цикла и молекулами, отвественными за начало апоптоза. Тем не менее предполагается, что апоптоз м.б. запущен при возобновлении циклов в клетках, которые ранее были арестованы в G2 checkpoint bp-за нарушений ДНК. Вступление в митозы с разрывами нитей ДНК д. создавать вторичные повреждения, которые способны запустить мощные апоптические стимулы. В нормальных эпителиальных клетках индуцированный повреждением ДНК р53-независимый апоптоз имеет замедленную кинетику по сравнению с р53-зависимой гибелью. Эта задержка м. отражать потребность в прогрессии клеточного цикла и/или в обработке повреждений при р53-независимой индукции апоптоза. Путь checkpoint Rad является родоначальным ответом, к которому были добавлены дополнительные эффекторные механизмы. Это касается не только р53, но и др. апоптических регуляторов. Напр., в клетках человека рКФВ9 взаимодействует с BCL-2 так, что это способствует апоптозу. Усиление экспрессии BRCA1, ведет к с-Jun N-терминальноному киназа-зависимому апоптозу. Более того, MRT-2. гомолог Rad1 у C.elegans, необходим для повреждением ДНК индуцированного апоптоза и для ареста клеточного цикла.

(Рис.1.) | Схема пути эксцизионной репарации оснований Поврежденное основание (А) вырезается с помощью ДНК гликозилазы в результате возникает апуриновый/апиримидиновый сайт. После расщепления апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазой путь раздваивается на ветвь одиночных нуклеотидов и ветвть длинных участков.

BER путь показан на рис. 1. ДНК гликозилазы, из которых несколько классов распознают аномальные основания ДНК и катализируют гидролитическое расщепление N-glycosyl мостикa, связывающий основание с сахаром. После образования apurinic/apyrimidinic (AP) сайта в большинстве случаев путь BER м. позволить использовать общий набор белков. АР эндонуклеазы и фосфодиэстеразы генерируют одиночные нуклеотидные пробелы, содержащие 3' hydroxyl и 5' фосфат окончания, которые позволяют ДНК полимеразе заполнить пробел. Наконец, ДНК лигаза м. залечить оставшиеся царапины. Имеются и вариации на эту тему. Во-первых, вместо АР эндонуклеазой расщеплениия фосфодиэфирных мостиков 5' в АР сайте м. некоторые гликозилазы удалять поврежденные основаня и расщеплять фосфодиэфирные мостики 3'бдавая в результате АР сайт в результате β-элиминации (т.наз. АР лиаз). В этом случает ненасыщенные фрагменты сахаров слева от 3' сайт в разрыва удаляются с помощью фосфодиэстеразы, создавая необходимый пробел в один нуклеотид. Одним из источныиков этого действия фосфодиэстаразы является вторая активность, осуществляемая АР эндонуклеазой.

Вторым вариантом в BER является то, что для ступени полимеризации BER используется пробелы более одного нуклеотида. Это т.наз. "long-patch" путь, приблизительно подвергаются эксцизии 2-10- нуклеотидов и замещаются путем комбинированного действия ДНК полимеразы (обычно Polδ или ε, но возможно Polβ), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), replication factor С (КА-С) и эндонуклеаза, которая расщепляет "flap" структуру (FEN-1). Путь long-patch ? gj-видимому, предоминирует, когда репарация инициируется на oxidized или восстановительном АР сайте, генерируемом Х-лучами или химическими агентами, тогда как путь репарации пробелов в один нуклеотид запускается, если генерируется "регулярный" АР сайт. На этом пути ЧКСС1 белок управляет специфическими взаимодействиями с Polβ и ДНК лигазой III и, следовательно, рекрутируются эти лигазы в места начала репарации. При long-patch BER разрывы очевидно залечиваются ДНК лигазой I.

Белковые компоененты пути BER законсервированы структурно и функционально.

DNA Glycosylases for Repair of "Inappropriate" DNA Bases

Несоответствующие основания? это те, что обычно обнаруживаются в ДНК, такие как урацил, а также нормальные основания в несоответствующем контексте, такие тимидин, возникающий в результате деаминирования 5-мктил цитозина. Урацил возникает в ДНК благодаря деаминированию цитозиновых остатков или включению dUTP во время репликации ДНК. Uracil DNA glycosylase (UDG) вырезает урациловые остатки из ДНК, но не из РНК. Очевидно из-за этого возникает потребность в эффективном распознавании урацила и тимидина в ДНК, которые очень сходны по структуре. UDG имеет малую гибкость в отношении специфичности к субстрату, она ограничивается урацилом и его дериватами, такими как 5' fluorouracil. Благодаря форме кармана активного сайта мишень урациловый нуклеотид м. адоптировать неспиральную конформацию.Этот механизм "nucleotide flipping" законсервирован в отношении действия нескольких BER энзимов. Клетки человека содердат др. UDG активность, обозначаемую hSMUG1, которая предпочитает ssДНК содержащие урациловые остатки в качестве субстрата.

LYR у большинства организмов, включая и человека, содержит цитозиновые остатки, метилированные в положении С⁵. После деаминирования 5-метилцитозина образуется тимин, давая неправильную пару G:Т. Для исправления этого дефекта репаративная система должна исправить ее в G:С, а тимидиновый остаток в А:Т парах не должне служить в качестве субстрата. Гликозилаза, отвечающая за репарацию неправильной пары G:Т, является тимидин ДНК гликозилазой. Однако она неспецифична для тимидиновых остатков, т.к. распознает также урацил, который неправильно спаривается с гуанином. Эта "урацил гликозилазная" активность законсервирована у организмов, которые не метилируют цитозиновые остатки.

Glycosylases for Repair of Oxidized DNA Bases

Окисление оснований в клеточной ДНК м. возникать в результате воздействия ионизирующей радиации, радиомиметических хим. в-в и внутриклеточных видов реактивного кислорода (reactive oxygen species (ROS)). У E.coli окисленные пурины вырезаются с помощью FPG белка(известного так же как MutM и FAPY glycosylase). FPG удаляет производные открытого имидазольного кольца, такие как FAPY-гуанин и FAPY-аденин и 7,8-duhydro-8 oxoguanine (8-OG) (Рис. 2).

(Рис.2.) | Примеры структур окисленных пуриновых субстратов для FPG/Ogg1 класса энзимов.

8-OG м. неправильно спариваться с А и давать GС->TA трансверсионные мутации. Мутанты fgp обнаруживают повышенную частоту GС->TA мутаций? что связано с дефектом репарации 8-OG.

Дрожжи млекопитающие содержат белки, котрые выполняют роль, аналогичную FPG. S.cerevisiae Ogg1 белок обладает субстратной специфичностью, сходной с таковой у FPG, хотя их первичные последовательности неродственны. Вместо этого Ogg1 обнаруживает сходство последовательностей с E.coli эндонуклеазным (endo)III белком. Гомолог Ogg1 у человека вырезает 8-OG? спаренный с цитозином с помощью flipping 8-OG остатка во внеспиральную конфигурацию. Способность Ogg1 различать 8-OG и гуанин связана с одиночным водородным мостиком между активным сайтом глицинового остатка и 8-OG половиной.

8-OG остатки, который изежали репарации перед репликацией ДНК м. неправильно спариваться с аденином. 8-OG:A неправильная пара является довольно слабым субстратом для Ogg1, особенно, если нужно исключить адениновый остаток как матрицу для репарационного синтеза ДНК. Все клетки, следовательно, экспрессируют энзим, который конвертирует 8-OG:A неправильную пару в 8-OG:C благодаря действию аденин гликозилазы. Ген, кодирующий эту активность у E.coli - mutT. Т.к. клетки противодействуют 8-OG остатку в ДНК через комбинированное действие FPG/Ogg1 и MutY, то fpg mutY двойные мутации обнаруживают чрезвычайно высокую частоту GС->TA мутаций. Белок ЬгеН обнаруживает существнное сходство последовательностей с E.coli endoIII, включая законсервированный helix-hairpin-helix (HhH) мотив и цистеиновый остаток, который создает сайт связывания для железо-серного кластера (4Fe-4S)²⁺ типа. MutY также законсервирован, а его гомологу человека MYH имеет очень сходную субстрат специфичность.

Endo III вырезает многочисленные окисленныепродукты пиримидинов. Большинство субстратов возникает в результате реакции ROS в 5,6-двойном мостике и включает цитотоксические повреждения, такие как тимидина и цитозина glycols. Однако, endo III распознает также окрытые кольца, контракции колец и продукты фрагментации колец цитозинового и тимидинового остатков (Рис. 3).

(Рис.2.) | Примеры структур окисленных пиримидиновых субстратов для endo III класса энзимов.

Почкующиеся дрожжи экспрессируют два гомолога endo III, Ntg1 и Ntg2, первый не содержит характерного железо-серногокластера. Субстрат специфичность этих двух энзимов сходна, но несмотря на это отличается от таковой endo III. Единственнвй гомолог endo III у человека, hNTH1, обладает основным струтктурным мотивом HhH и Fe-S кластером и имеет сходную субстрат специфичность.

Glycosylases for Repair of Alkylated Bases

Широкий выбор продуктов для алкилирования оснований представлен на рис. 4.

(Рис.4.) | Примеры структур субстратов для 3-MAG класса энзимов.

Эти добавки репарируются с помощью гликозилазы, обозначаемой как 3-methyladeninne DNA glycosylase (3-MAG). Два таких энзима, AlkA и Tag известны у E.coli? первый индуцируется как часть адптивного ответа на аклилирование ДНК. Одиночная активность 3-MAG с широкой субстратной спеифичностью, сходная с AlkA существует у эукариот. 3-MAG эффективно вырезает также 1,N,sup>6-ethenoadenine остатки. Репарируя 3-метиладенин и 1,N,sup>6-ethenoadenine остатки in vivo 3-MAG защищает клетки млекопитающи[ отцитотоксических эффектов определенных алкилирующих агентов. Способность AlkA распознавать как позитивно заряженные, так и большое число ароматических субстратов происходит от присутствия многочисленных ароматических боковых цепей, заполняющих каталитическую щель. Кристаллическая структура AlkA указывает на действие механизма flipping нуклеотидов.

Алкилирование в положениеи O⁶ гуанина является высоко мутагенным, т.к. O⁶-алкилгуанин с высокой эффективность дает неправильные спаривания с тимидином, что ведет к GC->AT трансцизионным мутациям. Эти повреждения, которые такеж цитотоксичны, репрарируются с помощью законервированного спецализированног белка, O⁶-алкилгуанинДНК алкилилтрансферазы (O⁶-АТ). Экспрессия ее делает клетки резистентными к цитотоксическим и мутагенным эффектам различных алкилирующих агентов, большинство из которых используется для химиотерапии.

AP Endonuclease in BER

AP эндонуклеазы противодействуют цитотоксическому и мутагенному потенциалу АР сайтов. Эти повреждения возникают благодаря спонтанному гидролизу N-glycosyl мостика, связывающего основание с фосфодиэфирным остовом, вследствие повреждений ДНК алкилирующими агентами или ROS и благодароя действию ДНК гликозилаз. Имеется два больших семейства АР эндонуклеаз, названных exonuclease (exo) III и endo IV семействами, которые происходят от имени двух АР эндонуклеаз у E.coli . AP помимо эндонуклеазной активности обладают фосфодиэстеразной активность для удаления фрагментированный сахарных остатков, такие как фосфогликолатыБ с 3' концов разрывов нитей, индуцированный оксидантами. Эта активность м. также удалять 3' терминальные группы сдева с помощью АР lyases вследствие β-элиминации в АР сайте. АР лиазная активность является свойством endo III и FPG семейств гликозилаз.

Каталитический механизм действия обоих семейств АР эндонуклеаз выявлен с помозью рентгеновской кристаллографии. Гомолог человека exo III, HAP1 (APE/Ref-1), обнаруживает структурное сходство с ДНКазой I. Abasic деоксирибоза лежит во внеспиральной конформации и стабилизирует в НАР1 активный сайт путем взаимодействия со специфическими остатками. Выявлено несколько активных сайт остатков необходимы для реакции гидролиза. Структурные исследования endo IV E.coli выявили, что обе abasic деоксирибоза и ее нуклеотид-партнер flipped out из дуплекса.

Структурный и сайт-направленный мутагенез показывает, что НАР1 м координировать различные ступени BER процесса через привлечение межбелковых взаимодействияй. НАР1 взаимодействиет и удаляет гликозилазы, который сврязаны с АР сайтами, сгенерироваными с помощью их действия. Более того, вследствие расщепления фосфодиэфирного остова, НАР1 остается связанным с разорванной ДНК до тех пор, пока взаимодействия с Polβ не инициируют последующую фосфодиэстераза/полимеразную ступень, это помогает объяснить, как BER м.б. столь эффективным и быстрым процессом in vivo.

Late Stages in BER

Polβ м. катализировать как 5' phosphodiesterase, так и полимеризации ступень в BER. Polβ-децифитные клетки мыши показали. что только фосфодиэстеразное действие Polβ существенно для защиты против MMS. Также как и связываясь с HAP1:DNA комплексом, Polβ осуществляет взаимодействия с XRCC1 белком, который , по-видимому. играет роль остова скорее, чем какую-либо специфическую энзимтическую функцию. XRCC1 рекрутирует затем ДНК лигазу III в сайт готовый к репарации.

DNA DOUBLE-STRAND BREAK (DSBs) REPAIR

DSBs возникают в дНК клетки разными путями, включая ионизирующю радиацию и хим.радиомиметики, посредством взаимодействия репликационной вилкаи с разрывам одиночной нити на матрице и запрограммировано во время мейоза и во время прерстроек геов иммуноглобулинов.

Homologous Recombination

У S.cerevisiae гомолог. рекомбинация зависимт от RAD52 эпистаза группы генов, которые включают RAD50, RAD51, RAD52, RAD54, RAD55, RAD57, RAD59, MRE11 и XRS2. Rad51 является эукариотическим гомологом E.coli RecA, которая инициирует гомологиную рекомбинацию, катализируя гомологичное спаривание и обмен нитей ДНК. Rad51 имеет существенно сниженную каталитическую скорость по сравнению с RecA. Чтобы компенсировать этот кажущийся недостаток эукариотический Rad51 действует совместено с др. белками. Replication Protein A (RPA) усиливает эффективность реакции обмена нитей ДНК, обеспечиваемой Rad51, но только ели добавляется к реакциям после того как Rad51 создаст характерные нуклеопротеиновые филаменты на ssДНК в которой происходит обмен нитей. Rad52 и Rad55/57 гетеродимер, оба противодействуют ингибирующему воздействию RPA, преимущественно за счет обеспечения обмена Rad51 для RPA на ssДНК. Болеетого, Rad54 м. стимулировать катализируемое Rad51 спаривание гомологичных молекул ДНК in vitro. Rad54 является ДНК-зависимой АТФазой семейства Swi/Snf, чья точная рольнеясна. Идентифицировано несколько родственых Rad55/57 белков млекопитающих, но действуют ли они также как их гомологи, неясно. Два из них, XRCC2 и XRCC3 идентифицированы в клетках хомячков, дефектных по DSB-индуцированной гомологичной рекомбинации.

Функции гомологичной рекомбинации являются витальными для репарации DSBs. Предполагается, что Rad52 инициирует репарацию двойных разрывов путем связывания ДНК концов. Это связывание защищает ДНК концы от экзонуклеотической атаки и облегчает соединение конец-в-конец. Rad52 затем помещает Rad51 на ДНК благодаря прямому взаимодействию белок:белок. Эта связующая концы функция, возможно, объясняет, почему Rad52 действует также на пути single-strand annealing (SSA). Возможно также, что Rad52 действует частично конкурируя с Ku DNA end-joining комплексом, чтобы направить репарацию двойных разрывов по пути гомологичной рекомбинации вместо NHEJ пути.

Y S. cerevisiae RAD52 является существенной для репарации двойных разрывов и гомологичной рекомбинации. Однако, RAD52-/- мыши жизнеспосодны и фертильны и их клетки не обнаруживают нарушений репарации двойных разрывов. RAD54-/- мыши также жизнеспособны и фертильны, несмотря на клеточные дефекты в репарации поперечных сшивок ДНК. Эти мыши гиперчувствительны е рентгеновскому облучению на эмбриональной, но не вхзрослой стадии. Напротив RAD51-/- мыши погибают во время раннего эмбриогенеза.

У дрожжей Rad50/Mre11/Xrs2 комплекс осуществляет нуклеазную активность и участвует в резекции двойных разрывов для создания 3' ssДНК хвоста, необходимого для Rad51, чтобы инициировать обмен нитями. Хотя Rad50 и Mre11 белки хорошо законсервированы, то Xrs2 - нет. днако, белок с ограниченным сходством с Xrs2, наз. NBS1 (nibrin), gj-видимому, функциональный аналог Xrs2. NBS1 белок дефектен при ataxia telangieectasia-like disorder, Nijmegen breakage synd.

HR в клетках человека, по-видимому, сложенее, чем в дрожжах. Два белка, которые, по-видимому, играют важную роль в репарации двойных разрывов - BRCA1 и BRCA2 - опухолевые супрессоры. Мышиные фибробласты, дефицитные по BRCA1 или BRCA2 обнаруживают чувствительность к ДНК-повреждающим агентам и excessive хромосомным аберрациям. BRCA1 и BRCA2 взаимодействуют непосредственно др с др и RAD51. Предполагается, что они участвуют в трансдукции сигналов от факторов, которые распознают ДНК повреждения к ДНК репаративной кухне.

Single-Strand Annealing (SSA)

SSA, подобно HR,является процессом воссоединения двойных разрывов, с использованием гомологии между концами соединяемых последовательностей (Рис. 5).

(Рис.5.) | Схема, представляющая три пути репарации двунитчатых разрывов ДНК. Двунитчатые разрывы ДНК, генерируемые рентгеновским облучением или радиомиметиками, подвергаются процессингу по время или негомологичного соединения концами (NHEJ)или рекомбинация-зависимым путем (справа), возможно при конкуренции между Ku70/Ku80 комплексом и Rad52 за связывание с концами. При NHEJ (слева) Ku комплекс привлекает к участию ДНК-РК_cs и XRCC4/ligase IV гетеродимер для эффективного воссоединения. При гомологичной рекомбинации Rad51 привлекается к участию с помощью Rad52 для обеспечения инвазии нити ДНК интактной сестринской хроматиды или гомологичной хромосомы. При однонитчатом annealing резекции и annealing коротких комплементраных последовательностей предшествует trimming некомплементарных ssLYR хвостов и лигация.

Однако SSA отличается от HR по способу достижения. ДНК, чтобы соединиться сначала резецируется для создания ssДНК хвостов. Когда резекция проходит достаточно, чтобы выявить комплементарные последовательности, то две ДНК м. затем прокаливаться (annealed) перед лигацией ДНК. Неизбежно SSA обладает потенциалом для создания делеций между повторяющимися последовательностями. SSA нуждается в Rad52 белке у S.cerevisiae, но не в Rad51? что согласуется с отсутствием потребности в инвазии для ДНК-нити. Роль Rad52 вероятно связана с ДНК концами и затрагивет annealing ДНК.

SSA нуждается в Rad50, Mre11, Xrs2 белковом комплексе у S.cerevisiae и в функционально аналогиных белках человека: RAD50, MRE11 и NBS1. Вероятно. что это комплекс участвует в рецекции концов ДНК. После резекции и annealing комплементарыне последовательности ДНК, ssDNA хвосты, м.б. приведены в порядок (Рис. 5). Эта стрижка, очевидно, осуществляется структура-специфичной XPF-ERCC1 эндонуклеазой (Rad1/Rad10 у дрожжей) в клетках человека.

Nonhomologous End-Joining (NHEJ)

NHEJ процесс, с помощью которого dsДНК концы воссоединяются, даже если имеется мало или нет спаривающихся оснований в месте соединения. Этот путь репарации двойных разрывов уникален для эукариот. Законсервированный набор белков, обозначенных как Ku70, Ku80, DNA ligase IV и XRCC4 у человека необходимы для NHEJ. У позвоночных необходима также каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеин киназы (DNA PK_CS). NHEJ имеет отношение не только к репарации dsДНК разрывов, индуцированных повреждаюещими агентами, но и к процессингу разрывов, возникающих во время перестройки генов иммуноглобулинов. Тяжелые комбинированные иммуно-дефициты у мышей ассоциируют с инактивированием DNA PK_CS. Мыши с целенаправленными разрушениями гена Ku80 обнаруживают чувствительность к ренгеновским лучам, имеют тяжелые комбинированные иммунодефициты и повышенные частоты хромосомных аберраций. Разрушение же генов XRCC4 или ДНК лигазы IV ведет к эмбриональной летальности. Очевидно, что эти белки играют назависимую роль вне пути NHEJ. XRCC4/ligase IV гетеродимерные комплексы рекрутируются к ДНК концам с помощью Ku комплекса. ТРУО линеаризованой плазмидной ДНК м.б. осуществлено в бесклеточных экстрактах.

CELL CYCLE CHECKPOINTS ACTIVATED IN RESPONSE TO DNA DAMAGE

Неспособность к полной репарации перед репликацией или сегрегацией хромосом м. вести к фиксации мутаций в геноме или к непоправимым разрывам хромосом. Следовательно, геномная интеграция сохраняется частично с помощью механизмов, котрые грантируют задержку клеточного цикла до тех пор, пока повреждения ДНК не будут устранены. Эти, т.наз. checkpoint (контрольно-пропускной пункт, КПП) механизмы м.вести к задержке клеточного цикла в G1, G2 или S фазе. Аналогичные механизмы м. задерживать репликацию ДНК у бактерий. Многие компоненты checkpoint не нужны для хода клеточного цикла per se, но вступают в игру, когда ДНК повреждена или блокировна репликация. Кроме того некоторые checkpoint компоненты связаны с активацией репарации, нуклеотидным метаболизмом, поддержанием теломер или индукцией клеточной гибели.

КПП впервые выявлены у radiation-sensitive (rad) мутантов дрожжей, которые неспособны задерживать ход митозов после повреждений ДНК. Искусственная задержка клеточного цикла в этом случае достаточна, чтобы откоррекировать повреждения ДНК. Выявлены пути, связывающие продукты checkpoint генов, и охарактеризованы взаимодействия на биохимическом уровне.

Mec1/Rad3/ATM/ATR Activation: A Fundamental Eukaryotic Checkpoint Response to DNA Damage

Checkpoint гены функционально связаны с теми, что идентифицированы у дрожжей и в мультиклеточных организмах при анализе мутантов, чувствительных к радиации. Хотя имеются отличия в деталях, но в целом организация КПП законсервирована.

(Таблица.) |

Большинство checkpoint детерминантов являются фосфопротеинами и/или протеин киназами. Выдающимися среди них являются члены семейства больших киназ, включая S.cerevisiae Mec1, S.pombe Rad3 и белки человека АТМ и ATR. Эти белки принадлежат семейству фосфоинозитид 3-киназ, но фосфорилируют они скорее блковые субстраты, чем липиды. Каждый активируется в ответ на повреждение ДНК и ряд событий фосфорилирования идентифицирован, они зависит от активации этих киназ. Семейство Mec1/Rad3/ATM/ATR действует на раннем этапе checkpoint пути или как детекторы повреждений ДНК или в тесной ассоциации с такими детекторами. В клетках млекопитающих эти киназы активируются неким специфическим для повреждения способом, АТМ специфична для агентов, индуцирующих DNA, DSB, а ATR , вероятно отвечает за повреждения УФЛ. У дроржжей же члены семейства активируются в ответ на широкий круг DNA структур, включая остановку репликационой вилки.

Дополнительные checkpoint компоненты? функционирующие сочетанно с Mec1/Rad3/ATM/ATR киназами, идентифицированы у S. pombe? которые включают "checkpoint Rad" белки Rad1, Rad9Sp, Rad17Sp и Hus1, потеря любого из них вызвает чувствительность к радиаии и checkpoint дефекты, очень сходные с теми, что набоюдаются при отсутствии Rad3. Продукты всех этих геновдействуют на общем пути.

Большинство из checkpoint белков обладееи низким, но достоверным сходством с белками, участующими в репликации ДНК. Так, Rad1, Rad9Sp и Hus1 родственны акцессорному белку ДНК полимеразц PCNA, тогда как Rad17Sp родственен субъединице RF-C. Это сходство последовательностей отражает физическую ассоциацию Rad1, Rad9Sp и Hus1 в комплексе, как и их эксивалентов у S.cerevisiae и в клетках человека, тогда как Rad17Sp подобно Rad24 у S.cerevisiae, ассоциирует с субъединицей RF-С на хроматине. Во время репликации ДНК RF-С функционирует, загружая PCNA на хроматин. По аналогии м. предположить, что Rad17Sp загружает Rad1/Rad9Sp/Hus1 комплекс на ДНК в ответ на повреждение ДНК. Т.к. PCNA действует путем связывания репликативной полимеразы с ее матрицей, то Rad1/Rad9Sp/Hus1 м. формировать скользящий хомут с двойной функцией: checkpoint сигнализацией и рекрутированием энзимов репарации ДНК. В клетках человека рКФВ17 локализуется в ядрышке и перераспределяется в нуклеоплазму после облучения УФЛ.

Модель checkpoint пути представлена детекторами повреждений, передатчикми сигналов и ингибирующими клеточный цикл эффекторами. Но этот механизм не всегда так прямолинеен. Так, у S/cerevisiae выявляется альтернативный checkpoint путь повреждений ДНК, в котором Rad17Sc, Rad24 и Mec3 служат для активации экзонуклеазы ( вообще самой Rad17Sc). Эта нуклеаза снаыала обрабатывает первичные повреждения способом, который ведет к генерации checkpoint сигнала. Имеются данные, что Rad9Sc действует ниже Мес1. Сходным образом Rhp9/Crb2, аналог Rad9Sc у S.pombe, по-видимому. действует ниже Rad3, а индуцируемое повреждением ДНК Rad3-зависимое фосфорилирование Rad26 независит от всех известных checkpoint белков. предполагается, что некоторые из этих событий форсфорилирования отражают активацию контроля петлей обратной связи скорее, чем передачу checkpoint сигнала.

Effectors of Checkpoint Rad Pathway

Checkpoint сигналы передаются вниз от Mec1/Rad3/ATM/ATR и др. checkpoint Rad белков и фокусируются на серин/треонин протеин каназах, типичными представителями которых являютсz дрожжевые Chk1 и Rad53/Cds1 и их эксиваленты у позвоночных CHK1 и CDS1/CHK2. Потребность в активации этих киназ и результаты их инактивации отличаются внутри и между видами. Chk1 мутанты являются чувствительными к радиации у S.pombe, но не S.cerevisiae, у которых Cds1-подобная киназа, Rad53, выполняет основную checkpoint сигнальную роль после повреждения ДНК. Напротив, у делящихся дрожжей Cds1 активируется специфически во время S фазы и необходима для задержки S-фазы в ответ на повреждения ДНК, но cds1 мутанты не чувствительны к радиации.

Идентифицированы различные механизмы ниже этих Ser/Thr киназ, которые трансдуцируют checkpoint сигналы к эффекторным белкам клеточного цикла. У делящихся дрожжей и в клетках человека ключевая митотическая cyclin-dependet kinase, Cdc2, является принципиальной мишенью на checkpoin пути, активируемом в ответ на повреждения ДНК или ингибирование репликации. Cdc2-cyclin И гетеродимеры действуют как триггеры всех основных событий митоза и ингибирования этой протеин киназы достаточно для предупреждения вступления в митоз. Ингиибрование Cdc2-cyclin И в ответ на активацию checkpoint связано с фосфорилированием Cdc2 субъединицы по ингибирующему остатку Thr14 и/или Tyr15. Фосфорилирование в этих сайтах осуществляется принципиально с помощью Wee1 протеин киназы со вторичными активностями, относящимися к киназе Mik1 и Myt1 у S.pombe и в клетках человека, соотв. Эти ингибирующие клеточный цикл киназы являются противовесом Cdc25 протеин фосфатазе, которая активирует Cdc2 путем удаления фосфата с Tyr15. Прерывание перехода между интерфазой и митозом гарантируется механизмами позитивной обратной связи, посредством которых активная Cdc2 обеспечивает как ингибирование Wee1, так и активирование Cdc25. Во время checkpoint ответа на повреждение ДНК активация Chk1 или Свы1 оказывает противположное влияние. Эти киназы фосфорилируют Cdc25 по Ser216, генерируя сигнал распознавания для 14-3-3 белков, которые секвестрируют Cdc25 в цитоплазме (Рис. 6).

(Рис.6.) | Компоненты G2 checkpoint пути при повреждении ДНК.Сигнал о повреждении ДНК передается посредством checkpoint Rad белков и Chk1 протеин киназы. Ингибирование митотического индуктора Cdc2 осуществляется инактивацией Cdc25 и активацуией Wee1. Протеин киназы показны в прямоугольниках. Для простоты использована номенклатура только делящихся дрожжей.

Биологическая активность Wee1 также м. быть усилена с помощью Chk1-опосредованного фосфорилирования, и как Wee1, так и Mik1 стабилизируются Chk1-зависимым способом. Важность этих механизмов, которые конвергируют на Thr14/Tyr15 фосфорилировании Cdc2 подчеркивается checkpoint-дефектными фенотипами, индуцированными у S.pombe и в клетках человека с помощью Cdc2 мутантных белков, неспособных к фосфорилированию по данным сайтам.

У S.cerevisiae ингибирование Cdc28, гомолога Cdc2, не является важным свойством checkpoint на повреждение ДНК, оно вместо этого оперирует, блокируя начала митотической анафазы. а также выходи из митоза. Эти эффекты соотв. осуществляются через Chk1-зависимую стабилизацию Pds1 белка слипания сестринских хроматид и Rad53-зависимого подавления Cdc5 протеин киназы. Аналогичные механизмы м. оперировать с др. организмах, но они м. маскироваться с помощью Cdc2 пути, который ведет к аресту на ранних стадиях клеточного цикла.

BRCA1 опухолевый супрессор является субстратом для АТМ и СНК2, а BRCA1 мутантные клетки дефектны по индуцированному повреждением ДНК G2 аресту, возможно из-за неспособности их подавлять транскрипцию циклина В. Мутантные формы BRCA1 не имеют сайтов АТМ/СНК2-зависимого фосфорилирования и неспособны ревертировать гиперчувствительность к радиации BRCA1-дефицитных линий клеток? уазывая тем самым, что эти события фосфорилирования участвуют в трансдукции checkpoint сигналов.

Выявлена связь между checkpoint ДНК повреждения и поддержанием теломер. Укорочение теломер наблюдается у АТМ-/- и checkpoint rad мутантов. Более того, белок Tel1, который принципиально связан с поддержанием теломер, м. частично компенсировать петерю Мее1. Однако имеется отличие между checkpoint и функцией поддержания checkpoint Rad белков у S.pombe, т.к. последняя функция не нуждается в Chk1 или Cds1. Функция поддержания теломер, следоваетльно, м.б. эволюционным предшественником из которого произошел механизм checkpoint повреждений ДНК.

Замедление репликации ДНК в ответ на двойные разрывы ДНК является checkpoint Rad и Rad53/Cds1 зависимым у дрожжей и АТМ зависимым в клетках человека, но эффекторные механизмы в этом случае не ясны. NBS1 фосфорилируется с помощью АТМ м дейстовать ниже в этом пути. Вовлечение NBS1 в checkpoint повреждения S-фазы м.б. вторичным по сравнению с его ролью в репарации ДНК. NBS1, подобно Xrs2? своем аналоге у почкующихся дрожжей, ассоциирован с MRE11 и RAD50 , которые необходимы как для репарации двунитчатых разрывов, так и для поддержания теломер.

Damage Tolerance and Cell Cycle Resumption

У дрожжей неспособность репарировать повреждения ДНК м. сопровождаться повторным вступлением к клеточный цикл при сохранениии разрывов нитей ДНК. Возобновление клеточного цикла в этих условиях нуждается в Ku70, в отсуствие которого сохранившиеся разрывы подвергаются 5'-3' деградации. Сохранение разрывов ДНК обязательно д.б. связано с супрессией ареста клеточного цикла; ssLYR? генерируемая в отсутствие Ku70 запускает checkpoint сигнал, который не м.б. супрессирован таким способом. Согласуются с этим и мутации Mre11 или Rad50? которые редуцируют степень генерации ssДНК, а также супрессируют постоянный арест, наблюдаемый после повреждения у Ku70 мутанов. У S. pombe клеточный цикл, запускаемый вновь после ареста в ответ на checkpoint повреджения ДНК , нуждается в фосфорилировании Crb2 с помощью Cdc2, но неясно опрерируют ли аналогичные механизмы у более сложных организмов.

Cell Cycle Checkpoint Roles of p53

DNA-damage checkpoint у высших эукариот нуждается в дополнительных уровнях сложности, не обнаруживаемых у дрожжей. Тетрамерный транскрипционный фактор и супрессор опухолей р53 является центральным в checkpoint контроле у высших эукариот. Потребность в р53 в индуцированном повреждением ДНК G1 аресте значительна, если не обязательна, за счет привлечения транскрипционой индукции ингибитора циклин-зависимой киназы h21^WAF1 , который связывает и ингибируетG1 циклин-зависимую киназу. Активация р53 в ответ на повреждение ДНК и др. стрессы вызывает комплекс посттрансляционных модификаций р53 и его некгативного модулятора MDM-2, который сам индуцируется с помощью р53 на транскрипционном уровне. MDM-2 направляет р53 на протеолиз с помощью убиквитин/протеосомного пути, а подавление этого пути ведет после повреждения ДНК к накоплению р53.

Активация р53 участвует также в ДНК повреждением индуцированном G2 аресте, за счет увеличения экспрессии как 14-3-3δ, который секвестрирует Cdc2-cyclin И гетеродимеры в цитоплазме и р21 ^WAF1, который м. ингибировать Cdc2. Транскрипция генов, кодирующих CDC1 и циклин В, м. б. также репрессирована р53-зависимым способом. Этот р53-зависимый механизм действует рараллельно с checkpoint Rad путем. Клетки, лишенные функционального р53, являются, следовательно, полностью во власти checkpoint Rad белков и ведут к менее сильному G2 аресту в ответ на повреждение.

Regulation of p53 Following DNA Damage

путь р53 возник сравнительно недавно и обладает преимуществами по сравнению с прежде возникшим Rad путем, сигнализирующем о повреждениях ДНК (Рис. 7).

(Рис.7.) | Активация р53 вслествие повреждения ДНК.Активируемая повреждением ДНК протеин киназа АТМ/ATR и CHK1/CHK2 ингибируют р53 антогониста, MDM-2, и актививруют транскрипционную активность р53. Параллельный путь активации использует повреждением ДНК индуцируемое ацетилирование р53 с помощью PCAF и р300/СВР. Активация р53 м. приводить к апоптозу или аресту клеточного цикла в зависимости от клеточного контекста.

У человека р53 фосфорилируется по сериновым остаткам 15, 20, 33 и 37 в ответ на повреждение ДНК, потенциально модулируя их взаимодействие с MDM-2. Стабилизация р53 и его фосфорилирование по Ser15, сопровождаемое DNA DSB, АТМ зависимо, тогда как сопровождаемое УФЛ фосфорилирование Ser15 в р53 является АТМ независимым и м.б. блокировано с помощью экспрессии доминантонго негативной формы ATR. Фосфорилирование по Ser15 и Ser37 v/ способствовать взаимодействию р53 с TFIID транскрипционным фактором. Однако, фосфорилирование Ser20 более важно для стабилизации р53. СНК1 и СНК2 фосфорилируют р53 по Ser20? а АТМ/ATR- зависимая активация этих киназ частично объясняет потреность в АТМ/ATR для стабилизации р53. Клетки без СНК2 дефектны по стабилизации р53, а мутации СНК2 зародышевой линии м. вести к Дш-Fraumenti синдрому, который м. также вызываться мутациями зародыевой линии в ТР53 гене, кодирующеи р53. АТМ-зависимое фосфорилирование MDM-2 также модулирует взаимодействие р53-MDM-2 и, следовательно, вносит вклад в стабилизацию р53, индуцируемую повреждением ДНК.

Дополнительными ДНК повреждениями индуцированные посттрансляционные модификации р53 происходят в С-терминальной области, которая модулирует сиквенс-специф. ДНК-связывающую активность белка. Фосфорилиование Ser392 стимулирует эту активность и индуцируется с помощью УФЛ, но не ионизирующей радиации. Ser376 и Ser378 фосфорилируются в необлученных клетках, но облучение индуцирует быстрое и АТМ-зависимое фосфорилирование Ser376. Этот размаскированный сайт, с которым соединяется с 14-3-3 белками, приводя к повышенному сексенс-специфическому ДНК соединению с помощью р53. АТМ, по-вивдимому, активирует фосфатазу, которая действует на Ser376.

p53 модифицируется ацетилированием Lys320 с помощью PCAF ацетил трансферазы после обработки клеток УФЛ, и ацетилированием Lys373 и Lys382 с помощью з300.СВР в ответ как на радиацию, так и УФЛ. Ацетилирование этих остатков актививрует сиквенс-специф. ДНК-связывающую активность з53 in vitro. Существенно, р53, который фосфорилирован или по Ser15 или Ser33 и Ser37, является предпочтительным субстратом для р300/СВР, тогда как фосфорилирование по Ser378 строго ингибирует ацетилирование с помощью PCAF.

Checkpoint Controls and DNA Repair: Further Connections

Активация DNA-damage checkpoint у S.cerevisiae ведет к транскрипционной индукции ряда генов, кодирующих белки репарации ДНК. Этот путь нуждается в Dun1 протеин киназе помимо Mec1 и Rad53. Сходные мехенизмы, по-видимому. оперируют и у др. эукариот.

АТМ является компоенентом очень большого комплекса, который кроме того содержит BRCA1, MRE11/RAD50/NBS1, BLM геликазу, MSH2, MSH5, MLH1 и RF-C. Этот компелекс потенциально участвует в распознавании различных аномальных структур ДНК, в трансмиссии checkpoint сигналов и в различных аспектах собственно репарации ДНК.

CELL DEATH

Альтернативой репарации ДНК у многоклеточных организмов является использование апоптического пути. Пороговый уровень повреждений, достаточный для запуска апоптоза сильно зависит от типа клеток. Апоптоз запускается активацией членов специализированного семейства cystein aspartyl proteases, caspases. Активные каспазы являются гетеродимерными, состоящими из большой и малой субъединиц, генерируюемых с помощью опосредованного каспазами расщепления общего прокаспазного белка-предшественника. В клетках человека каспазы 8 и 9 играют ключевцю регуляторную роль в этих каскадах, тогда как др. члены семейства выполяют эффекторную нижестоящую роль (Рис. 8).

(Рис.8.) | Апоптоз, индуцируемый повреждениями ДНК.Инициаторная каспаза м. активировать различные сигналы, включая повреждения ДНК, некоторые из которых передаются с помощью путей, ведущих к активации р53. Высвобождение цитохрома с из митохондрий м. также вносить свой вклад в активацию каспаз посредством связывание APAF-1. Этот процесс обеспечивается с помощью ВАХ. который м. активрован с помощью р53 и ингибируется с помощью BCL-2 и родственными анти-апоптическими белками. Эффекторные каспазы м.б. активированы независимо с помщью активации каспазы 8 вследствие использования FAS рецептора.

В некоторых случаях высвобождение цитохрома с из митохондрий является ранней ступенью активации каспазы 9. Цитохром с стимулирует у человека белок APAF-1, структурно сходный с про-апоптическим CED-4 белком у C.elegans, чтобы связаться и активировать прокаспазу 9.

BCL-2 является прототипическим членом второго семейства белков с важными функциями в регуляции апоптоза. Его гомолог у C.elegans, кодируется геном ced-9 и функционирует как супрессор CED-3-опосредованной клеточной гибели. Дополнительные родственные BCL-2 белки у млекопитающих играют роль или помогая или супрессируя апоптоз. Члены этого семейства способны формировать гомо- и гетеродимеры и возможно функционируют в превую очередь как регуляторы активации каспаз, частично влияя на высвобождение цитохрома с митохондриями.

Receptor-Mediated Cell Death

Помимо повреждений ДНК существуют и другие физиологически важные триггеры апоптоза, включая удаление факторов роста, истощение нуклеотидного пула и вовлечение трансмембранных "death receptors" из сверхсемейства tumor necrosis factor (TNF) receptor (Fas или СВ95 или APO1; TNFR). Их внутриклеточные домены имеют общую струкуру, называемую 'death domain". Про-апоптические лиганды для этих рецепторов являются гомотримерными пептидами, которые или растворимы или экспрессируются на поверхности соседних кеток. Индуцированное лигандом кластрирование рецепторов способствует соединению растворимого цитозольного адапторного белка FADD, который в свою очередь обусловливает активацию каспазы 8. Повреждением ДНК индуцированный апоптоз м.б. FAS- и FAS лиганд-зависимым. Следовательно этот death сигнальный путь м. включать и внеклеточные компоненты.

h53-Dependet and p53-Independet Apoptosis

р53 необходим абсолютно также для некоторый форм апоптоза, таких как повреждениями-ДНК индуцированная гибель типмоцитов in vivo. Потенциальными механизмами проапоптоического эффекта являются р53-обусловленная транскрипционная индукция FAS или BAX и NOXA, которые кодируют про-апоптические члены семейства BCL-2. Индукция с помощью р53 транскрипционного фактора NF-kB также м.б. важной для пути, способствующего гибели, предполагается кроме того существование нетранскрипционной апоптической функции р53.

Степень повреждения ДНК м. влиять на степень последующего апоптоза без изменения уровня р53, а некоторые формы апоптоза являются р53-независимыми. В некоторых таких случаях апоптоз являтся результатом индукции FAS лиганда через активацию транскрипционного фактора АР-1, посредством с-Jun N-терминальной киназы. Активация АР-1 и NF-kB, подобно активации р53, не является обязательно про-апоптической.

COORDINATING CELL CYCLE CONTROLS, DNA REPAIR, AND APOPTOSIS

Повреждением ДНК индуцированный апоптоз м.бю. инициирован с любой точки клеточного цикла, а также в G0. Следовательно, нет облигаторной связи между регуляторами клеточного цикла и молекулами, отвественными за начало апоптоза. Тем не менее предполагается, что апоптоз м.б. запущен при возобновлении циклов в клетках, которые ранее были арестованы в G2 checkpoint bp-за нарушений ДНК. Вступление в митозы с разрывами нитей ДНК д. создавать вторичные повреждения, которые способны запустить мощные апоптические стимулы. В нормальных эпителиальных клетках индуцированный повреждением ДНК р53-независимый апоптоз имеет замедленную кинетику по сравнению с р53-зависимой гибелью. Эта задержка м. отражать потребность в прогрессии клеточного цикла и/или в обработке повреждений при р53-независимой индукции апоптоза.

Путь checkpoint Rad является родоначальным ответом, к которому были добавлены дополнительные эффекторные механизмы. Это касается не только р53, но и др. апоптических регуляторов. Напр., в клетках человека рКФВ9 взаимодействует с BCL-2 так, что это способствует апоптозу. Усиление экспрессии BRCA1, ведет к с-Jun N-терминальноному киназа-зависимому апоптозу. Более того, MRT-2. гомолог Rad1 у C.elegans, необходим для повреждением ДНК индуцированного апоптоза и для ареста клеточного цикла.

Cellular Responses to DNA Damage

BASE EXCISION REPAIR