V(D)J recombinations: germline
V(D)J РЕКОМБИНАЦИИ: ЗАРОДЫШЕВАЯ ЛИНИЯ
From lymphocytes to sharks: V(D)J recombinase moves to the germline David B Roth Genome Biology 2000 1(2): reviews1014.1-1014.4 http://genomebiology.com/2000/1/2/reviews/1014/
Иммунная система позвоночных использует широкий спектр антиген-специфичных рецепторов - иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов - чтобы распознавать и нейтрализовать чужеродные в-ва. Необходимо большое разнообразие рецепторов, чтобы распознавать почти безграничную универсальность потенциальных патогенов, которое достигается с помощь сайт-специфичных перестроек ДНК , называемых V(D)J рекомбинацией. Эти уникальные реакционные ансамбли рецепторных генов из отдельных V, D и J генных сегментов в основном ограничены лимфоцитами на определенной стадии их развития. Предполагается, что ДНК зародышевой линии данного организма должна содержать неперестроенные рецепторные гены; перестроенные версии генов должны существовать только в лимфоцитах. Это подтверждено на разных семействах позвоночных, включая мышей, человека, птиц и домашних животных (Рис.1.) \| V(D)J recombination occurs in several steps (Рис.2.) \| Transposition catalyzed by the RAG proteins	Рекомбинационная кухня (machinery) распознает последовательности ДНК, называемые recombination signal sequences (RSSs) , соседствующие с каждым генным сегментом. Каждый RSS состоит из законсервированного гептамера и nonamer мотивов, разделенных 12- или 23-нуклеотидными 'spacer' последовательностями. Рекомбиназа складывается из двух белков, RAG-1 и RAG-2, которая вместе с неспецифическими ДНК-связывающими белками, HMG-1 или HMG-2, распознает RSS и катализирует сайт-специфическое расщепление ДНК. Расщепление нуждается как в RAG-1, так и RAG-2, и ко-экспрессия этих белков, как полагают, огранична развивающимися лимфоцитами. Как показано на Рис. 1, RAG белки вызывают разрыв двойной нити ДНК точно между V, D или J кодирующими последоваельностями и RSS образуют концы ДНК двух типов: тупые сигнальные концы (которые заканчиваются в RSS) и ковалентно запечатанные (шпилька) кодирующие концы (которые заканчиваются в V, D или J элементе). После расщепления, два сигнальных конца соединяются, продуцируя сигнальное соединение. Перед соединением кодирующих концов шпильки д.б. открыты; соединение, образуемое кодирующими концами м. характеризоваться потерей или добавлением нуклеотидов. Точные детали процессинга концов и реакции соединения неясны; однако, ясно, что в процесс вовлечены множественные неспецифичные для лимфоидной ткани белки репарации ДНК. Одна важная деталь, что открытие шпилек часто происходит 'off center', это ведет к образованию палиндромных однонитевых концов. Соединение этих концов м. давать характерные signature в законченных соединениях: палиндромные или P нуклеотидные, инсерции. Другой тип соединительных вставок, N (non-templated) нуклеотидов, добавляется случайно с помощью энзима терминальной deoxynucleotidyl transferase. Т. обр., кодирующие соединения формируемые с помощью V(D)J рекомбинации имеют несколько отличающих их характеристик, включая вариабельную потерю нуклеотидов и часто присутствие или N нуклеотидов или P нуклеотидов или обоих. V(D)J рекомбинация обнаруживает четкие параллели с перемещением определенных мобильных элементов. Фактически недавние биохим. эксперименты показали, что очищенные белки RAG м. катализировать транспозицию в test tube, интегрируя ДНК фрагмент, несущий сигнальные концы в duplex-мишень (Рис 2). Эта реакция не нуждается в специфических последовательностях в ДНК мишени и, подобно многим реакциям транспозиции, создает характерные отпечатки 'footprint': после интеграции три из пяти нуклеотидов в ДНК мишени удвоены на каждой из сторон транспозона. Следует отметить, что имеется доказательство того, что RAG-обусловленная транспозиция м. происходить в живых клетках. Surprises from sharks и skates Сначала предполагалось, что система V(D)J рекомбинации м. возникнуть в результате случайной интеграции мобильного элемента в родоначальный антиген-рецепторный ген. Эта гипотеза нашла подтверждение с открытием, что RAG гены тесно сцеплены и что RAG белки м. дейстовать как transposase. Т.обр., наиболее правдоподобной моделью появления системы V(D)J рекомбинации во время эволюции позвоночных, является интеграция мобильного элемента, несущего сцепленные RAG гены, в примордиальный антиген-рецепторный ген у предшественников jawed позвоночных, примерно 450 миллионов лет тому назад. Вероятно, эта инициальная интеграция создала первый антиген-рецепторный ген; последующие события удвоений генов создали множественные иммуноглобулиновые и Т-клеточных рецепторов локусы. Иммуноглобулиновые локусы хрящевых рыб, акул и скатов, содержат некоторые довольно типичные гены антител с множественными V, D и J элементами. Однако, большинство иммуноглобулиновых генов уже частично или полностью перестроены в зародышевой линии. Недавно, pre-rearranged иммуноглобулиновые гены обнаружены также у рыб teleost, the channel catfish. Как возникли эти pre-rearranged гены? С одной стороны, они м.б. производными родоначальных антиген-рецепторных генов еще до интеграции мобильного элемента. С др. стороны, эти гены м. возникнуть в результате RAG-обусловленной перестройки ДНК , которая произошла в зародышевой линии, что противоречит общепринятому мнению, что RAG recombinase функциональна только в развивающихся лимфоцитах. У nurse акул гены семейства легких цепей NS4 immunoglobulin показывают существование нескольких высоко гомологичных генов как в pre-rearranged, так и unrearranged формах. Это позволило оценить последовательности генов в деталях, чтобы понять несут ли они характерные признаки V(D)J рекомбинации или footprints транспозиций. Установлено, что pre-rearranged гены в самом деле содержат tell-tale признаки кодирующих соединений, формируемых с помощью V(D)J рекомбинации, включая как N так и P нуклеотиды, которые строго подтверждают промежуточные структуры шпилек. Наличие этих признаков в нескольких соединениях подтверждает, что произошло несколько независимых событий V(D)J рекомбинации в зародышеовй линии, хотя события эти нечасты. Анализ unrearranged NS4 генов не выявил мишеней сайтов удвоений, которые являются признаками инсерций транспозонов. Т. обр., в то время как pre-rearranged NS4 гены, по-видимому, происходят из unrearranged генов с помощью V(D)J рекомбинации в зародышевой линии, но нет доказательств в пользу гипотезы, что unrearranged гены м. произойти из pre-rearranged генов в результате инсерции моблильного элемента. Исследования nurse shark NS4 генов строго подтверждают, что V(D)J рекомбинация м. происходить в зародышевой линии. Более того, филогенетический анализ показывает, что эти события происходили недавно, в течение последних 7 миллионов лет. Каковы же выгоды таких событий? Pre-rearranged иммуноглобулиновые гены м. создавать определенные преимущества по сравнению с генами, которые еще должны быть собраны с помощью рекомбинации в индивидуальных лимфоцитах. Напр., pre-rearranged гены м. кодировать рецепторы, способные распознавать наиболее распространенные патогены уже во время неонатального периода, до формирования полного репертуара перестроенных рецепторов антигенов. Более того, соединения в зародышевой линии м. вносить вклад в эволюцию кластеров генных сегментов и возможно в эволюцию D сегментов. Could the V(D)J recombinase aid the generation of evolutionary diversity on a genome-wide scale? Хотя о ко-экспрессии RAG белков вне лимфоидной системы не сообщалос. но РНК, кодирующая RAG-1 и RAG-2 выявлена в овариях рыбок данио и ооцитах Xenopus. Даже если recombinase обычно не экспрессируется в этих тканях, экспрессия м. происходить случано при репрограммировании ткане-специфичесой экспрессии генов во время развития. Если экспрессия RAG происходит во время развития зародшевых клеток, то возникает вопрос, как локусы выбираются для престройки? Во время нормальной дифференцировки B-лимфоцитов, иммуноглобулиновые локусы подвергаются серии хорошо оркестрированных перестроек. D в J перестройки генов тяжелой цепи происходят первыми, за ними следуют V в DJ перестройки, сопровождаемые в свою очередь перестройкой генов легкой цепи. Перестройки генов Т-клеточных рецепторов в развивающихся Т-лимфоцитах следуют тем же путем. Тщательно упоядоченные последовательности перестроек являются критическими для собственно дифференцировки лимфоцитов и, как полагают, контролируются за счет доступности локусов, обусловленной изменениями в структуре хроматина . RSSs присутствующие в антиген-рецепторных локусах, которые не задейстовованы в качестве мишеней для перестройки используются редко, если вообще используются. Тщательный контроль за доступностью локусов м. и не использоваться в зародышевых клетках, т.к. в этих клетках не поддерживается активность RAG recombinase. Более того, V(D)J recombinase не особенно разбирается в последовательностях, которые д.б. выбраны для перестройки. Было установлено, что 'cryptic' сайты, способные поддерживать перестройку появляются по крайней мере однажды на 600 пар оснований обычно используемых плазмидных последовательностей и что необходимо по крайней мере 10 миллионов таких сайтов в геноме млекопитающих. Фактически, имеются доказательства, что cryptic сайты в геноме млекопитающих м. служить в качестве мишеней для RAG-обусловленной перестройки в лимфоцитах. Следовательно, возможно, что экспрессия RAG во время развития зародышевых клеток м. вызывать перестройки областей генома далеко отстоящих от иммунных рецепторных локусов. Значит V(D)J recombinase могла (и все еще остается) существенной для эволюции позвоночных за счет катализа V(D)J-подобных перестроек и, вообще, транспозиций.

Рекомбинационная кухня (machinery) распознает последовательности ДНК, называемые recombination signal sequences (RSSs) , соседствующие с каждым генным сегментом. Каждый RSS состоит из законсервированного гептамера и nonamer мотивов, разделенных 12- или 23-нуклеотидными 'spacer' последовательностями. Рекомбиназа складывается из двух белков, RAG-1 и RAG-2, которая вместе с неспецифическими ДНК-связывающими белками, HMG-1 или HMG-2, распознает RSS и катализирует сайт-специфическое расщепление ДНК. Расщепление нуждается как в RAG-1, так и RAG-2, и ко-экспрессия этих белков, как полагают, огранична развивающимися лимфоцитами. Как показано на Рис. 1, RAG белки вызывают разрыв двойной нити ДНК точно между V, D или J кодирующими последоваельностями и RSS образуют концы ДНК двух типов: тупые сигнальные концы (которые заканчиваются в RSS) и ковалентно запечатанные (шпилька) кодирующие концы (которые заканчиваются в V, D или J элементе). После расщепления, два сигнальных конца соединяются, продуцируя сигнальное соединение. Перед соединением кодирующих концов шпильки д.б. открыты; соединение, образуемое кодирующими концами м. характеризоваться потерей или добавлением нуклеотидов.

Точные детали процессинга концов и реакции соединения неясны; однако, ясно, что в процесс вовлечены множественные неспецифичные для лимфоидной ткани белки репарации ДНК. Одна важная деталь, что открытие шпилек часто происходит 'off center', это ведет к образованию палиндромных однонитевых концов. Соединение этих концов м. давать характерные signature в законченных соединениях: палиндромные или P нуклеотидные, инсерции. Другой тип соединительных вставок, N (non-templated) нуклеотидов, добавляется случайно с помощью энзима терминальной deoxynucleotidyl transferase. Т. обр., кодирующие соединения формируемые с помощью V(D)J рекомбинации имеют несколько отличающих их характеристик, включая вариабельную потерю нуклеотидов и часто присутствие или N нуклеотидов или P нуклеотидов или обоих.

V(D)J рекомбинация обнаруживает четкие параллели с перемещением определенных мобильных элементов. Фактически недавние биохим. эксперименты показали, что очищенные белки RAG м. катализировать транспозицию в test tube, интегрируя ДНК фрагмент, несущий сигнальные концы в duplex-мишень (Рис 2). Эта реакция не нуждается в специфических последовательностях в ДНК мишени и, подобно многим реакциям транспозиции, создает характерные отпечатки 'footprint': после интеграции три из пяти нуклеотидов в ДНК мишени удвоены на каждой из сторон транспозона. Следует отметить, что имеется доказательство того, что RAG-обусловленная транспозиция м. происходить в живых клетках.

Surprises from sharks и skates

Сначала предполагалось, что система V(D)J рекомбинации м. возникнуть в результате случайной интеграции мобильного элемента в родоначальный антиген-рецепторный ген. Эта гипотеза нашла подтверждение с открытием, что RAG гены тесно сцеплены и что RAG белки м. дейстовать как transposase. Т.обр., наиболее правдоподобной моделью появления системы V(D)J рекомбинации во время эволюции позвоночных, является интеграция мобильного элемента, несущего сцепленные RAG гены, в примордиальный антиген-рецепторный ген у предшественников jawed позвоночных, примерно 450 миллионов лет тому назад. Вероятно, эта инициальная интеграция создала первый антиген-рецепторный ген; последующие события удвоений генов создали множественные иммуноглобулиновые и Т-клеточных рецепторов локусы.

Иммуноглобулиновые локусы хрящевых рыб, акул и скатов, содержат некоторые довольно типичные гены антител с множественными V, D и J элементами. Однако, большинство иммуноглобулиновых генов уже частично или полностью перестроены в зародышевой линии. Недавно, pre-rearranged иммуноглобулиновые гены обнаружены также у рыб teleost, the channel catfish.

Как возникли эти pre-rearranged гены? С одной стороны, они м.б. производными родоначальных антиген-рецепторных генов еще до интеграции мобильного элемента. С др. стороны, эти гены м. возникнуть в результате RAG-обусловленной перестройки ДНК , которая произошла в зародышевой линии, что противоречит общепринятому мнению, что RAG recombinase функциональна только в развивающихся лимфоцитах. У nurse акул гены семейства легких цепей NS4 immunoglobulin показывают существование нескольких высоко гомологичных генов как в pre-rearranged, так и unrearranged формах. Это позволило оценить последовательности генов в деталях, чтобы понять несут ли они характерные признаки V(D)J рекомбинации или footprints транспозиций. Установлено, что pre-rearranged гены в самом деле содержат tell-tale признаки кодирующих соединений, формируемых с помощью V(D)J рекомбинации, включая как N так и P нуклеотиды, которые строго подтверждают промежуточные структуры шпилек. Наличие этих признаков в нескольких соединениях подтверждает, что произошло несколько независимых событий V(D)J рекомбинации в зародышеовй линии, хотя события эти нечасты. Анализ unrearranged NS4 генов не выявил мишеней сайтов удвоений, которые являются признаками инсерций транспозонов. Т. обр., в то время как pre-rearranged NS4 гены, по-видимому, происходят из unrearranged генов с помощью V(D)J рекомбинации в зародышевой линии, но нет доказательств в пользу гипотезы, что unrearranged гены м. произойти из pre-rearranged генов в результате инсерции моблильного элемента.

Исследования nurse shark NS4 генов строго подтверждают, что V(D)J рекомбинация м. происходить в зародышевой линии. Более того, филогенетический анализ показывает, что эти события происходили недавно, в течение последних 7 миллионов лет. Каковы же выгоды таких событий? Pre-rearranged иммуноглобулиновые гены м. создавать определенные преимущества по сравнению с генами, которые еще должны быть собраны с помощью рекомбинации в индивидуальных лимфоцитах. Напр., pre-rearranged гены м. кодировать рецепторы, способные распознавать наиболее распространенные патогены уже во время неонатального периода, до формирования полного репертуара перестроенных рецепторов антигенов. Более того, соединения в зародышевой линии м. вносить вклад в эволюцию кластеров генных сегментов и возможно в эволюцию D сегментов.

Could the V(D)J recombinase aid the generation of evolutionary diversity on a genome-wide scale?

Хотя о ко-экспрессии RAG белков вне лимфоидной системы не сообщалос. но РНК, кодирующая RAG-1 и RAG-2 выявлена в овариях рыбок данио и ооцитах Xenopus. Даже если recombinase обычно не экспрессируется в этих тканях, экспрессия м. происходить случано при репрограммировании ткане-специфичесой экспрессии генов во время развития.

Если экспрессия RAG происходит во время развития зародшевых клеток, то возникает вопрос, как локусы выбираются для престройки? Во время нормальной дифференцировки B-лимфоцитов, иммуноглобулиновые локусы подвергаются серии хорошо оркестрированных перестроек. D в J перестройки генов тяжелой цепи происходят первыми, за ними следуют V в DJ перестройки, сопровождаемые в свою очередь перестройкой генов легкой цепи. Перестройки генов Т-клеточных рецепторов в развивающихся Т-лимфоцитах следуют тем же путем. Тщательно упоядоченные последовательности перестроек являются критическими для собственно дифференцировки лимфоцитов и, как полагают, контролируются за счет доступности локусов, обусловленной изменениями в структуре хроматина . RSSs присутствующие в антиген-рецепторных локусах, которые не задейстовованы в качестве мишеней для перестройки используются редко, если вообще используются.

Тщательный контроль за доступностью локусов м. и не использоваться в зародышевых клетках, т.к. в этих клетках не поддерживается активность RAG recombinase. Более того, V(D)J recombinase не особенно разбирается в последовательностях, которые д.б. выбраны для перестройки. Было установлено, что 'cryptic' сайты, способные поддерживать перестройку появляются по крайней мере однажды на 600 пар оснований обычно используемых плазмидных последовательностей и что необходимо по крайней мере 10 миллионов таких сайтов в геноме млекопитающих. Фактически, имеются доказательства, что cryptic сайты в геноме млекопитающих м. служить в качестве мишеней для RAG-обусловленной перестройки в лимфоцитах. Следовательно, возможно, что экспрессия RAG во время развития зародышевых клеток м. вызывать перестройки областей генома далеко отстоящих от иммунных рецепторных локусов. Значит V(D)J recombinase могла (и все еще остается) существенной для эволюции позвоночных за счет катализа V(D)J-подобных перестроек и, вообще, транспозиций.

From lymphocytes to sharks: V(D)J recombinase moves to the germline

Surprises from sharks и skates

Could the V(D)J recombinase aid the generation of evolutionary diversity on a genome-wide scale?