|
ORIGINAL RESEARCH PAPER Skok, J. A. et al. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature Immunol. 2, 848-854 (2001). | Article | | WEB SITE |
Во время развития B клеток сегменты иммуноглобулинового гена - variable (V), diversity (D) and joining (J) - рекомбинируют для образования функциональных иммуноглобулиновых генов, генерируя различные репертуары В клеток. Регулируемая экспрессия генов, активирующих рекомбинацию, ( и ) во время развития B клеток гарантирует, что каждая В клетка будет экспрессировать одиночную тяжелую цепь ( ) и одиночную легкую цепь ( или аллель, феномен, известный как allelic exclusion. Skok et al. получили первые доказательства того, что эпигенетические механизмы должны усиливать моноаллельную экспрессию иммуноглобулиновых генов на поздних стадиях.
Известно, что многие неактивные гены локализуются в центромерном гетерохроматине в ядре активно делящихся лимфоцитов, в ассоцииации с (ДНК-связывающим белком, который существенен для развития B и T клеток). Это ведет к предположению, что рекрутирование локусов гетерохроматических доменов м. вести к наследуемому молчанию (silencing) генов. Выявленя трехмерная локализация в ядре иммуноглобулиновых аллелей в зрелых В клетках.
Отдыхающие первичные B клетки стимулировали к пролиферации, обусловливая тем самым рекрутирование Ikaros в гетерохроматиновые области. Почти во всех наблюдаемых клетках один IgH аллель был ассоциирован с Ikaros-содержащим центромерными домененами. Сходным образом, 3 из 4-х возможных аллелей легкой цепи были центромерными. Напротив, ни один из IgH аллелей не был обнаружен в ассоциации с центромерным доменом в предшественниках клонов В клеток. Это указывает на то, что неэквивалентная ядерная локализация иммуноглобулиновых аллелей необходима во время развития В клеток. Используя специфические мРНК зонды авт. подтвердили, что зрелые В клетки экспрессируют только один аллель, который является нецентромерным аллелем.
В терминах транскрипции, центромеры являются относительно неактивными областями ядра. Авт. предполагают, что во время пролиферации В клеток привлечение в центромеру иммуноглобулиновых аллелей исключено, что помогает держаться им свободно - поддерживая моноспецифичность клона В клеток.
Процесс рекомбинации V(D)J —, с помощью которого собираются вариабельные домены иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов —, осуществляется с помощью упорядоченной серии ступеней. Одна из них - формирование DNA hairpins на 'кодирующих' концах variable (V), diversity (D) или joining (J) элементов. Эти hairpins (шпильки) последовательно открываются и свободные концы ДНК склеиваются с помощью non-homologous end joining (NHEJ) пути.
|
ORIGINAL RESEARCH PAPER Ma, Y. et al. Cell 2002 March 1 (DOI 10.1016/S0092867402006712) |
Процесс рекомбинации V(D)J —, с помощью которого собираются вариабельные домены иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов —, осуществляется с помощью упорядоченной серии ступеней. Одна из них - формирование DNA hairpins на 'кодирующих' концах variable (V), diversity (D) или joining (J) элементов. Эти hairpins (шпильки) последовательно открываются и свободные концы ДНК склеиваются с помощью non-homologous end joining (NHEJ) пути.
Хотя т.наз. 'RAG complex', как известно, генерирует hairpins, однако фактор, который его открывает неуловим. Однако Klaus Schwarz, Michael Lieber и др. идентифицировали этот фактор назвав его . Они показали, что Artemis регулируется с помощью компонента пути NHEJ — каталитической субъединицы ДНК-зависимой протеин киназы ().
Мыши без DNA-PKcs обнаруживают чрезвычайно сходный фенотип с клетками человека, в которых отсутствует Artemis. Авторы показали, что DNA-PKcs и Artemis образуют комплекс in vitro и in vivo.
Т.к. DNA-PKcs является киназой, то было показано, что она м. фосфорилировать Artemis. Они нашли, что Artemis сам по себе является 5' to 3' exonuclease; т.е., он обкусывает однонитчатую ДНК с 5' конца. Добавление DNA-PKcs, однако, резко меняет эту активность — Artemis становится endonuclease, с предпочтением расщеплять внутри ДНК соединения однонитчатой/двунитчатой ДНК.
Мыши без DNA-PKcs или Artemis не могут заканчивать ступень hairpin-opening V(D)J рекомбинации. Хотя в одиночестве Artemis не оказывает влияния, в присутствии же DNA-PKcs он способен расщеплять и открывать шпильки и как киназная активность DNA-PKcs так и ее физическое присутствие в комплексе с Artemis необходимы для этого эффекта.
Кислотный тест предпринят для определения м. ли DNA-PKcs–Artemis открывать шпильки, образуемые RAG комплексом. Во всех трех экспреиментальных конфигурациях авт. обнаружили открытие шпилек. Др. словами, "this is the first efficient opening of RAG-generated hairpins by any vertebrate nuclease in Mg2+-containing solutions".
Разрешив две загадки V(D)J рекомбинации — идентифицировав hairpin-opening активность и физиологический субстрат для DNA-PKcs — авт. пролили свет на механизм NHEJ. Хотя отсутствует потребность в hairpin-opening активности в этом процессе, обнаруженная роль DNA-PKcs–Artemis в процессинге ДНК перевешивает мнение, что она должна облегчать ligation концов ДНК. Комплекс DNA-PKcs–Artemis вовлекается, следовательно, не только в образование иммуноглобулинов и T-cell-рецепторов, но и в ответ на разрывы двойной нити ДНК.
Рекомбинации соматической ДНК существенны для продукции функциональных антигенов рецепторных генов в Т и В лимфоцитах, но они уникальны для иммунной системы. Здесь соматические перестройки ДНК продуцируют зрелые гены, кодирующие Т-клеточные рецепторы и иммуноглобулины соответственно. Этот процесс известный как V(D)J рекомбинация ответственнен за столь удаленные непараллельные степени иммунологических различий. Недавние исследования показали, что гены, связанные с рекомбинацией, необходимы также для нормального развития нейронов. Получены косвенные указания, что делеция генов, участвующих в негомологичном соединении концов ДНК по типу V(D)J рекомбинации, ведет к ранней эмбриональной гибели нейронов. Делеция гена, кодирующего ДНК лигазу IV или его партнера по димеризации XRCC4, дает одинаковый фенотип гибели нейронов, затем эмбрионов.
V(D)J рекомбинация в лимфоцитах
V(D)J рекомбинация обеспечивает образование функциональных антигенных рецепторных генов из фрагментов, которые разделены в геноме зародышевой линии. Это происходит в 2 этапа с использованием разных белков (рис).
Jrec.gif)
На первом этапе рекомбиназные белки, кодируемые генами RAG1 и RAG2 расщепляют ДНК сайт-специфическим образом рядом с сегментами гена, необходимыми для рекомбинации, давая разрыва двойной нити. На втором этапе концы ДНК подвергаются процессингу и соединяются, причем происходит сборка сегментов гена в функциональный иммуноглобулиновый или Т-клеточнй рецепторный ген.
В результате V(D)J рекомбинации сегменты гена зародышевой линии сводятся вместе и дают зрелый ген, кодирующий антигенный рецептор Т клеток и В клеток - Т-клеточны рецепторы и иммуноглобулины, соответственно. 2 ступени м.б. распознанны% сайт-специфическок расщепление ДНК с помощью Rag1 и Rag2 и соединение расщепленных сегментов с помощью механизма соединения негомологичных концов с помощью ДНК лигазы IV и XRCC4.
На первом этапе рекомбиназные белки, кодируемые генами RAG1 и RAG2 расщепляют ДНК сайт-специфическим образом рядом с сегментами гена, необходимыми для рекомбинации, давая разрыва двойной нити. На втором этапе концы ДНК подвергаются процессингу и соединяются, причем происходит сборка сегментов гена в функциональный иммуноглобулиновый или Т-клеточнй рецепторный ген.
Реакция соединения концов ДНК зависит от факторов соединения негомологичных концов, которые включают XRCC4-лигаза IV гетеродимер, Ku белок, гетеродимер, состоящий из субъединиц Ku70 и Ku80, и ДНК-зависимой протеин киназы. V(D)J рекомбинация происходит только в лимфоцитах и является фундаментальной движущей силой для множественных селективных процессов, которые элиминируют несоответствующие лимфоциты. Примером клеточной избирательности м. служть тимус, где подавляющее большинство Т клеток погибает из-за специфичности их поверхностных Т-клеточных рецепторов, возникающей в результате V(D)J рекомбинации.
Существуют ли гены иммунологической V(D)J рекомбинации в нервной системе? Низкие уровни экспрессии RAG1 обнаружены в нейрогенных областях (вентрикулярной зоне), хотя КФП2 не выявлена, а нулевые мутанты по RAG1 не дают нарушений фенотипа головного мозга.
Мыши, дефицитные по ДНК лигазе IV или ее партнеру по димеризации XRCC4 имеют аномальный паттерн гибели клеток в коре. В головном мозге мутантных мышей только что возникшие постмитотические нейроны начинают подвергаться апоатозу, как только покидают вентрикулярную зону и гибнут не достигнув кортикальной пластинки особенно в промежуточной зоне. Это происходит во всех бластях нервной трубки, включая впинной мозг. Это происходит на 13 день эмбриогенеза, когда генерируется большинство постмиттотических нейронов. Однако некоторые нейроны нечувствительны к повреждающим эффектам.
Помимо нарушений соединения негомологичных концов существует и другое возможное объяснение, что лигаза IV и XRCC4 участвуют в других процессах, важных для возникновения мутантных фенотипов. Мутантные по lig4 дрожжи обнаруживают аномальную реакцию на сигналы, контролирующие клеточный рост.
Пока это единственное указание на то. что гены необходимые для V(D)J рекомбинации необходимы для раннего выживания нейронов.