Autophagy

Аутофагия - путь деградации, при котором часть цитозоля поступает в пузырьки (аутофагосомы) и высвобождается в вакуоли для переработки (Kim J. Klionsky D.J. Annu. Rev.Biochem. 2000. V.69. P.303-342)
Стрессовые условия вызывают рад специализированных реакций в эукариотических клетках. Чтобы пережить пишевую недостаточность клетки должны быстро молилизовать транспорт необязательного цитоплазматического материала к принципиальным органеллам, связанным с деградацией, вакуолям/лизосмам, для переваривания и повторного использования в важных биосинтетических процессах. Уровень внутриклеточной деградации возрастает драматически, когда клетки определяют наступление голодания, более 85% деградации обеспечивается вакуолярным протеолизом. Устойчивое голодание обусловливает оборот почти половины всех клеточных белков в вакуоль.
Цитоплазматический материал поступает внутрь состоящих из двойных мембран пузырьков (аутофагосом). Слияние наружной мембрнаы пузырька с вакуолью ведет к высвобождению внутреннего, состоящего из одиночной мембраны аутофагического тела, в просвет вакуоли (Рис.). Последующий разрыв аутофагического тела гидролазами вакуоли ведет к перевариванию и рециклингу цитоплазматического содержимого. Этот процесс перекрывается с путем cytoplasm to vacuole targeting (Cvt), который используюется для высвобождения резидентной гидролазы aminopeptidase I (API). Путь Cvt обнаруживает общие механистические свойства с аутофагией. включая образования пузырьков с двойными мембранами и разрыв пузырька в вакуоли (Cvt тела). Следовательно, предшественники API (prAPI) используют Сме путь в обычных условиях и путь аутофагии во время голодания. | (a) Молекулярные взаимодействия между компонентами аутофагии. Apg5p, 10p и 16р составляют autophagy (Apg) conjugation system. (B) Модель связывания с мембраной Aut7p в контексте транспорта prAPI. Сначала Aut7p синтезируется в цитозоле и постепенно расщепляется Aut2p-зависимым способом. Затем Aut1p и Apg conjugation system взаимодействуют с Aut7p, чтобы облегчить его соединени е с мембраной.

Для формирования пузырьков необходима Apg conjugation система, представленная Apg5p, Apg7p, Apg10p, Apg12p и Apg16p. Apg7p гомологичен E1 ubiquitin activating enzyme Uba1p. Через гидролиз АТФ Apg7p формирует thioester мостик с Apg12p. Активированный Apg12p затем переносится на Apg10p, протеин конъюгирующий энзим, и наконец образуется ковалентная изопептидная связь с Apg5p. Apg16p необходим для образования мультимерного комплекса с Apg12p-Apg5p конъюгатом.
Аутофагосомы существенно больше Сме пузырьков. Недавние исследования идентифицировали Aut7p в качестве первого компонета, участвующего в локализации в Cvt пузырьках и аутофагосомах. AUT7 алелен гену APG8/CVT5, а мутанты aut7 дефектны в отношении ступени формирования пузырьков. Процесс образования пузырьков нуждается в функции белка Aut7, индуцируемого голоданием, который поступает из цитозоля в формирующиеся аутофагосомы. Связанный с мембранами Aut7p представляет раннюю ступень образования пузырьков Cvt и аутофагосом. После синтеза в цитозоле Aut7p протеолитически расщепляется Aut2p-зависимым способом. Это событие существенно для связывания Aut7p с мембраной. Затем Aut7p взаимодействует с Aut1p и Apg конъюгационным комплексом до поступления в мембраны. Это последнее взаимодействие и обеспечивает поступление Aut7p в мембрану.
Критической ступенью в формировании пузырьков является рекрутирование растворимых факторов оболочки пузырьков, чтобы найти мембраны. Сборка пузырьков нуждается в инициальном поступлении малой ГТФазы (ARF1.GTP) на target мембраны, реакции катализируемой фактором обмена нуклеотидов. Это сопровожадется привлечением предварительно собранного coatomer комплекса на мембранах через прямое взаимодействие с мемьбран-связанным ARF1.GTP. Кроме того, цитоплазматичекие домены интегральных мембрнных белков семейства р24 взаимодействуют с coatomer субъединицами. Этот тримерный комплекс ARF, coatomer и р24 и составляют молекулярную основу для деформации мембраны и отпочковывания пузырьков.

MOLECULAR DISSECTION OF AUTOPHAGY: TWO UBIQUITIN-LIKE SYSTEMS

Yoshinori Ohsumi
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 211 -216 (2001)

(Рис.1.) Electron microscopic images of autophagy in yeast.


(Рис.2.) Two ubiquitin-like systems are required for autophagy.


(Box.1) Lysosomal/vacuolar degradation systems


(Box.2) The cytoplasm-to-vacuole-targeting pathway
Анализ генов, необходимых для autophagy, - внутриклеточной массовой деградации белков - выявил две ubiquitin-подобные системы, обе участвуют в процессе динамики мембран.
Установлено, что клетки голодающих дрожжей направляют свою собственную цитоплазму в вакуоли посредством аутофагических тел. ЭМ исследование показало, что эти тела образуют структуры из двойных мембран, называемые autophagosome, которые последовательно сливаются с вакуолями и лизомами. В целом этот процесс топологически тот же самый, что и у млекопитающих.
Поиск дрожжей, дефектных по autophagy, выявил два набора генов, APG и AUT, соотв. Специфический биосинтетический путь вакуольных энзимов нуждается в cytosol-to-vacuole-targeting (CVT) генах. Имеется значительное перекрывание между генами CVT и APG/AUT генов. Все apg мутанты имеют дефекты образования аутофагосом до или во время процесса.
Открыты две ubiquitin-подобные системы: первая - Apg12 conjugation система - уникальна тем, что Apg12 синтезируется уже как зрелая форма; очевидно, что сейчас имеется одна мишень, Apg5, и в steady состоянии почти все молекулы Apg12 конъюгируют с Apg5.
Вторая - Apg8/Aut7 - процесс идет на их С-терминальных областях с помощью Aut2/Apg4. Apg8 существует в двух формах, одна из которых связана с мембраной посредством фосфолипида. Этаlipidation обеспечивается с помощью ubiqutin-подобной системы; Apg8 активруется с помощью Apg7 и переностся на Apg3 и, наконец, образует конъюгат с phosphatidylethaolamine (PE). Apg4 расщепляет Apg8-PE, высвобождая Apg8 из мембраны.
Показано, что Apg8 локализуется на мембране промежуточных структур autophagosome; временных ассоциаций, по-видимому, обязательных для образования autophagosome.
Как Apg12, так и Apg8 высоко законсервированы, имеют гомологов у червей, млекопитающих и растений. У высших эукариот Apg8 представлен мультигенным семейством.



C. He, Y. Wei, K. Sun, B. Li, X. Dong, Z. Zou, Y. Liu, L. N. Kinch, S. Khan, S. Sinha, R. J. Xavier, N. V. Grishin, G. Xiao, E.-L. Eskelinen, P. E. Scherer, J. L. Whistler, B. Levine, Beclin 2 functions in autophagy, degradation of G protein-coupled receptors, and metabolism. Cell 154, 1085–1099 (2013).
Аутофагосомы сливаются с лизосомами и их содержание может перерабатываться в строительные блоки для новых белков и органелл. Некоторые гены, связанные с аутофагией были охарактеризованы от дрожжей до человека, включая Beclin 1. He et al. идентифицировали связанный с аутофагией ген Beclin 2 и установили, что он необходим не только для аутофагии, но и также для лизосомной деградации G protein-coupled receptors (GPCRs). He et al. идентифицировали Beclin 2 на базе го гомологии с Beclin 1. Подобно Beclin 1, Beclin 2 соединяется с несколькими др. ассоциированными с аутофагией белками и необходим для деградации sequestrosome 1 (также известной как p62) и lipidation и накопления ассоциированного с микротрубочками белка LC3 в аутофагосомах в ответ на голодание. siRNA-резистентная мРНК, кодирующая Beclin 2, устраняет дефекты аутофагии, возникающие в результате нокдауна Beclin 2, но не нокдауна Beclin 1, демонстрируя, что эти два белка функционально не перекрываются. Дрожжевой двугибридный скрининг с помощью N конца Beclin 2, который показал меньшую консервацию Beclin 1, идентифицировал GASP1 (GPCR-associated sorting protein 1). Совместная иммунопреципитация GASP1 из клеток человека и мыши подтвердила избирательность для Beclin 2 но не для Beclin 1. GASP1 необходим индуцируемой лигандом лизосомной деградации GPCRs, а нокдаун Beclin 2 предупреждает интернализацию и деградацию некоторых GPCRs. Избыточная экспрессия siRNA-резистентного дикого типа Beclin 2, но не I80S мутантного Beclin 2, который неспособен связывать GASP1, восстанавливало интернализацию и деградацию GPCR в клетках с нокдауном Beclin 2. Мутантный I80S Beclin 2 восстанавливает аутофагию в клетках с нокдауном Beclin 2, это согласуется с тем фактом, что GASP1 не нужен для аутофагии и предполагаются разные механизмы для ролей Beclin-2 в аутофагии и деградации GPCR. Клетки от мышей с биаллельной делецией beclin 2 обнаруживают пониженные уровни базовой и вызываемой голоданием аутофагии, хотя не в той же самой степени тяжести, как у мышей с моноаллельной делецией beclin 1. Напротив, головной мозг beclin 2+/- мышей обнаруживает повышенные количества cannabinoid receptor 1 (CB1R), GPCR, регулируемого с помощью GASP1, тогда как в головном мозге beclin 1+/- мышей этого не наблюдается. Избыточная активация CB1R у мышей способствует избыточному потреблению пищи, приводя к избыточному весу и диабету. of food, Сходным образом, beclin 2+/- мыши, потребляющие пищу с высоким содержанием жира, обнаруживают сходные симптомы, включая снижение толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину, если сравнивать с мышами дикого типа на той же самой диете. Гомологи Beclin 2 не обнаружены к позвоночных не млекопитающих. Принимая во внимание, что Beclin 1 не играет роли в гомеостазе GPCR, то это указывает, что скоординированная регуляция аутофагии и оборот GPCR является эволюционно новой функцией для семейства белков Beclin. Итак, эти находки показывают, что Beclin 2 обладает разными функциями в двух зависимых от лизосом процессах деградации, аутофагии и деградации GPCR.