|
|
|||||
|---|---|---|---|---|---|
|
Dixon, Worby и др.и дентифицировали у дрозофилы сортинг-белок, который после фосфорилирования тирозина, взаимодействует с адапторным белком Dock, важным для ведения фоторецепторных аксoнов.
| Авт. стабильно экспрессировали src-homology-2 (SH2) домен гена Dock в Drosophila S2 клетках и анализировали белки, которые комплексуются с ним. Из 5 белков белок в 63 kDa содержал N-терминальный SH3 домен, внутренний Phox homology (PX) домен, богатый пролином мотив и предсказываемый суперскрученный (coiled-coil) домен. Исходя из его гомологии с sorting nexin 9 человека, известного также как SH3PX1, белок в 63-kDa был переименовен в DSH3PX1. Взаимодействие между Dock и DSHPX1 происходит в основном посредством SH2 домена у Dock.
Т.к. др. сортинг nexins м. ассоциировать с некоторыми рецепторами клеточной поверхности, то Dixon и др. исследовали, может ли DSH3PX1 взаимодействовать с др.из 5 белков, найденных в комплексе Dock, названном Dscam - Drosophila ортолог человечьего Down Syndrome cell-adhesion molecule (DSCAM). Они обнаружили такое взаимодействие, но также показали, что Dock не нуждается для такой ассоциации в использовании RNA интерференции, чтобы элиминировать экспрессию Dock. Дальнейший анализ показал, что DSH3PX1 м. также взаимодейстовать с AP-50, членом комплекса AP-2, который распознает белки, которые предназначены к эндоцитозу с помощью покрытых клатрином ямок. Итак, DSH3PX1 м. функционировать, соединяя Dscam с белками этих ямок.
Dscam необходим для эмбрионального ведения аксонов. Используя полной длины DSH3PX1, авт. провели двугибридный поиск. Среди взаимодействующих белков был сам DSH3PX1, указывая тем самым, что он м. димеризоваться. Важнее, однако, был Wasp - регулятор актинового цитоскелета, с известной функцией в эндоцитозе - также был идентифицирован как позитивный партнер для связывания. Wasp содержит несколько доменов для межбелковых взаимодействий (Cdc42/Rac-binding (CRIB) домен, богатый пролином домен, два verprolin homology домена, cofilin homology домен, a pleckstrin homology домен и IQ домен), но взаимодействие с DSH3PX1 происходит посредством DSH3PX1's SH3 домена. Это согласуется с тем, что Wasp связывается с несколькими SH3- домен-содержащими белками посредством последовательностей, богатых пролином. Более того, не выявлено конкуренции между связыванием Wasp и Dock с DSH3PX1, это указывает на то, что DSH3PX1 м. взаимодействовать с Wasp посредством своего SH3 домена, а с Dock, используя SH2-домен.
Итак, сигнал ведения аксонов индуцирует фосфорилирование тирозина в DSH3PX1, что делает его способным ассоциировать с Dock. Dock, в свою очередь связывается с Dscam, так что через конъюгацию с AP-50 и Wasp, DSH3PX1 м.б. вовлечен в цитоскелетную перестройку, которая необходима для эндоцитоза Dscam. Таким образом рецепторы наведения на плазматической мембране будут подвергаться временному удалению - критический аспект ремоделирования ростового конуса.
|
|
Белки, такие как netrins привлекают конусы роста комиссуральных аксонов к срединной линии. Затем, как только они пересекут ее, то ростовые конусы подпадают под регулирующее действие Roundabout (Robo), чье взаимодействие со своим лигандом Slit вызывает отталкивание (repulsion). Известно, что ростовые конусы теряют свою привлекательность для netrin, как только они пересекут срединную линию, хотя они часто продолжают экспрессировать netrin рецепторы DCC. Stein and Tessier-Lavigne сообщили, что взаимодействие между Slit и Robo м.б. ключом к silencing этого притягивания (attraction).
Авт. подвергали спинальные нейроны от эмбрионов Xenopus ст. 22 воздействию Slit2 и netrin-1 in vitro. Они показали, что ростовые конусы привлекаются netrin-1, но это притягивание прекращается в присутствии Slit2. Неожиданно, ростовые конусы не отталкивались Slit2 и когда он один и когда в conjunction с netrin-1. Это подтверждает, что прекращение притягивания к netrin-1 не является просто суммой ответов конкурирующих привлекающих и отталкивающих сил. На ст. 28 ростовые конусы отталкиваются Slit2, но не привлекаются netrin-1.
Удаление цитоплазматических доменов у DCC или Robo предупреждает Slit2-обусловленное прекращение притягивания к netrin-1. С помощью конструирования химерных белков авт. показали, что молчание м.б. достигнуто даже тогда, когда Robo цитоплазматический домен активируется посредством разных эктодоменов, таких как Met, который связывает hepatocyte growth factor (известный также как scatter factor) скорее, чем Slit. Следовательно, молчание, по-видимому, обеспечивается активацией Robo скорее, чем через прямое взаимодействие между Slit2 и DCC. В самом деле, эксперименты по иммунопреципитации подтверждают, что Slit2способствует ассоциации Robo с DCC.
Stein и Tessier-Lavigne предполагают, что связывание Slit с Robo индуцирует конформационные изменения, которые делают способным цитоплазматический домен Robo взаимодейстовать с таковым DCC, тем самым прекращая притягивание между netrin-1 и его рецептором. Итак, активация Robo с помощью Slit2 будет ингибировать притяжение ростовых конусов к срединной линии и индуцировать их отталкивание прочь от нее, обеспечивая тем простое переключение, чтобы предупредить их от влияния конфликтных сигналов.
|