Nitric oxide (NO) важная мультифункциональная сигнальная молекула, участвующая в ряде физиологических и патофизиологических процессов. Высоко реактивные и корото живущие NO доольно быстро диффунедирующие агенты к молекулярными мишеням внутри и вне клеток. Помимо соудорасширяющего эффекта она оладает и др. функциями. В гладкомышечных клетках, кардиомиоцитах и скелетных мышечных волокнах выявляется экспрессия различных изоформ NOS.
В клетках млекопитающих NO синтезируется, по крайней мере тремя калмодулином активируемыми NO синтазами (NOS). L-аргинин и кислород существенные предшественники для синтеза Тщю Терминальный гуанидиновый азот L-аргинина высвобожадется во время конверсии в L-citrulline. Другими кофакторами являются NADPH, FAD, FMN, tetrahydrobiopterin (BH4), calmodulin и heme.
NOS изоформы представлены конституитивной нейрональной (nNOS)? индуцибельной (iNOS) и конституитивной эндотелиальной (eNOS). Каждая изоформа кодируется отдельным геном и экспрессируется в различных тканях и типах клеток. nNOS и eNOS участвуют в синтезе NO, вовлеченном во внутриклеточную передачу сигналов. iNOS играет роль в воспалительном процессе и росте опухолей, она регулируется на транскрипционном уровне многочисленными агентами, включая цитокины и эндоксины. Экспрессия nNOS и eNOS активируется повышением внутриклеточной конц. кальция [ Ca2+]i. Это событие регулируется связыванием калмодулина с конституитивной NOS, при этом инициируется перенос электрона с флавинов на гемовую половину энзима. Напротив, iNOS, как известно, связывается с калмодулином даже при низких физиологических конц. [ Ca2+]i, действуя исключительно как субъединица этой изоформы энзима.
|
ROLE OF NITRIC OXIDE SYNTHASES DURING CARDIOMYGENESIS
Устанровлено, что NO участвует не только в нейрональной дифференцировке, но оказывает общий антипролиферативный эффект на эмбриональных стадиях путем регулирования критического равновесия между пролиферацией и дифференцировкой клеток. Установлено, что iNOS и eNOS изоформы экспрессируются кардиомиоцитами во время эмбрионального развития сердца. Причем продукция NO играет важную роль кардиомиогенезе. Экспрессия iNOS и eNOS начинается на оченть ранних стадиях развития мышей/крыс (Е8.5) и остается постоянно до Е13.5. Затем их количество снижается в желудочках и в меньшей степени в предсердиях. Перед и после рождения обнаруживается слабая экспрессия eNOS, тогда как экспрессия iNOS едва определяется в желудочках. Меняются и энзимы NO-мишени, напр., soluble guanylylcyclase (sGC) и ее прямой реакционный продукт cGMP. Эти находки ясно демонстрируют, передача сигналов NOS происходит через sGC и cGMP путь скорее, чем непосредственно через ТЩ-опосредованную регуляцию транскрипции. В системе дифференцировки кариомиоцитов in vitro из embrionic stem (ES) экспрессия NOS имела тот же паттерн, что и в эмбриональном сердце мышей/крыс. Добавление ингибиторов NOS к культуре ES клеток вызывало серьезные нарушения миофибриллогенеза и значиетльное уменьшение окончательно дифференцированных кардимиоцитов. Ингибирование мишеней-энзимов sGC воспроизводило эффекты действия ингибиторов NOS. Анализировали регуляцию зависимого от напряжения (voltage) L-типа тока Ca 2+ (I Ca), как известно, крайне важного для кардиальных chronotropy и ionotropy. Во взрослом сердце I Ca активируется после генерации аденилил-циклазы (АС), увеличения цАМФ, протеин киназы А (РКА) и последующего фосфорилирования L-типа Ca 2+ канала (VDCC) или тесно ассоциированного белка. В этом контексте, β-адренорецепторами индуцированный позитивный ионотропный эффект обеспечивается посредством stimulatory G-белка (G s) посредством активации ICa, тогда как противодействующий мускариновый эффект обусловлен inhibitory pertussis toxin-sensitive G-белком (Gi) за счет депрессии АС. Было установлено, что β-адренэргичекая регуляция ICa строго депрессируется с помощью мускаринового агониста, такого как carbachol. Мускариновая депрессия ICa работает посредством Gi обусловленной генерации eNOS, sGC и phosphodiesterase 2 (PDE2), dspssdfz в результате снижение цАМФ и, наконец, редуцируя фосфорилирование VDCC. Функционгирование этой сложной регуляторной кухни базируется на постоянной актвации АС, которая присуствует в ранних кардиомиоцитах. Кроме того, конституитивная функциональная активность iNOS и сопутствующая супрессия ICa также обнаруживаются в ранних ардиомиоцитах. Параллельно с выраженным подавлением NOS-изоформ, начинающимся с Е14.5 происходит переключение регуляции ICa. На этой стадии β-адренэргическая регуляция становится интектной и идентичной ситуации в кардиомиоцитах взрослых желудочков при мускариновой депрессии ICa, необходимой для β-адренэргической престимуляции. Эти новые аспекты в переключении регуляции ICa во время эмбрионального развития имеют отношене к передаче сигналов NOS, а именно (1) генерация eNOS м. модулировать NO даже в присутствии постоянно активной iNOS, (2) eNOS м.б. активирована посредством Gi/o, (3) неспособность eNOS генерировать NO в окончательно детерминированных кардиомиоцитах объясняется отсуствием связи с мускариновой стимуляцией активации eNOS, и (4) ICa депрессия с помощью NO восстанавливается в условиях повышенной доступности NO.
NO-обусловленная депрессия I Ca обнаруживается сначала в сино-атриальных кардиомиоцитах и в клетках атрио-вентрикулярного узала. В этом случае, однако I Ca престимулируется с помощью β-flhtyjwtgnjkhyjuj агониста isoprenaline.
NOS ISOFORM EXPRESSION AND THE REGULATION OF ITS ACTIVITY IN CARDIOMYOCYTES
Transcriptional and Posttranscriptional Modulation of iNOS and eNOS Expresion
Помимо eNOS и iNOS в саркоплазматическом ретикулеме кардиомиоцитов выявлена изоформа nNOS. В отличие от раннего эмбриональнрого сердца iNOS не м.б. обнаружена в нормальном миокарде. Однако различные патофизиологические условия, такие как миокардит, кардиомиопатия и миокардиальная ишемия сопровождаются индукцией iNOS, тогда как eNOS присутствует в кардимиоцитах нормального миокрада. iNOS не завиист от преходящего Са2+ и калмодулина, по крайней мере в кардимиоцитах iNOS активность регулируется посредством консенсуса последовательностей сайтов для АР-1, GAS, GRE и NF-κB транскрипционных факторов на промоторе iNOS. Экспрессия INOS в дальнейшем регулируется с помощью транскрипционной и посттранскрипционной регуляции через такие факторы как LPS, Il1β, ШАТ-γ, TGF-β, Il-6, дексаметазон, остеопонтин, натрийуретический пептид, ангиотензин II, α- и β адренэргические агонисты, механическое натяжение и гипоксия. Цитокинами опосредованная регуляция, по-видимому, контролируется с помощью множественных чувствительных к цитокинам элементов, идентифицированных на промоторе iNOS. Цитокинами индуцированная экспрессия iNOS в дальнейшем модулируется с помощью различных внутриклеточных сигнальых молекул, включая протеин киназу С )РКС), цАМФ, РКАб wUVA-зависимубю протеин каиназу (PKG) и МАРК. Более того глюкокортикоиды и остеопонтин играют важную модулирующую роль.
Индукция iNOS мРНК обнаруживается в течение 4-6 ч, тогда как iNOS белок и родственные активности обнаруживаются после 6 ч. Интересно, что транскрипционная регуляция iNOS отличается в кардиомиоцитах по сравнению с кардиальными эндотелиальными клетками, так IFNγ единственный индуцирует iNOS в кардиомиоцитах/ Посттранскрипционная регуляция iNOS осуществялется посредством увеличения стабильности iNOS-мРНК с помощью цАМФ, сопровождающего экспозицию цитокинов. Предполагаетсмя, что нарушение поставки фокторов и кофакторов, необъходимых для продукции NO может модулировать iNOS обусловленное высвобождение NO в кардиомиоцитах,т.к. (1) регуляция ГТФ циклогидролазы I, скорость-ограничивающего энзима для синтеза de novo тетрагидробиоптерина, контролирует цитокинами индуцированную продукцию NO и (2) экспрессия и активность катионных аминокислотных транспортеров ответственно за транспорт L-аргинина в клетки, регулирующие iNOS осуществляемое NO-высвобождение.
По аналогии с iNOS "конституитивный" eNOS содержит регулторные промоторные последовательности SR-1 и GATA, вовлеченные в базовую регуляцию этого энзима. Более того, идентифицированы регуляторные консенсусы последовательностей сайтов для связывания транскрипционных факторов, включая АР-1 и АР2, ретинобластома контролирующий элемент, NF-1, стероидный регуляторный элемент-1, SP-1 и к цАМФ чувствительный элемент. Уровень экспрессии eNOS м.б. изменен разными стимулами, включая shear-стресс, напряжение кислорода и гипоксию, статус пролиферации и роста, цитокины, половые стероиды, ростовые факторы, окисленные низкой плотности липопротеины и протеин киназа С. В кардиомиоцитах снижение экспрессии eNOS обнаруживается после подъема внутриклеточного цАМФ, а также IFN-&gamma и IL=1β.
Modulation of NOS Activity by Protein-Protein Interaction and Colocalization
Важная роль для Ca 2+-калмодулин зависимой активности eNOS, является субклетоный таргетинг, обнаруженный как в эндотелиальных клетках, так и кардиомиоцитах.Направление этого энзима в плазмалемные кавеолы с помощью myristolation и palmotoylation, по-видимому, опитимзирует активацию eNOS и последующее высвобождение NO. С кавеолином связанный eNOS активруется полсе связывания калмодулин-Са2+, что ведет к последующей диссоциации eNOS от кавеолина. Инактивация eNOS наблюдается после ее диссоциации от калмодулина, что указывает на перекрестное общение кавеолина и калмодулина. Последнее взаимодействие модулируется фосфорилированием кавеолина-1, как известно, извлекаемого с помощью eNOS активрующих агонистов, таких как брадикинин, гистамин или АТФ и ингибируемого путем увеличения взаимодействия eNOS с кавеолином. Др. сигналом для прерывания энзиматической активности, по-видмимоу, является транслокация eNOS после продолжительной активации агониста путем palmotoylation, сопровождаемой фосфорилированием энзима. После дефосфорилирования и ре-palmotoylation eNOS снова связывается с кавеолином и подвергается снова рециклингу в доступный пул. Важно, что втечение всего процесса транслокации eNOS остается myristolated, что вероятно направляет retargeting комплекса кавеолин-eNOS в кавеолы. Возможно сущестование и др. пути, где palmotoylation ведет к переносу eNOS в область Гольджи, создавая более сложный путь отделения eNOS в кавеолы. Эти обратимые и ингибирующие мембран-докирующие взаимодействия eNOS не ограничены изоформами кавеолина, но происходят также и с др. мембранными белками, напр., брадикинином В2 и ангиотензиновым II AT1 рецептором в эндоетелиальных клетках. Т.обр., eNOS связывается с сарколеммой с помощью различных трансмембрнных рецепторов и каждый рецептор секвестрирует небольшой пул от общей клеточной eNOS. По крайней мере для кавеолин связывания Са2+-калмодулиновый комплекс контра-сбалансирован аллостерическим модулятором eNOS, т.к. подавление очищенного eNOS с помощью кавеолина является конкурентным и полностью обратимым с помощью Са2+-калмодулина. Хотя eNOS диссоциирует от брадикининовых В2 рецепторов лиганд- и Са2+-зависимым способом, не обнаружено эффекта В2 рецепторного пептида на связывание eNOS с помощью Са2+-калмодулина, это указывает на то, что ингибирование брадикинин В2 рецептором eNOS не зависит от кавеолин-1 игибиции. Др. белок, участвующий в регуляции транслокации eNOS посредством формфйорилирования тирозина является eNOS-fssociated protein 1 (ENAP-1). Различные киназы, непосредственно фосмфорилирующие eNOS были охарактеризованы как дальнейшие вышестоящие регуляторы активности eNOS.
Итак, внутри одной клетки существуют Са2+-зависимый и независимый регуляторные пути для eNOS активности и транслокации.
Modulation of eNOS in Cardyomyocytes
В кардиомиоцитах наблюдается ко-ассоциация между eNOS и кавеолином-3, на 60% идентичного с кавеолином-1. Сходный с кавеолином-1 эндотелиальных клеток кавеолин-3 играет ключевую роль в регуляции активности eNOS и в субклеточном таргетинге в крдиомицитах. Активация eNOS описана для мускариновых, путринергических и адренергических агоностов. Не совсем ясно может ли активация мускариновых рецепторов в окончательно дифференцированных вентрикулярных кардимиоцитах вести к генерации eNOS или нет, несмотря на доказаетсьства того, что экхогенный NO влияет на кардиальный ритм и контрактильность. Различия, выявляемые в мускариновой регуляции I Ca вероятно связаны с активацией альтернативного сигнального пути минуя кавеолин. Предполагая, что активация мускариновых рецепторов генерирует NO, следует думать, что G i-AC и/или G i-PLC задействованы. Установлено, что брадикинин активирует eNOS в взрослом предсердии и желудочек сердца крыс. Это подтверждает, что разные пути существуют для активации eNOS и, возможно что клеточные условия предопределяют функциональную экспрессию рецепторов и сигнальный путь для активации eNOS. Это предположение подтверждается тем фактом, что М2 и брадикинин В2 рецепторы только временно связываются с кавеолином после связывания агониста. т.обр., различия, выявляемые мускариновой синализации у eNOS дефицитных мышей м. зависеть от (1) доступности М2 рецепторов и (2) возраста животных. Однако не удалось какую-либо активацию eNOS в вентрикуолярных кардиомиоцитах крыс после воздействия carbachol , тогда как брадикинин является строгим стимулятором. Целиком неизвестна роль киназ в регуляции активности eNOS.
Еще большая сложность выявляется для предачи сигналов eNOS при наблюдении, что кавеолы и L-аргининовый транпротер ко-ассоциируют, возможно высвобождая субстрат непосредственно энзиму. Эта находка вызывает вопрос, может ли в кардиальных миоцитах, в которых САТ-1 участвует в высвобождении NO, rj-локлизация eNOS и САТ-1 в кавеолах играть роль для оптимизации продукции NO.
TARGET FOR NO IN CARDIOMYOCYTES AND THEIR FUNCTIONAL IMPLICATIONS
Несколько мишеней описано в кардиомиоцитах для NO, обеспечиваемых или NO-cGMP путем или cGMP-независимыми событиями. С момента открытия негативного ионотропного эффекта NO на сердце, связанного с нарушениями кардиальной контрактильности, большое количество работ посвящено этому вопросу. Предполагается, что NO ирает модулирующую роль в миокариальном возбудительно-сократительном купировании (exitation-contraction coupling),т.к. eNOS активность зависимт от [Ca 2+], которые , как изветсно, связаны с pacing частот.
Помимо модуляции I Ca с помощью РКА и PKG NO-индуцированная регуляция миокардиальной контрактильности м. также действовать через ryanodine рецепторы . Более того, подавление SR Ca 2+-АТФазы и рианодиновых рецепторов м. вызывать изменния Ca 2+-индуцированное высвобождение Ca 2+ и тем самым кардиальной сократимости.
Предполагается, что NO-обусловленные эффекты на кардиальную контрактильность в первую очередь связаны со снижением Ca 2+ чувстивительности миофиламент. Снижение контрактильности обусловлено изменением состояния фосфорилирования тропонина I посредством PKG-зависимого механизма. Также для кардиальной функции м. иметь значение NO-обуловленная модуляция митохондриальных энзимов респираторной цепи, вызывающая снижение потребления O 2. Снижение активности митохондриальных энзимов, по-видимому, обусловлено nitrosylation некоторых ключевых энзимов. Однако, митохондриальная eNOS экспрессия не доказана. Предполагается, что NO играет принципиальную роль в передаче кардиальных сигналов, которые если и необлигаторны, то , по крайнеймере существенны, для оптимальной кардиальной функции.
Высоко реактивные молекулы NO имеют различные дополнительные внутриклеточные мишени, связанные с физиологической и патофизиологической регуляцией работы сердца. Напр., модулирующая роль NO предполагается для активируемого растяжением высвобождения атриального натриуретического пептида в атриальных кардиомиоцитах, что связано с регуляцией кровяного доавления и гомеостажа жижкостей. Более того, реакция NO с Fe 2+-гемопротеинами ведет к деактивации thromboxane syntase и к активации cyclooxygenase, будучи активной в кардиомиоцитах. NO регулирует также антиоксидантную способность кардиомиоцитов. NO ослабляет глютатион пероксидазную активность, тогда как др. известные кардиальные антиоксиданты, такие как супероксид дисмутаза и каталаза, нет. Ингибирование антиоксидантной способности м.б. одним из механизмов. ведущих к кардиальным повреждениям после оксидативных стрессов. Имеется множество и др. потенциальных механизмов, оказывающих токсические эффекты на кардиальные миоциты, включая auto-ADP-rubosylation гликолитических энзимов, формирование токсических видов, таких как peroxynitrite и запуск апоптоза кардиальных миоцитов.
ENVIROMENTAL TARGETS FOR CARDIOMYOCYTE-DERIVED NO
NO, продуцируемый кардиомиоцитами играет также важную роль для соседних клеток, таких как соседние симпатические нервные волокна и эндотелиц микрососудов. Выявлен эффект NO на симпатическую нейротрансмиссию в перфузионном сердце крыс в условиях отсутствия стимулов. NO-донором высвобождаемый NO, а также эндогенно генерируемый NO во внутрикардиальных симпатических нейронах снижают высвобождение норэпинефрина в сердце Langendorff-перфизируемых крыс во время электрической стимуляции симпатического нерва. Регуляция симпатических катехоламиновых хранилищ в сердце зависит от NO в зависимости от концентрации. Низкие концентрации вызвают увеличение катехоламиновых хранилищ, высокие концентрации No истощают катехоламиновые хранилища в аксонах. М. предположить, что модуляция этих хранилищ и высвобождение в сердце регулируются с помощью обоих механизмов и возможно играют роль в регуляции контрактильности миокарда. Несмотря на эффекты NO? продуцируемого эндотелием, на кардиомиоциты очень мало известно об обратных эффектах. Возможно, что кардиомиоциты помимо эндотелиальных клеток вовлечены в Т)-опосредованную регуляцию коронарного кровотока, локальную регуляцию области капиллярной диффузии и сосдудистую проницаемость. Предполагается также участие NO в регуляции микрососудистого трансцитоза в сердце крыс.
PATHOPHYSIOLOGICAL ROLE OF NO FOR CARDIOMYOCYTE FUNCTION
Роль NO для функции сердца связана с прямым негативным ионотропным эффектом различных цитокинов, которая опосредуется черех eNOS. Индукция миокардиальной iNOS и активация eNOS обнаружены в ткани сердца от пациентов с dilated cardiomyopathy. Увеличените экспрессии iNOS обнаруживется при ишемии сердца и болезнях сердечных клапанов. Выявлена ко-ассоциация индукции iNOS с сократительной дисфункцией левого желудочка человека. Избыточная продукция NO миокардом, по-видимому, вредна. При сердечной недостаточности iNOS и eNOS вовлечены в ослабление NO-обусловленной модуляции сердечной функии. Учитывая кавеолярную локализацию и зависимую от активации транслокацию eNOS, м. предположить, что дефекты сарколеммы кардиомиоцитов при патофизиологических условиях м. модулировать каталитическую активность eNOS.
|