Подробно об основных разновидностях митотических контрольных пунктов (checkpoints) рассказывается в ОБЗОРЕ, посвященном участию в этих КПП митотических киназ
Актиновый цитосклет является динамической структурой. В ходе клеточного цикла эукариотических клеток, например, цитоскелет ремоделируется, кульминацией становится формирование актинового кольца, сокращающегося во время цитокинеза. Открыта неизвестная митотическая checkpoint (система контроля), которая специфически осущетвляет мониторинг актинового цитоскелета.
Kulukian, A. et al. Unattached kinetochores catalyze production of an anaphase inhibitor that requires a Mad2 template to prime Cdc20 for BubR1 binding. Dev. Cell 16, 105–117 (2009)
Malureanu, L. A. et al. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/CCdc20 in interphase. Dev. Cell 16, 118–131 (2009)
Митотический checkpoint это механизм надзора, который задерживает начало анафазы до тех пор, пока все хромосомы соответствующим образом не будут прикреплены к микротрубочкам веретена. Индуцируемый checkpoint 'wait anaphase' сигнал предупреждает cell division cycle 20 () от активации ubiquitin лигазой anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), который способствует деградации белков, которые накладывают арест на клеточный цикл. Какрва молекулярная основа этого сигнала?
Kulukian et al. очистили компоненты митотического checkpoint и тестировали их способность ингибировать активность ubiquitin лигазы из APC/CCDC20in vitro. Увеличение количеств mitotic arrest deficient 2 () ингибирует активность APC/CCDC20, а очищенные хромосомы с неприкрепленными кинетохорами усиливают этот эффект. Инкубация очищенных хромосом с компонентами checkpoint, сопровождаемая удалением хромосом прежде добавления APC/C, усиливает APC/CCDC20 ингибирование. Итак, неприкрепленные кинетохоры действуют на MAD2, чтобы продуцировать растворимый ингибитор CDC20, который усиливает передачу сигналов митотического checkpoint.
MAD1 стабильно располагается на неприкрепленных кинетохорах, а антитела, которые предупреждают соединение MAD2 с MAD1 (и тем самым рекрутирование MAD2 на неприкрепленные кинетохоры), блокируют усиление ингибирования APC/CCDC20 с помощью очищенных хромосом. Это же верно и для мутантных MAD2, которые соединяются с MAD1, но неспособны рекрутировать вторую MAD2 молекулу, чтобы сформировать MAD2 димеры. Эти результаты указывают на то, что MAD1–MAD2 гетеродимеры рекрутируют цитозольные MAD2 молекулы на неприкрепленные кинетохоры, чтобы обеспечить связывание CDC20.
Путем очистки APC/C комплекса и его партнеров по связыванию в присутствии и отсутствии MAD2, авт. установили, что BUBR1 соединение с APC/C строго усиливается в присутствии MAD2. Однако в присутствии очищенных хромосом, которые имеют неприкрепленные кинетохоры, происходит увеличение количества BUBR1 связей с CDC20 комплексом, с уровнями MAD2, находящимися в субстоихометрии с уровнями BUBR1. Итак, временный MAD2–CDC20 комплекс способствует передаче CDC20 на BUBR1.
Malureanu et al. изучали in vivo функцию различных доменов BUBR1. Клетки, лишенные BUBR1 были нежизнеспособны, а первые 363 N-терминальных остатков (которые включали CDC20-связывающий домен и обозначаемые как BUBR1(1–363)) оказались существенными и достаточными для восстановления жизнеспособности клеток. N-терминалный CDC20-связывающий домен существенен также для собственно прикрепления хромосом к митотическому веретену и регулирует время митоза (временной интервал между разрывом ядерной оболочки и началом анафазы).
"...mitotic checkpoint inhibitor is generated by the sequential production of MAD2–CDC20 and BUBR1–CDC20 inhibitors.
В разрушающих (pull-down) экспериментах BUBR1(1–363) формирует комплекс с MAD2 и CDC20. Хотя BUBR1(1–363) является критическим для активации митотического checkpoint и ингибирования APC/CCDC20 ubiquitin лигазной активности, он не располагается на кинетохорах. Интересно, что растворимый BUBR1 соединяется с CDC20 и др. компонентами checkpoint не только в митозах (когда активен checkpoint), но и также в интерфазе, во время которой BUBR1, по-видимому, предупреждает нежелательную деградацию специфических APC/C субстратов.
Kulukian et al. полагают, что 'wait anaphase' mitotic checkpoint ингибитор генерируетсф в результате последовательной продукции MAD2–CDC20 и BUBR1–CDC20 ингибиторов.
Новая митотическая checkpoint (система контроля), которая специфически осущетвляет мониторинг актинового цитоскелета обнаружена при обработке синхронизированных клеток Schizosaccharomyces pombe веществом, которое ингибирует полимеризацию актина - latrunculin B - и установлено, что эти клетки останавливаются во время митоза более чем на час. Ориентация биполярного веретена, которое ответственно за расхождение удвоенных хромосом, нарушена. Авт. наблюдали одиночный сигнал от флюоресцентно меченного маркера для центромер, указывающего, что сестринские хроматиды не разделены.
В делящихся дрожжах сестринские хроматиды склеены вместе белком, называемым , a разделяются они только тогда, когда этот белок расщепляется специализированой протеазой, известной как Cut1 или separase. в свою очередь активируется в результате деструкции ингибирующей субъединицы, названной , которая убиквитилирована (ubiquitylated) - и подготовлена для деструкции - с помощью anaphase-promoting complex (APC). Gachet et al. показали, что что в присутствии latrunculin B, расщепление Rad21 задерживается. Однако, деструкция Cut2 не затрагивается этим воздействием, это указывает на то, что разрушение актинового цитоскелета задерживает разделение сестринских хроматид без участия APC. Устанровлено, что эта checkpoint не зависит от checkpoint, отвечающего за сборку веретена, которая задерживает митозы в ответ на дефекты веретена или когда хромосомы неспособны прикрепляться к веретену.
Каковы же компоненты этой новой? Gachet et al. обнаружили (дрожжевой гомолог транскрипционного фактора) человека и (a mitogen-activated protein kinase). Оба белка относятся к stress-activated protein kinase (SAPK) пути,с фосфорилированием Sty1/Spc1 и в результате активированием Atf1. (Рис. показывает клетки дикого типа (слева) и δatf1 клетки (справа) в присутствии latrunculin B.)
Авт. приходят к заключению,что путь SAPK участвует в контроле этой зависимой от актина mitotic checkpoint, которая, по-видимому, "ensures mitotic spindles are properly oriented before anaphase is allowed to take place". Эта проверяющая система м.б. особенно важной во время развития многоклеточных организмов, когда предопределяется судьба асимметрических клеток, что м. зависеть от ориентации веретена во время митоза.
