Mechanics of apoptotic cell removal

Апоптические клетки м. б. распознаны и поглощены с помощью процесса высоко законсервированного у нематод, насекомых и млекопитающих. Возможно, что поглощение осуществляется с помощью 'tether и tickle' механизма (Рис.1). Распознавание молекул на фагоциируемых клетках или во внеклеточной жидкости д.б. связано со структурами на апоптической клетке, чтобы присоединить их к поверхности фагоцита. У млекопитающих эти распознаваемые молекулы включают членов большого семейства рецепторов-могильщиков (scavenger), β1, β2 и β3 integrins, лектины и некоторые glycosylphosphatidylinositol (GPI)-сцепленные лиганды, такие как CD14.

(Рис.1.) | A proposed 'tether и tickle' mechanism for apoptotic cell uptake.

В этой модели, дополнительные рецепторы должны быть задействованы на фагоците, чтобы инициировать поглощение (это компонент 'tickle') захваченной клетки с помощью процесса, сходного или идентичного с процессом макропиноцитоза. Очевидно, что привязывающие молекулы д. инициировать сигналы к поглощению, у Caenorhabditis elegans продукт гена ced-1 м. б. таким рецептором с двойной функцией. По-видимому, существует более высокая перекрываемость распознающих механизмов ву млекопитающих, чем у червей, но м. б. ограничен спектр рецепторов, активирующих поглощение.

Предполагается, что связанные факгоцитами апоптические клетки м. инициировать поглощение с помощью сигнальных путей, включающих CrkII (ced-2), DOCK180 (ced-5) и ced-12, образующих комплекс для активации rac-1 (ced-10).

Структуры, которые распознаются на апоптических клетках еще плохо охарактеризовны. Однакко, практически все апоптические клеткт экспрессируют phosphatidylserine на своей поверхности. Этот фосфолипид обычно располагается на внутреннем листке мембраннго бислоя, но он выходит наружу во время апоптоза благодаря активации фосфолипидных scramblases. Они движут фосфолипиды в обоих направлениях поперек мембраны, нивелируя (или scrambling) их асимметричное распределение. В покоящихся клетках, любой phosphatidylserine, который получает доступ к наружному klbcnre мембраны, быстро отправляется назад (ре-интернализуется) с помощью aminophospholipid translocases. (Молекулы, кандидаты на роль scramblase и translocase клонированы, но их точна идентификация и способ действия еще не установлены). Активация клеток часто приводит к временной экспрессии phosphatidylserine на поверхности клетки, частично обусловленной активацией scramblase с помощью процесса, нуждающегося в фосфорилировнии и кальции. Но больше всего экспрессии phosphatidylserine обнаруживается во время активации тромбоцитов ( когда они вовлекаются в процесс каогуляции) и во время апоптоза. В последнем случае scramblase активируется вследствие расщепления с помощью caspase-3 и активации протеин киназы C (PKC)-δ, и инактивации aminophospholipid translocase (возможно, частично, из-за повышения кальция и понижения АТФ). В результате phosphatidylserine начинает постоянно экспрессироваться на наружном листке мембраны.

The phosphatidylserine receptor

Phosphatidylserine на апоптических клетках распознается phosphatidylserine receptor (PSR). Некоторые др. молекулы клеточной поверхности или bridging (включая scavenger рецепторы, oxidized low-density lipoprotein receptors (LDLRs), CD14, β₂ glycoprotein 1 или gas-6) также м. взаимодействовать с phosphatidylserine, и м. определенно участвовать в общем взаимодействии. Но PSR рецепторы обнаруживают стереоспецифическое взаимодействаие с phosphatidylserine и широко экспрессируются в различных тканях и клетках, их гомологи обнаружены у C. elegans и Drosophila melanogaster. Это подтверждает, что большинство клеток наряду с профессиональными факгоцитами м. переваривать апоптические клетки.

Использование PSR ведет к macropinocytosis и поглощению связанных апоптических клеток (это обеспечивает 'tickle' стимулы для поглощения). В естественных условиях phosphatidylserine должен находиться на поверхности апоптических клеток, а связанные с ним лиганды д., следовательно, усиливать его взаимодействие с рецепторами PSR. Однако, привлечение PSR инициирует также поглощение находящихся рядом связанных клеток. Кроме того, PSR не только обеспечивают поглощение, но и, по-видимому, являются важными факторами в этом процессе, т.к. блокирование экспрессии phosphatidylserine или PSR предупреждает поглощение апоптических клеток (по крайней мере in vitro). Индивидуальные малекулы PSR м. иметь относительно низкое сродство к своему лиганду, указывая тем самым на важность конкурентных связывающих процессов в дополнение к локальной высокой плотности phosphatidylserine на поверхности апоптических клеток (напр., в apoptotic blebs; (Рис. 2). Предполагается, что двухступенчатая 'tether и tickle' потребность для присоединение и затем передачи сигналов PSR о поглощении, защищаети от неадекватного поглощения временно активированных клеток, экспрессирующих на своей поверхности phosphatidylserine.

(Рис.2.) | Phosphatidylserine on the surface of apoptotic cells.

PSR blocks inflammation и immunity

Др. ключевым следствием привлечение PSR является то, что продукция воспалительных медиаторов супрессируется, кроме того иммунная реакция становится потенциально ингибированной. Точные сигнальные пути, связанные с этими двумя реакциями на взаимодействие между phosphatidylserine и потенциальной фагоцитирующей клеткой — поглощение или противовоспалительный эффект — еще не удается разделить, по крайней мере частично эта супрессия возникает в результате индукции противо-воспалительных медиаторов, включая transforming growth factor (TGF)-β, prostaglandin E₂ и interleukin-10.

Т.к. созревание необходимо для миграции в лимфатические узлы, то соотвествующая презентация антигенов и инициация иммунного ответа, предупреждающего созревание, должны, как ожидается, супрессировать локальную иммунность (Рис. 3). PSR присутствует на незрелых дендритных клетках, а его ligation, по-видимому, вызывает активную супрессию созревания и презентации антигенов этими клетками. Потенциальный механизм такого эффекта неизвестен, хотя супрессивные цитокины м. оставаться кандидатами. Итак, распознавание phosphatidylserine - это не только супрессивный сигнал, хотя он является критическим. Общим эффектом, однако, будет не-воспалительное, не-иммуногенное удаление апоптических клеток.

(Рис.3.) | Activation of immature dendritic cells.

Следующим шагом после удаления апоптических клеток является восстановление нормальной структуры и функции ткани. Способность PSR ligation иницировать продукцию TGF-β jnоткрывает возможность того, что распознаваемые апоптические клетки м. непосредственно участвовать в таком структурном излечении и ремоделировании. Во время классического заживления ран TGF-β м. вносить свой вклад в дифференцировку миобластов и в продукцию тканевых грануляций. Но в условиях, при которых сохраняется генерация и удаление апоптических клеток, м.б. гарантировн фиброз тканей, таких как легкие, почки или печень. Итак, регуляция воспаления с помощью этих процессов д.б., при некоторых условиях, обоюдо острым мечом. С одной стороны, во время эмбриогенеза или даже у взрослых распознавание апоптических клеток м. генерировать др. члены семейства bone morphogenetic protein (BMP)/activin или добавочно ростовые или дифференцирующие факторы для развития и моделирования ткани.

Removal of necrotic cells и debris

Обратимся к некротическим или лизируемым клеткам. Существует эффективное удаление в ткани, но оно инициирует воспалительную реакцию и/или вызывает срзревание дендритных клеток. Можно ожиддать, что лизируемые клетки буду передаваль большие количества phosphatidylserine с дебриса мембран окружающим интактным клеткам — независимо тканевые ли это клетки, макрофаги или незрелые дендритные клетки - получены некоторые доказательства того, что их взаимодействие с макрофагами м. также зависеть от phosphatidylserine.

Предложено, по крайней мере, два механизма для предоления эффекта PSR. Согласно одному, белки цитоплазмы, связывающие phosphatidylserine, такие как annexins, м. блокировать экспозируемый phosphatidylserine, чтобы редуцировать его взаимодействие с PSR. Этот эффект блокирования продемострирован добавлением annexin V. Согласно др. механизму, имеется значительная чувствительность PSR к расщеплению протеазами. Протеазы в клеточных лизатах должны удальять рецепторы и, хотя, по-видимому, и имеется внутриклеточный резерв, который м.б. мобилизирован, это ведет к временной беззащитности клетки, которая могла бы запустить продукцию про-воспалительных медиаторов и/или созревание в направлении antigen-presenting дендритных клеток.

Эффект протеаз на PSR имеет значение для регуляции острого и хронического воспалительного ответа. Инициальная миграция гранулоцитов является ключевым элементом воспалительного процесса и это часто сопровождается секрецией или поверхностной экспрессией сериновых протеаз, таких как эластаза нейтрофилов. Протеолитическое расщепление PSR из клеток в месте воспаления (включая macrophages) будет, следовательно, освобождать эти клетки от PSR-индуцированного ингибирования для оптимальной генерации про-воспалительных медиаторов. Потенциально пагубные протеазы в месте воспаления обычно вскоре инактивируются в результате притока анти-протеаз, таких как α1 antiprotease (Рис. 4) из плазмы благодаря повышению сосудистой проницаемости. Повторное развертывание PSR на имеющихся фагоцитарных клетках или из экспрессия на вновь мигрироввавших клетках будет теперь оптимизировать ситуацию для удаления воспалительных клеток, супрессии продукции воспалительных медиаторов и устранению воспаления.

(Рис.4.) | The phosphatidylserine receptor as a key signalling receptor.

В пользу этой идеи говорит то, что добавление апоптичпеских клеток или липосом, несущих phosphatidylserine, в продолжающуюся воспалительную реакцию редуцирует уровень воспалительных медиаторов и ускоряет разрешение воспаления. Напротив, места воспаления с сохранением высокого уровня протеаз м. обнаруживать снижение уровня очистки от апоптических воспалительных клеток, следствием чего является сохранение воспаления. Дыхательные пути пациентов с кистозным фиброзом обнаруживают высокие уровни эластазы нейтрофилов, аберрантное очищение от апоптических нейрофилов и непрекращающееся воспаление. Жидкость из таких воздушных путей легко вычищает PSR из клеток in vitro. Сохраняющиеся уровни активной elastase м. также вносить свой вклад в неэффективность удаления апоптических клеток и нерперывное вяло текущее воспаление, наблюдаемое при chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) таких как emphysema.

Многие составляющие, высвобождаемые из лизируемых и некротических клеток м. инициировать созревание дендритных клеток или продукцию воспалительных медиаторов посредством различных рецепторов. Такими стимулирующими матеиалами м.б. протеазы, хитшоковые белки (хапероны) и двунитчатые ДНК. Митохондрии м., по-видимому, обладать такими же свойствами т. к. эволюционно они происходят из эндосимбиотических бактерий.

Collectins, calreticulin и CD91

Паттерн-распознающие молекулы врожденной иммунной системы связываются со специфическими молекулярными паттеранами (известными как ассоциированные с патогенами молекулярны паттерны (pathogen-associated molecular patterns) или PAMPs) в чужеродных организмах. Они становятся кандидатами на распозанвание внутриклеточных особенностей в клетках, включая митоходрии или даже сами апоптические клетки. Они включают семейство Toll-подобных рецепторов, рецепторы маннозы, некоторые рецепторы-могильщики и растворимые белки в кровообращении или на слизистой поверхности, такие как collectins. Коллектины это семейство сложных белков, которое включает mannose-binding lectin (MBL), surfactant proteins A и D (SP-A, SP-D) и conglutinin. C1q, первый компонент классического комплементного пути, оно близко родственно молекулам и целой группе , называемой защитными коллагенами из-за их законсервированных коллаген-подобных хвостов. Они обнаруживают существенную мультимеризацию (multivalency), C-lectin (carbohydrate- binding) функцию в их глобулярных головных группах (исключая C1q) и широкую специфичность к белкам. углеводам и липидам. C1q, напр., жадно связываетсся с cardiolipin, экспозируемым митохондриями. Коллектины важны для распознавания чужеродных организмов и они м. училивать факгоцитоз, а также способствовать воспалительной реакции.

Предполагается, что C1q^{3,
46} или SP-D снижают способность удалять апоптические клетки in vivo, и что коллектины в целом м. усиливать заглатывание апоптических клеток in vitro, благодаря широкой специфичности эти молекулы особенно эффективны в распознавании и удалении компонентов лизированных клеток. Интересно, что апоптические и лизированные клетки очевидно не конкурируют др. с др. за взаимодействие с макрофагами, подтверждаея тем самым, что разные рецепторы участвуют или в фазе связывании или стимуляции поглощения апоптических и некротических клеток или, по крайней мере, используются в случае убитых теплом клеток.

После распознавания collectins д. инициироватть реакцию в фагоцитах и др. соседних клетках. Различные рецепторы используются для их действия (в частности для C1q). Предполагается, что такая широта — redundancy — м.б. важной для оптимизации эффекта таких молекул врожденной иммунной системы и что снова используется двойная 'tether и tickle' реакция.

В общем описан коллектиновый рецептор, который распознает коллагеновый хвосты у MBL, SP-A, SP-D, conglutinin и C1q. Он описан первоначально как collagen-tail C1q receptor (cC1qR), и сейчас известен как cell-surface calreticulin. Calreticulin обычно присутствует в endoplasmic reticulum (ER), где он действует как кальций-связывающий белок и молекулярный хаперон, он экспрессируется на клеточной поверхности многих клеток. Он не содержит трансмембранного домена и имеет ER обнаруживающий сигнал. Ligation поверхностного калретикулина м. эффективно обеспечивать macropinocytosis и поглощение апоптических клеток и др. частиц. Не имея трансмембранного домена он очевидно нуждается в партнере для трансдукции сигналов фагоцитирующим клеткам.

Кандидатом в партнеры сигнальной молекуле является CD91, известный также как α2 macroglobulin receptor или LRP (LDL-related receptor protein). CD91 является большой трансмембранной молекулой - передающей сигналы, благодаря которым запускается поглощение и продукция медиаторов — и является также связывающей и интернализующей молекулой для хитшоковых белков, высвобождаемых поврежденными клетками. Предполагается, что он связывает и калретикулин. Показано, что он необходим для коллектина и калретикулином-обусловленного поглощения апоптических клеток CD91 скорее всего участвует во многих коллектином-индуцированных функциях, включая и удаление различных чужеродных организмов.

Калретикулин, выделенный из различных опуохолевых клеток, добавленный к незрелым дендритным клеткам не м. индуцировать их созревание, но м. инициировать tumour-специфические ответы в Т клетках — возможно, благодаря функции антгенных пептидов , находящихся в оригинальных опухолевых клетках. Отсюда: потенциальная роль калретикулина в ER, помогающая нагрузить major histocompatibility complex (MHC) пептидами; способность калретикулина с внешней стороны клетки связываться с сигнальными молекулами(возможно CD91); и вытекающая способность инициировать сигналы поглощения и созревания. Вообще-то калретикулин, обнаруживаемый в клетках in vitro, происходит всегда из поврежденных клеток культуры с последующим связыванием с поверхностными 'receptors' , такими как CD91, скорее, чем с теми, что внутри этих клеток. Хотя такая возможность не м.б. исключена, конечное следствие, вероятно, то же самое — не только м передача сигналов калретикулина запускать инициацию или усиление воспаления, но и реакцию адаптивной иммунной системы, но он м. также амплифицировать такие сигналы , т.к. м. связывать коллектины. Такая амплификация буде количественной и качественной; последняя благодаря мульимеризации молекул коллектина, а первая благодаря его широкой специфичности (Рис. 5).

(Рис.5.) | The role of collectins.

The PSR as a molecular switch

Предполагается, что имеется баланс между активирующим потенциалом этих различных механизмов распознавания поврежденных клеток и обычными супрессирующими эффектами, наблюдаемыми в удаляемых интактных апоптических клетках a balance between the activation potential of these various mechanisms to recognize damaged cells (Рис. 6). В частности, прдполагается, что распознавание поверхностного phosphatidylserine является критическим для этого баланса. Для случаев, в которых происходит достаточная ligation PSR, супрессия м. доминировать; для случаев, в которых он отсутствует преобладают pro-inflammatory и immune-stimulatory эффекты. Так, напр., апоптические клкетки м. предупреждать усиленную продукцию поовоспалительных цитокинов, индуцируемых некротическими клетками in vitro. Они м. также редуцировать иммунную реакцию in vivo, эффект, которые м. б. преодолен блокировкой экспозируемого phosphatidylserine белком annexin V.

(Рис.6.) | The phosphatidylserine receptor signalling switch.

Благодаря своим клеточным стенкам бактерии или грибы не экспрессируют доступные phosphatidylserine на своей поверхности и м. ожидать уклонения от супрессивных путей. Опухолевые клетки, напротив (доже, если они становятся апоптическими), экспрессируют phosphatidylserine и м., как следствие этого, поддерживать противовоспалительные и неиммуногенные условия — нанося этим вред хозяину. here to the detriment of the host. Наконец, необходимо подчеркнуть, что эти события и регуляторные механизмы д. функционировать более эффективно в локальных сайтах скорее, чем системно . Напр., передача противовоспалительных сигналов в локальном лифатическом фолликуле или опухолевом узле будет сосуществовать с инактивацией PSR, а передача провоспалительных сигналов только вблизи от сайта.

Мы уже знаем. что конечный продукт адаптивной иммунной реакции, а именно, иммуноглобулин G антитела. м. преодоллевать противовоспалительные эффекты PSR ligation путем взаимодействия с Fcγ htwtgnjhfvb. PSR, в свою очередь, м. ожидать, будет преодолевать передачу сигналов посредством калретикулина и CD91. Столь же важно выяснить взаимодействие между системами, рассмотренными выше и др. паттерн-распознающими процессами врожденной иммунной системы, такими как те, что обеспечиваются семейством Toll-подобных рецепторов, взаимодействие с которыми предопределяет исход инфекции, повреждения и разных форм гибели клеток и их удаления.