cleavage furrow
БОРОЗДА ДРОБЛЕНИЯ
Quantitation of the distribution and flux of myosin-II during cytokinesis Douglas N Robinson, Guy Cavet, Hans M Warrick and James A Spudich BMC Cell Biology 2002 3: 4 http://www.biomedcentral.com/1471-2121/3/4
Клеточный морфогенез является фундаментальным для всех онтогенетических процессов и существенным для клеточной пролиферации. Морфогенез зависит от взаимодействий устойчивых состояний и динамических физических свойств, которые позволяют клетке деформироваться и реформироваться в разные формы, такие как нейрональные ростовые конусы и цилиндрический эпителий. В животных клетках цитокинез связан с генерацией сил в области контрактильного коьца. Rappaport непосредственно измерил силу, которую продуцирует контрактильное кольцо. В 1970's немышечный миозин-II, эквивалент силу продуцирующей молекулы скелетных мышц, был локализован в области борозды дробления в кортексе. Последующие генетические исследования выявили практически повсеместную потребность в немышечном myosin-II во время цитокинеза от слизистой плесни до метазоа. (Рис.1.) \| Regions defined for analysis. (Рис.2.) \| A. A time series of ratio images of a wild type GFP-myosin-II expressing cell going through cytokinesis. (Рис.3.) \| The relative intensity ratios for the pole cortex, furrow cortex and cytoplasm were measured as a function of time. (Рис.4.) \| A. An overlay of micrographs of sequential stages of a dividing D. discoideum cell expressing GFP-dynacortin (Табл.1) Quantitation of myosin-II distribution during cytokinesis: Comparison with minimal force requirements.	Во время стандартного митоза материнскую клетку м. рассматривать как простую сферу, которая деформируется в области экватора в результате врастания борозды. Борозда врастает до тех пор, пока не сформируются небольшие межклеточные мостики. Межклеточные мостики разрывают или разделяют возникшие в результате деления две дочерние клетки. Клеточное деление м. рассматривать как серию промежуточных клеточных форм (сферу, цилиндр и гантель) . Предложена модель цитокинеза, базирующаяся на правиле Hooke's. По этой модели необходимые минимальные контрактильные силы для стабилизации каждой из этих промежуточных форм являются пропорциональными глобальной статической неподвижности клетки и зависят от степень ингрессии борозды. Потребность в Myosin-II в кортексе и в борозде деления зависит от состояния толстых филамент этого молекулярного мотора. Способность формировать толстые филаменты регулируется с помощью фосфорилирования трех треонинов вблизи хвоста длинной суперскрученности (coiled-coil). Когда белок полностью фосфорилирован он остается в основном в мономерном состоянии; в то время как удаление этих фосфатов позволяет белку собираться в толстые филаменты. Замена трех треонинов аланинами дает мутантов 3 × Ala, которые ведут себя подобно конституитивно нефосфорилируемому миозину-II. Он частично восстанавливает нулевую линию тяжелой цепи миозина (mhcA) и локализуется в борозде дробления на кортексе. Количественное сравнение с диким типом позволяет понять, как myosin-II рекрутируется в борозду деления кортекса. Авт. подсчитали минимальную необходимую силу для деления клетки как функцию клеточной геометрии. Затем были рассмотрены механические свойства myosin-II , которые были измерены с помощью современных биофизических инструментов, чтобы подсчитать, как много необходимо myosin-II чтобы создать соответствующую величину силы. Было установлено, что количество myosin-II, необходимое для цитокинеза и количество myosin-II, которое на самом деле накапливается в области борозды находятся в хорошом соотвествии. Приток myosin-II в борозду кортекса, полярный кортекс и цитоплазму проверяли, используя соотношение imaging of GFP сдитого белка, экспрессирущегося у Dictyostelium. Пик концентрации GFP-myosin-II в борозде кортекса в 1.8-раз выше, чем в полярном кортексе и в 2.0-раза выше, чем в цитоплазме. В борозде кортекса myosin-II, однако, представлял всего 10% от общего клеточного myosin-II. Подсчет минимального количества этого мотора, необходимого для производства соответствующей силы для осуществления деления клетки хорошо согласуется с этим значением в 10%. Клетка м., следовательно, регулировать количество myosin-II , посылаемого в борозду кортекса с количеством, необходимым для этого. Распределение и приток мутантного myosin-II, дефектного по демонтажу толстых филамент из-за нарушения фосфорилирования, подтверждает, что фосфорилирование тяжелой цепи регулирует нормальную поставку в борозду кортекса. Локализация Myosin-II является результатом динамики статических состояний, при которой поставка возмещается за счет разборки толстых филамент. В этой модели сигнал, который возможно испускается митотическим веретеном, инструктирует кортекс о необходимости рекрутации миозина-II в кортикальную борозду и начинается его концентрация. Это ведет к элонгации клетки в цилиндрическую форму и сопровождается констрикцией борозды. Myosin-II поставляется до тех пор, пока белка не окажется достаточно и клетка сможет пережиматься желаемым способом. Больше myosin-II поставляется в кортикальную борозду, когда D. discoideum cells распластан поверх агара по сравнению с клетками, растущими в стандартных условиях на поверхности культуральной пластинки. Распластанная поверх агара клетка м. увеличивать очевидную неподвижность клетки за счет внесения напряжения в кортекс из-за повышения гидростатического давления. Нулевые по, myosin-II клетки D. discoideum делятся относительно нормально, если имеют возможность слипаться с поверхностью, но myosin-II становится обязательным, если прилипшие клетки растут под слоем агарозы. Путь разборки myosin-II скорее всего всегда активен, а направление статики зависит от того, активен ли сигнал к поставке myosin-II . С помощью fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) было показано, что дикого типа myosin-II локализуется в кортексе с периодом полужизни около 7 сек. Этот кортикальный период полу-жизни не зависит от того, находится клетка в интерфазе или в цитокинезе. 3 × Ala мутантный myosin-II имеет период полу-жизни больше, до нескольких минут, и поэтому м. использоваться для трассирования белка. Анализ распределения 3 × Ala GFP-myosin-II показал, что фосфорилированием контролируемая разборка является нормальной частью оборота myosin-II. Количество 3 × Ala myosin-II накапливаемое в кортикальной борозде соответствует накоплению нормального myosin-II, оно обычно восполняется за счет разборки толстых филамент myosin-II, возможно как части механизма обратной связи, который отслеживает механические потребности клетки. Между периодом цитокинеза, вызывающим переход от сферической формы к цилиндрической, имеется мало или вообще отсуствует приток of myosin-II из цитоплазмы в кортекс. Простейшим объяснением является то, что myosin-II просто соскальзывает вдоль кортекса с полюсов к борозде деления. В самом деле, FRAP исследование подтверждает модель, согласно которой динамические филаменты myosin-II прогрессивно перемещаются вдоль кортекса, тогда как обмен с цитоплазматическим пулом ограничивается мономерами myosin-II. Однако, между стадией цилиндра и гантели клеточной формы обнаруживается ток myosin-II из цитоплазмы в кортекс. Этот приток м. просто отражать увеличение области поверхности (а, следовательно, и объема кортекса) по отношению к общему объему клетки и м.б. неспецифическим для цитокинеза per se. Затем, кортикальный ток м. продолжать концентрировть myosin-II в борозде кортекса. Т.к. больше 3 × Ala myosin-II , чем myosin-II дикого типа поступает в борозду деления кортекса, то механизм поставки вряд ли ограничен только миозином-II дикого типа. Это указывает на существование неограничиваемого регулятора молекул, которые м. контролировть локализацию миозина-II. Кандидатом на роль каталитического регулятора молекул является PAKa kinase, которая необходима для локализации миозина-II. Эта киназа д. действовать на энзимы, которые регулируют состояние сборки myosin-II или м. дейстовать на кортикальные рецепторы для толстых филамент myosin-II. Во время цитокинеза, глобальные и пространственные механические свойства скорее всего используются для деформации клетки, делающей возможным сужение клетки по экватору. Эти пространственные свойства включают локальную модуляцию ригидности (stiffness) и генерацию контрактильных сил. Локальное увеличение ригидности м. определять область, которая будет деформироваться во время морфологического процесса. Кортикальная борозда деления увеличивает ригидность выше глобальной ригидности, как показано с помощью atomic force microscopy. Это региональное повышение ригидности скорее всего происходит у большинства или всех метазоа и амебоидных клеток. Напр., у D. discoideum cortexillin, белки связывающие поперечно актиновые филаменты, рекрутируются в борозду деления, где они вносят вклад в ригидность кортикальной борозды деления. Myosin-II является, вероятно, основным генератором контрактильных сил. Однако, прямое измерение этого параметра довольно трудно у маленьких клеток. В данной работе было измерено количество myosin-II , которое поступает в борозду деления кортекса. Это количество в тесном соответствии с подсчетами необходимых количеств myosin-II для генерации сил, необходимых для деления клетки. Во-первых, необходимо отметить, что нулевые по myosin-II могут делиться, если имеется поверхность, к которой они прикрепляются. Это указывает на то, что клетка больше всего нуждается в генерации сил во время элонгации и инициальной ингрессии борозды. Traction силы м. прекрасно обеспечить элонгацию клетки и образование цилиндрической формы. В самом деле, myosin-II null клетки в отсутствие прикрепления к поверхности неспособны удлиняться, указывая тем самым, что myosin-II необходим для этой ступени, когда поверхностные силы сцепления (traction) недоступны. Др. gelation и solvation факторы и, возможно, неконвенциональные миозины м. завершать процесс, как только будет достигнута цилиндрическая форма. Интересно, что во время интерфазы myosin-II нулевые клетки на 30% менее ригидны в отношении модулей изгиба и на 70% менее ригидны в отношении поверхностного натяжения, чем дикого типа родительские клетки. Т.обр., учитывая механику деления, факт, что нулевые по myosin-II клетки нуждаются в значительно меньших силах для деления, делает их деление более легким. Т.к. др. белки скорее всего также вносят вклад в продукцию контрактильных сил, то определение количеств myosin-II , поставляемых в кортикальную борозду деления позволяет подсчитать, насколько эти силы м.б. обеспечены myosin-II. Фактически имеются адекватные количества myosin-II для генерации большинства необходимых сил. Резонно, что котрактильное кольцо м.б. способно генерировать больше сил, чем минимально необходимо. Средовые факторы, такие как межклеточне контакты и гипотоничность, м. предъявлять дополнительные требования к экваториальному сократительному аппарату, который нацелен на внутренне присущую ригидность клеточного кортекса. Уровень активности myosin-II способен варьировать. В мышцах, имеется, напр., зависимое от нагрузки потребеление myosin-II поперечных связей; др. словами, производительность мышечного myosin-II м. варьировать. В подсчетах авт. принимали соотношение производительности равноe 0.006, установленное для ненагруженного D. discoideum myosin-II. Зависмая от нагрузки потребность в поперечных связях для D. discoideum myosin-II не изучалась и поэтому неизвестна. Однако, это соотношение м.б.изменено зависимым от нагрузки способом, так что количество myosin-II, рекрутируемое в борозду деления м.б. способным генерировать значительно большие силы, чем минимально необходимые. Активность myosin-II может также варьировать в результате локальной активации с помощью фосфорилирования легкой цепи миозина. Однако, у D. discoideum, фосфорилирование легкой цепи миозина не нужно для цитокинеза. Наконец, соотношение imaging экспериментов не позволяет делать выводы относительно радальной униформности myosin-II в кортикальной борозде деления. Возможно, что генерация сил осуществляется не в точности симметрично. Исследование эффектов др. белков, которые участвуют в цитокинезе, таких как cortexillins и dynacortin необходимо для понимания как др. факторы участвуют в разных механических параметрах, таких как ригидность и контрактильность.

Во время стандартного митоза материнскую клетку м. рассматривать как простую сферу, которая деформируется в области экватора в результате врастания борозды. Борозда врастает до тех пор, пока не сформируются небольшие межклеточные мостики. Межклеточные мостики разрывают или разделяют возникшие в результате деления две дочерние клетки. Клеточное деление м. рассматривать как серию промежуточных клеточных форм (сферу, цилиндр и гантель) . Предложена модель цитокинеза, базирующаяся на правиле Hooke's. По этой модели необходимые минимальные контрактильные силы для стабилизации каждой из этих промежуточных форм являются пропорциональными глобальной статической неподвижности клетки и зависят от степень ингрессии борозды.

Потребность в Myosin-II в кортексе и в борозде деления зависит от состояния толстых филамент этого молекулярного мотора. Способность формировать толстые филаменты регулируется с помощью фосфорилирования трех треонинов вблизи хвоста длинной суперскрученности (coiled-coil). Когда белок полностью фосфорилирован он остается в основном в мономерном состоянии; в то время как удаление этих фосфатов позволяет белку собираться в толстые филаменты. Замена трех треонинов аланинами дает мутантов 3 × Ala, которые ведут себя подобно конституитивно нефосфорилируемому миозину-II. Он частично восстанавливает нулевую линию тяжелой цепи миозина (mhcA) и локализуется в борозде дробления на кортексе. Количественное сравнение с диким типом позволяет понять, как myosin-II рекрутируется в борозду деления кортекса.

Авт. подсчитали минимальную необходимую силу для деления клетки как функцию клеточной геометрии. Затем были рассмотрены механические свойства myosin-II , которые были измерены с помощью современных биофизических инструментов, чтобы подсчитать, как много необходимо myosin-II чтобы создать соответствующую величину силы. Было установлено, что количество myosin-II, необходимое для цитокинеза и количество myosin-II, которое на самом деле накапливается в области борозды находятся в хорошом соотвествии.

Приток myosin-II в борозду кортекса, полярный кортекс и цитоплазму проверяли, используя соотношение imaging of GFP сдитого белка, экспрессирущегося у Dictyostelium. Пик концентрации GFP-myosin-II в борозде кортекса в 1.8-раз выше, чем в полярном кортексе и в 2.0-раза выше, чем в цитоплазме. В борозде кортекса myosin-II, однако, представлял всего 10% от общего клеточного myosin-II. Подсчет минимального количества этого мотора, необходимого для производства соответствующей силы для осуществления деления клетки хорошо согласуется с этим значением в 10%. Клетка м., следовательно, регулировать количество myosin-II , посылаемого в борозду кортекса с количеством, необходимым для этого. Распределение и приток мутантного myosin-II, дефектного по демонтажу толстых филамент из-за нарушения фосфорилирования, подтверждает, что фосфорилирование тяжелой цепи регулирует нормальную поставку в борозду кортекса.

Локализация Myosin-II является результатом динамики статических состояний, при которой поставка возмещается за счет разборки толстых филамент. В этой модели сигнал, который возможно испускается митотическим веретеном, инструктирует кортекс о необходимости рекрутации миозина-II в кортикальную борозду и начинается его концентрация. Это ведет к элонгации клетки в цилиндрическую форму и сопровождается констрикцией борозды. Myosin-II поставляется до тех пор, пока белка не окажется достаточно и клетка сможет пережиматься желаемым способом. Больше myosin-II поставляется в кортикальную борозду, когда D. discoideum cells распластан поверх агара по сравнению с клетками, растущими в стандартных условиях на поверхности культуральной пластинки. Распластанная поверх агара клетка м. увеличивать очевидную неподвижность клетки за счет внесения напряжения в кортекс из-за повышения гидростатического давления. Нулевые по, myosin-II клетки D. discoideum делятся относительно нормально, если имеют возможность слипаться с поверхностью, но myosin-II становится обязательным, если прилипшие клетки растут под слоем агарозы.

Путь разборки myosin-II скорее всего всегда активен, а направление статики зависит от того, активен ли сигнал к поставке myosin-II . С помощью fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) было показано, что дикого типа myosin-II локализуется в кортексе с периодом полужизни около 7 сек. Этот кортикальный период полу-жизни не зависит от того, находится клетка в интерфазе или в цитокинезе. 3 × Ala мутантный myosin-II имеет период полу-жизни больше, до нескольких минут, и поэтому м. использоваться для трассирования белка. Анализ распределения 3 × Ala GFP-myosin-II показал, что фосфорилированием контролируемая разборка является нормальной частью оборота myosin-II. Количество 3 × Ala myosin-II накапливаемое в кортикальной борозде соответствует накоплению нормального myosin-II, оно обычно восполняется за счет разборки толстых филамент myosin-II, возможно как части механизма обратной связи, который отслеживает механические потребности клетки.

Между периодом цитокинеза, вызывающим переход от сферической формы к цилиндрической, имеется мало или вообще отсуствует приток of myosin-II из цитоплазмы в кортекс. Простейшим объяснением является то, что myosin-II просто соскальзывает вдоль кортекса с полюсов к борозде деления. В самом деле, FRAP исследование подтверждает модель, согласно которой динамические филаменты myosin-II прогрессивно перемещаются вдоль кортекса, тогда как обмен с цитоплазматическим пулом ограничивается мономерами myosin-II. Однако, между стадией цилиндра и гантели клеточной формы обнаруживается ток myosin-II из цитоплазмы в кортекс. Этот приток м. просто отражать увеличение области поверхности (а, следовательно, и объема кортекса) по отношению к общему объему клетки и м.б. неспецифическим для цитокинеза per se. Затем, кортикальный ток м. продолжать концентрировть myosin-II в борозде кортекса. Т.к. больше 3 × Ala myosin-II , чем myosin-II дикого типа поступает в борозду деления кортекса, то механизм поставки вряд ли ограничен только миозином-II дикого типа. Это указывает на существование неограничиваемого регулятора молекул, которые м. контролировть локализацию миозина-II. Кандидатом на роль каталитического регулятора молекул является PAKa kinase, которая необходима для локализации миозина-II. Эта киназа д. действовать на энзимы, которые регулируют состояние сборки myosin-II или м. дейстовать на кортикальные рецепторы для толстых филамент myosin-II.

Во время цитокинеза, глобальные и пространственные механические свойства скорее всего используются для деформации клетки, делающей возможным сужение клетки по экватору. Эти пространственные свойства включают локальную модуляцию ригидности (stiffness) и генерацию контрактильных сил. Локальное увеличение ригидности м. определять область, которая будет деформироваться во время морфологического процесса. Кортикальная борозда деления увеличивает ригидность выше глобальной ригидности, как показано с помощью atomic force microscopy. Это региональное повышение ригидности скорее всего происходит у большинства или всех метазоа и амебоидных клеток. Напр., у D. discoideum cortexillin, белки связывающие поперечно актиновые филаменты, рекрутируются в борозду деления, где они вносят вклад в ригидность кортикальной борозды деления. Myosin-II является, вероятно, основным генератором контрактильных сил. Однако, прямое измерение этого параметра довольно трудно у маленьких клеток. В данной работе было измерено количество myosin-II , которое поступает в борозду деления кортекса. Это количество в тесном соответствии с подсчетами необходимых количеств myosin-II для генерации сил, необходимых для деления клетки.

Во-первых, необходимо отметить, что нулевые по myosin-II могут делиться, если имеется поверхность, к которой они прикрепляются. Это указывает на то, что клетка больше всего нуждается в генерации сил во время элонгации и инициальной ингрессии борозды. Traction силы м. прекрасно обеспечить элонгацию клетки и образование цилиндрической формы. В самом деле, myosin-II null клетки в отсутствие прикрепления к поверхности неспособны удлиняться, указывая тем самым, что myosin-II необходим для этой ступени, когда поверхностные силы сцепления (traction) недоступны. Др. gelation и solvation факторы и, возможно, неконвенциональные миозины м. завершать процесс, как только будет достигнута цилиндрическая форма. Интересно, что во время интерфазы myosin-II нулевые клетки на 30% менее ригидны в отношении модулей изгиба и на 70% менее ригидны в отношении поверхностного натяжения, чем дикого типа родительские клетки. Т.обр., учитывая механику деления, факт, что нулевые по myosin-II клетки нуждаются в значительно меньших силах для деления, делает их деление более легким. Т.к. др. белки скорее всего также вносят вклад в продукцию контрактильных сил, то определение количеств myosin-II , поставляемых в кортикальную борозду деления позволяет подсчитать, насколько эти силы м.б. обеспечены myosin-II. Фактически имеются адекватные количества myosin-II для генерации большинства необходимых сил. Резонно, что котрактильное кольцо м.б. способно генерировать больше сил, чем минимально необходимо. Средовые факторы, такие как межклеточне контакты и гипотоничность, м. предъявлять дополнительные требования к экваториальному сократительному аппарату, который нацелен на внутренне присущую ригидность клеточного кортекса.

Уровень активности myosin-II способен варьировать. В мышцах, имеется, напр., зависимое от нагрузки потребеление myosin-II поперечных связей; др. словами, производительность мышечного myosin-II м. варьировать. В подсчетах авт. принимали соотношение производительности равноe 0.006, установленное для ненагруженного D. discoideum myosin-II. Зависмая от нагрузки потребность в поперечных связях для D. discoideum myosin-II не изучалась и поэтому неизвестна. Однако, это соотношение м.б.изменено зависимым от нагрузки способом, так что количество myosin-II, рекрутируемое в борозду деления м.б. способным генерировать значительно большие силы, чем минимально необходимые. Активность myosin-II может также варьировать в результате локальной активации с помощью фосфорилирования легкой цепи миозина. Однако, у D. discoideum, фосфорилирование легкой цепи миозина не нужно для цитокинеза. Наконец, соотношение imaging экспериментов не позволяет делать выводы относительно радальной униформности myosin-II в кортикальной борозде деления. Возможно, что генерация сил осуществляется не в точности симметрично.

Исследование эффектов др. белков, которые участвуют в цитокинезе, таких как cortexillins и dynacortin необходимо для понимания как др. факторы участвуют в разных механических параметрах, таких как ригидность и контрактильность.

Quantitation of the distribution and flux of myosin-II during cytokinesis