Во время митоза сестринские хроматиды первоначально соединяются по всей своей длине с помощью т. наз. cohesin комплекса. Состоящий из 4-х субъединиц, , , и , cohesin обеспечивает это соединение и поддерживает его вплоть до анафазы.
|
ORIGINAL RESEARCH PAPER Kamieniecki, R. J., Shanks, R. M. Q. & Dawson, D. S. Slk19p is necessary to prevent separation of sister chromatids. Curr. Biol. 10, 1182-1190 (2000) [ ] | | |
FURTHER READING Nasmyth, K., Peters, J.-M. & Uhlmann, F. Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science 288, 1379-1384 (2000) [ ] | | | |
TRANSCRIPTION
A molecular Swiss-army knife |
Кохезия сестринских хроматид первоначально теряется вдоль плеч, а затем в центромерах с помощью протеолитического расщепления Scc1p субъединицы. Такое слипание должно поддерживаться во время мейоза I и, кроме того, кинетохоры (мультибелковые комплексы центромер) должны регулироваться таким образом, чтобы обе сестринские хроматиды перемещались к одному полюсу скорее, чем отталкивались бы др. от др.
У дрожжей мутация в (synthetic lethal kar3) гена обнаруживает дефект мейоза, связанный с нарушением контроля поведения сестринских хроматид: скорее, чем формирования тетрад, содержащих четыре гаплоидные споры, эти мутантны образуют диады с двумя диплоиными спорами. Сестринские хроматиды расходятся у мутантов к противоположным полюсам. Более того большинство мутантов не проходят второго мейотического деления, поэтому образуют диады.
Локализация Slk19p во время мейоза. на Рис. виден синаптонемальный комплекс(красный цв.; парные мейотические хромосомы), а Slk19p-GFP (зеленый цв.). Slk19p локализуется в центромерных областях во время профазы I, и остается в них вплоть до анафазы I. Затем Slk19p теряет свою связь с центромерами и обнаруживается вдоль всего веретена, откуда он исчезает, когда центромеры мигрируют к полюсам во время мейоза I.
Локализация Slk19p во время мейоза. на Рис. виден синаптонемальный комплекс(красный цв.; парные мейотические хромосомы), а Slk19p-GFP (зеленый цв.). Slk19p локализуется в центромерных областях во время профазы I, и остается в них вплоть до анафазы I. Затем Slk19p теряет свою связь с центромерами и обнаруживается вдоль всего веретена, откуда он исчезает, когда центромеры мигрируют к полюсам во время мейоза I.
Такое расположение указывает на то, что Slk19p м. удерживать сестринские хроматиды вместе во время первого мейотического деления. Предполагается, что он влияет на Rec8p, который у дрожжей явлется мейоз-специфическим гомологом Scc1p. Rec8p д.б. локализован в центромерах, чтобы гарантировать сестринским хроматидам слипание во время мейоза I. Каким.обр., Slk19p предупреждает деградацию Rec8p? Было установлено, что во время ранней стадии мейоза I, локализация Rec8p is наотличима у slk19 и линий дикого типа. В анафазе I, однако, Rec8p сохраняется в центромерах 80% клеток дикого типа, но в большинстве slk19 клеток Rec8p практивески отсутствует.
Предполагается, что Slk19p действует на нижестоящий др. мейоз-специфичный фактор, кандидатом на эту роль является meiotic regulatory protein, . Rfr spo13 nfr slk19 мутанты имеют дефекты в поведении сестринских хроматид во время мейоза. Оба белка участвуют в одном и том же пути.
|
ORIGINAL RESEARCH PAPER Mayer, M. L. et al. Identification of RFC(Ctf18p, Ctf8p, Dcc1p): An alternative RFC complex required for sister chromatid cohesion in S. cerevisiae. Mol. Cell 7, 959-970 (2001) | | | FURTHER READING Koshland, D. E. & Guacci, V. Sister chromatid cohesion: the beginning of a long and beautiful relationship. Curr Opin Cell Biol 12, 297-301 (2000) | | | |
Слипание сестринских хроматид происходит в S фазе, но механизм неясен. Привлекательна модель, согласно которой спаривание происходит после прохождения реплткационной вилки, когда сестринские хроматиды находятся в тесной близости. Mayer et al., идентифицировали комплекс, который связывает компоненты ДНК репликации кухни (machinery) с возникновением слипчивости сестринских хроматид.
Mayer и др. идентифицировали у Saccharomyces cerevisiae ген, названный . Они обнаружили, чтио ctf8 линия обнаруживает нестабильность хромосом и что она чувствительна к деполимеризующим микротрубочки веществам, указывая на то, что продукт гена Ctf8 участвуетв сеграгации хромосом. Авт. обнаружили, что гомозиготные ctf8 диплоиды накапливаются на ст. G2/M перехода. Затем Mayer et al. комбинировали делецию в CTF8 с мутациями генов, участвующих в генерации и поддержэании слипчивости сестринских хроматид. Они нашли, что жти комбинации являются синтетическими леталями, указывая тем самым на роль Ctf8 в этом процессе.
Установлено, что он ассоциирует с не меньше чем с 6 др. белками - , , и 4 'RFC' белка ( , , и ), называемых так, потому что они являются частью комплекса replication factor C (RFC). Этот комплекс состоит из Rfc1, 2, 3, 4 и 5, нагружает processivity фактор, называемый proliferating cell nuclear antigen (PCNA), на ДНК во время репликации ДНК. CTF18 тоже был открыт ранее как mis-segregation мутация, он обнаруживает существенную гомологию с RFC белками, очобенно с Rfc1.
Mayer и др. предположили, что они идентифицировали 'alternative' RFC комплекс, который участвует специфически в кохезии сестринских хроматид. Очевидно Ctf18 замещает Rfc1 в этом RFC комплексе и Ctf18 обеспечивает тем самым ассоциацию Rfc2, 3, 4 и 5 с Ctf8, возможно посредстом Dcc1. Как RFC (Ctf18, Ctf8, Dcc1) комплекс связывает репликацию с кохезией сестринских хроматид? Возможно, альтернативный RFC комплекс м. нагружать ДНК полимеразы селективно на сайты, в которых отложен cohesin (комплекс, который закрепляет сестринские хроматиды соединенные вместе).
Evidence that replication fork components catalyze establishment of cohesion between sister chromatids Carson D.R, Christman M.F.
PNAS 98, no 15. p.8270-8275 (2001)
PNAS 98, no 15. p.8270-8275 (2001)
(Рис.1.) | Steps in sister chromatid cohesion during the chromosome cycle. Red lines represent a single double-stranded chromosome, and blue lines represent cohesive bonds between chromatids
(Рис.2.) | The "Cohesin" complex is a key component of the chromatid glue. (A) SMC heterodimers are shown in an extended conformation, which may allow simultaneous binding of two sister chromatids. (B) SMC heterodimers are shown with the hinge region flexed, so that a pair of heterodimers could be bridged by non-SMC subunits.
(Рис.3.) | Model for cohesion establishment by replication-related activities. Precohesion site is meant to show the cohesin complex, because it is known to bind to G1 chromosomes. A cohesion site is a functional protein bridge formed after fork passage. The cartoon is not meant to imply the existence of direct protein-protein interactions, because such interactions have not been demonstrated to date.
(Рис.4.) | Polymerase switching on Okazaki fragments may be analogous to what happens at cohesion sites
Cohesion and the Chromosome Cycle
Спаренные сестринские хроматиды должны оставаться в ассоциации др. с др. с момента их образования в S-фазе до их разделения в анафазе (Рис. 1). Эта ассоциация называется sister chromatid cohesion и происходит в отдельных местах вдоль всей длины хромосомы. Наблюдение за динамикой хромосом указывало на то, что кохезия удерживает геометрию пар сестринских хромосом так, что сестринскрие кинетохоры обращены лицом в противопложные направления, что облегчает их соединение с микротрубочками веретена, исходящими от противоположных полюсов веретена. Слипание происходит до конденсации хромосом; следовательно, места кохезии м. влиять на архитектуру хромосом во время конденсации. И в самом деле, конденсированные сестринские пары обнаруживают зеркальную симметрию, которая м. возникнуть из-за того, что слипание происходит в специфических последовательностях. Слипшиеся сестринские пары составляют существенную часть хромосомного цикла и м. предопределять топлогические домены, которые влияют на др. аспекты хромосомной динамики. Механизм контрольно-пропускного пункта (КПП)(checkpoint) гарантирует, что слипание не исчезнет вплоть до тех пор, пока все сестринские пары не будут ориентированы для равного распределения, позволяя веретену ощущать натяжение и/или занятость микротрубочек. Регуляция устранения слипчивости и мейотической кохезии рассмотрена в обзорах Nasmyth K, Peters J.M. & Ulman А (Science V.288,1379. 2000) и Dej K.J. & Orr-Weaver T.L. (Trends Cell Biol. V. 10, p. 392. 2000). В соответствии с предположением о том, что слипчивость возникает в результате образования белковых мостиков, обнаружено, что удаление слипчивости нуждается в убиквитин-зависимом протеолизе с помощью убиквитин-лигазы, наз. комплексом, способствующим анафазе.
Genes Required to Maintain Sister Chromatid Cohesion
PDS1 ген (Premature Dissociation of Sisters) выявлен первым у мутантов, дефектных по кохезии. Оказалось, что Pds1 является мишенью для убиквитин-зависимой деградации убиквитиновой лигазой anaphase-promoting комплекса в определенный момент клеточного цикла, так же кае и его гомолог Сге2 у делящихся дрожжей. Однако Pds1 не связывается с хромосомами, а значит является ключевым негативным регулятором удаления кохезии скорее, чем белком, который м. непосредственно поддерживать слипчивость хроматид.
Контроль за удалением слипчивости является критичекой точкой обратной связи в клеточном цикле для поддержания интегрированности генома, т.к. аккуратная репарация ошибок в репликации ДНК и восстановление неправильно расположенных хромосом становятся невозможными, когда начинается анафаза. У почкующихся дрожжей КПП (checkpoints) осуществляет арест клеточного цикла в момент перехода от метафазы к анафазе скорее, чем на границе G2/M. В самом деле, блокада деградации Pds1 является мишенью как для КПП повреждений ДНК, так и для КПП сборки веретена.
Поиск дальнейших генов, участвующих в слипчивости хроматид, привел к обнаружению Structural Maintenance of Chromosome (SMC1 и SMC3) генов, членов законсервированного семейства хромосомных АТФаз, некоторые из которых участвуют в конденсации хромосом. Smc1 и Smc3 формируют комплекс, который кроме того включает в свой состав два не-SMC белка, Scc1 и Scc3 y Xenopus, дрожжей и клеток человека. Этот комплекс назван "cohesin" .
Smc1/Smc3 "Cohesin" Complex
Бактериальные Smc белки (Bacillus subtilis BsSMC и E.coli MukB), которые формируют гомодимеры скорее, чем гетеродимеры, образуют длинные антипараллельные суперскрученные спирали с высоко флексибельной внутренней шарнирной областью. Др. родственный Smc белок, Rad50, образует гомодимеры со сходной структурой. Эукариотический cohesin по аналогии скорее всего связывается непосредственно с ДНК с помощью двух Smc субъединиц, образующих длинные антипараллельные суперскрученные структуры. Эти структуры указывают на то, что имеется симметрия у концов cohesin Smc гетеродимера , причем каждый конец должен связывать одну из сестринских хроматид и держать их вместе (Рис. 2А). В соответствии с этим предсказанием С-терминальная область Smc белков необходима для связывания ДНК. Кроме того установлено, что cohesin человека м. стимулировать способность ДНК топоизомеразы II связывать ДНК окружности в реакции in vitro и способствовать лигации линейной ДНК с помощью ДНК-лигазы, свойствам, которые являются результатом его способности одновременно связывть две разные молекулы ДНК.
В строго определенное время удаления слипчивости устраняется Scc1 субъединица из хроматина посредством сайт-специфического протеолиза. Этот протеолиз обеспечивается действием caspase-подобной Esp1 (separin) протеазы , которая действует непосредственно на Scc1. Все это указывает на то, что cohesin является критической частью хроматидного клея (Рис. 2В).
Еще один белок PDS5 существенен для поддержания слипчивости, он эволюционно законсервирован и удаляется из хромосм с кинетикой идентичной кинетике Scc1. Более того, локализация Pds5 на хромосомах нуждается в Scc1 cohesin субъединице. PDS5 и его гомологи у Sordaria macrospora (Spo76) и Aspergillus nidulans (BimD6) существенны для сегрегации митотических хромосом.
Sites of Cohesion
Cohesion комплекс ассоциирует с хромосомами в определенных местах, с центромерами и вдоль хромосомных плеч. Центромерные области являются большими сайтами связывания cohesion, с ассоциацией, распространяющейся на нескоько килобаз в каждом направлении, nulf как сайты в плечах хромосом длиной примерно в 9 т.п.н. со строгой предпочтительностью к АТ-богатым межгенным областям у S.cerevisiae. Эти сайты обычно в 500-800 п.н. обозначаются как cohesion attachment regions (CARs). Субъединицы cohesion комплекса связаны с CARs с поздней G1 до анафазы. Pds5 также соединяется специфически с CARs областями. Комплекс cohesin загружается на хромосомы в местах "precohesion" в поздней G1 с помощью реакции, которая нуждается в Scc2/Scc4 белковом комплексе. Некоторые сайты CAR картированы с высокой точностью и они четко отличаются от источников репликации, которые обнаруживаются примерно через каждые 45-90 т.п.н. у S.cerevisiae.
Building Chromatid Bridges Occurs During S-Phase
Комплекс cohesin формируется на стадии S-фазы. Это подтверждено и данными, показавшими, что Scc1 cohesin субъединица должен присутствовать во время S-фазы, чтобы cohesion оказался эффективным во время G2.
Дальнейшие доказательства того, что слипчивые мостики образуются во время S-фазы получены с идентификацией нового типа кохезивной молекулы. Ген CTF7/ECO1 необходим не только для формирования cohesion в S-фазе, но и в G2/M для поддержания кохезии. Напротив, комплекс cohesin необходим для установления кохезии в S-фазе и для поддержания кохезии в G2/M. Биохимическая функция CTF7/ECO1 неизвестна, но он скорее всего является необходимым инструментом для образования кохезивных мостиков. Летальный эффект ctf7-203-ts мутантов м.б. супрессирован избыточной экспрессией PCNA, processivity фактора для некоторых ДНК полимераз. Это важное наблюдение указывает на то, что образование слипчивости не только происходит во время S-фазы, но и м., действительно, обеспечиваться с помощью компонентов репликационной вилки.
Trf4p DNA Polymerase σ Links Replication and Cohesion
Недавно описана ДНК полимераза Trf4/Pol σ, которая необходима для установления кохезии во время S-фазы ( Trf4/Pol σ это новое название для Trf4/Pol κ), в то время как dinB1 человека, обозначается теперь как Pol κ.
Trf4/Pol κ м.б. ключевой связью между репликационной кухней (machinery) и cohesion machinery. Это строго подтверждает идею, что компоненты вилки играют активную роль в установлении слипчивости. Интригующе, что ген ECO1/CTF7 у S.pombe существует как ген слияния ECO1/CTF7 домена с η-подобным доменом ДНК полимеразы.
Pol σ S.cerevisiae кодируется двумя гомологами TRF4 и TRF5. Условные двойные trf4 trf5 мутанты при сдвиге к непермиссивной температуре неспособны заканчивать синтез ДНК, тогда как trf4 одиночный мутант имеет ослабленную S-фазу, которая неспособна обеспечить cohesion. Мутации с частичной потерей функции SCC1 или SMC1, субъединиц cohesion комплекса , летальны, если уровни Pol σ снижены из-за мутации trf4.
Идентифицированы два гена Pol σ/TRF4 у человека: hTRF4-1 на 5р15 и hTRF4-2 на хромосоме 16. hTRF4-1 продукт кодирует также ДНК полимеразу. DNA Pol σ/TRF4 является четвертой существенной ядерной ДНК полимеразой у дрожжей и, возможно, у всех эукариот, помимо полимераз α, δ и ε.
Итак, предполагается, что слипание сестринских хроматид активно устанавливается в репликационной вилке. В этой модели (Рис. 3) сестринские хроматиды никогда не отделяются др. от др. после репликации. Компоненты вилки должны каким то образом превращать сайт пре-кохезии в bona fide сайт кохезии. Репликация в отсутствие ЕСО1 или при пониженных уровнях Trf4/Pol σ обусловливает отсутствие кохезии. Молекулярные различия меэжду сайтом пре-кохезии и готовым сайтом кохезии неизвестны.
A Polymerase Switch Model for Cohesion Establishment
Предполагается, что Trf4/Pol м. функционировать, обеспечивая кохезию посредством механизма переключения полимераз, при котором основаные репликативные полимеразы используются для репликации от своего источника до cohesion сайта, но когда репликационная вилка наталкивается на cohesion сайт, то происходит переключение на ДНК pol σ. DNA pol σ и ассоциированные компоненты вилки затем катализируют образование кохезивных мостиков между сестринскими хроматидами еще неизвестным способом, т.к. cohesion site region (CAR) реплицируется. В этой модели, установление кохезии д. происходить посредством связанного с репликацией ремоделирования хроматина, аналогичного установлению молчания (silencing) в локусе HM у дрожжей, которое необходимо как для специфических цис-действующих последовательностей, так и репликации ДНК.
Комплекс cohesin располагается на CAR сайтах в поздних G1 хромосомах, и, следовательно, д. встречаться на пути активной репликативной вилки. Cohesins тесно связаны с хроматином и м. представлять собой барьер для прохо вилки, предодоление которого нужадется в действии специальной полимеразы. Сходное переключение полимераз, как полагают, происходит во время преодоления разных летальных повреждений ДНК. Или встреча cohesins м. просто служить сигналом компонентам вилки начинать переключение полимераз.
Эта модель предсказывает, что репликация через CAR сайты д. специфически нарушаться в отсутствие Trf4/Pol σ. Если наблбдается блок в сайте кохезии в отсутствие Pol κ, то это м .б. обусловлено отсуствием комплекса cohesin. Как известно, пауза в работе репликационной вилки происходит на центромерах дрожжей, основных сайтах ассоцииации cohesin.
Переключение полимераз, как полагают, происходит во время синтеза каждого фрагмента Okazaki, и это событие м. представлять собой paradigm для постулируемого переключения cohesion polymerase. Во время синтеза фрагмента Okazaki DNA Pol α/primase сначала делает короткие РНК праймеры и около 40 нуклеотидов iDNA (initiator DNA). После этого, оставшиеся 180 пар оснований, типичные для фрагмента Okazaki синтезируются с помощью высоко processive PCNA/Pol δ комплекса. Ключевым событием в сдвиге с Pol α к Pol δ является конкуренция между Pol α/primase и Replication Factor C (RFC) clamp-loader комплекса (Рис. 4). RFC комплекс состоит из пяти белков (Rfc1-Rfc5), которые эволюционной законсервированы. Pol α/primase является довольно distributive полимеразой и часто диссоциирует от конца primer/template, тогда как RFC обладает очень высоким сродством к вакантным primer/terminus. RFC связывает iDNA primer/terminus, когда Pol α отпадает. RFC затем открывает PCNA кольцо и топологически связывает PCNA/Pol δ с основой (backbone) ДНК на конце праймера, заканчивая тем самым переключение. Т.обр., переключение полимераз во время синтеза фрагментов Okazaki обеспечивается с помощью RFC комплекса, по крайней мере, in vitro (Рис.. 4 слева).
Может ли RFC комплекс каким-нибудь образом обеспечить переключение на Trf4/Pol σ в сайте кохезии? Для этого м.б. необходима манжетка разгружающая скоре, чем загружающая. Эквивалент E. coli RFC и в самом деле способен удалять, а также и загружать processivity манжетку (clamp). Новый RFC-подобный белок, Ctf18, необходим для cohesion. Ctf18 родственен всем пяти каноническим Rfc субъединицам по первичным последовательностям, но более всего с Rfc1. Идентифицирован белковый комплекс, который содержит Ctf18, Rfc3, и Rfc4, но не Rfc1. Это согласуется с очень похожим новым Rfc комплексом, участвующим в DNA damage checkpoint, в котором Rfc1 замещен Rad24. Гомолог Ctf18 присутствует у всех уже исследованных эукариот.
Предполагается, что модифицированный RFC комплекс м.б. необходим для облегчения переключения на Trf4/Pol σ в CAR сайтах. Модифицированный RFC м. или удалять PCNA-Pol δ на границк CAR сайтов или загружать PCNA-Trf4/Pol σ и тем самым облегчать работу Trf4/Pol σ (Рис. 4). То, что CTF18 не являюется обязательным м говорить о том. что его роль функционально перекрывается др. генами. Авт. наблюдали генетическое взаимодействие между TRF4 и CTF18, это подтверждает, что они действуют на общем пути.
Продукт гена CTF4 также физически асоциирован с Ctf18, хотя он и не родственен RFC, а нулевые мутанты CTF4 дефектны по кохезии. CTF4 идентифицирован независимо на основании биохимического свойства ассоциации с ДНК полимеразой свойства [известен также как POB1, Polymerase One Binding], это указывает на него, как на белок репликативной вилки. Существование модифицированной и эволюционно законсервированной версии канонического RFC комплекса указывает на то, что установление кохезии м.б. фактически целью субнабора репликационных компонент.
Cohesion and Cancer
Известно, что многие опухоли обладают свойством неправильной регуляции своих хромосом уже в очень раннем туморогенезе, независимо от плоидности. Это указывает на то, что фенотип неправильной регуляции (наз. "CIN" по chromosomal instability) скорее всего управляет туморогенезом, чем является вторичным эффектом трансформированного состояния.
Множество различных молекулярных событий необходимо, чтобы гараниторовать слюсьвено сегрегвцию хромосом. Некоторые гены, идентифицированные в этих исследованиях, затрагивают туморогенез, включая yeast BUB1-human BUB1 и yeast MEC1 -human ATM. Для подавляющего большинства CIN опухолей, молекулярные дейекты еще неизсествны. Процесс слипчивасти хроматид нуждается во многих законсервированных генах, которые м.б. дефектны в некоторых опухолях.
В самом деле, биохимический эксивалент человеческого cohesion regulator PDS1, наз. PTTG, способен рансформировать NIH 3T3 клетки в культуре. PTTG считается pituitary tumor-transforming геном и он избыточно экспрессируется в некоторых опухолях. Кроме того, ген SMC3 м. вызывать трансформацию при избыточной экспресии в нормальных фиброблестах.