Craniofacial Development
Черепно-лицевое развитие
Genetics
of Craniofacial Development And Malformation
Andrew O. M. Wilkie & Gillian M. Morriss-Kay
Nature Reviews Genetics 2, 458-468 (2001)
(Рис.1.) | Anatomical features of the human skull at birth
(Рис.2.) | Key stages in the development of the mammalian head
(Рис.3.) | Larva of the tunicate Clavelina.
(Рис.4.) | Range of midline malformations in holoprosencephaly
(Рис.5.) | Disorders of the skull vault.
(Рис.6.) | Molecular pathways in cranial suture development
of Craniofacial Development And Malformation
Andrew O. M. Wilkie & Gillian M. Morriss-Kay
Nature Reviews Genetics 2, 458-468 (2001)
(Рис.1.) | Anatomical features of the human skull at birth
(Рис.2.) | Key stages in the development of the mammalian head
(Рис.3.) | Larva of the tunicate Clavelina.
(Рис.4.) | Range of midline malformations in holoprosencephaly
(Рис.5.) | Disorders of the skull vault.
(Рис.6.) | Molecular pathways in cranial suture development
Нарушения черепно-лицевого развития у человека возникают в результате альтераций специфических эмбриологических процессов, таких как формирование паттерна головного мозга , миграция клеток, слияние тканей и дифференцировка кости.
Основные черепно-лицевые нарушения распадаются на несколько категорий в соответствии с их паттерном уродств и включают: голопрозэнцефалия, расщепление губы и нёба, уродства свода черепа (такие как craniosynostosis), и уродства первой и второй боранхиальных дуг, которые лежат в основе branchio-oto-renal и Treacher Collins синдромов.
Мутации мышей с потерей функции идентифицировали такие типы генов, которые подпадают под эти категории уродств и проливают свет на функцию генов, которые необходимы для нормального черепно-лицевого развития.
Классы генов, которые лажат в основе этих нарушений ранжируются от транскрипционных факторов и сигнальных молекул,потеря которых обусловливает определенные дефекты формирования паттерна, до генов, которые необходимы для миграции клеток и пролиферации клеток.
Наиболее общим механизмом, который дает черепно-лицевые дефекты у мышей и людей является гаплонедостаточность (haploinsufficieny), однако мутации с избыточной функцией в генах рецепторов fibroblast growth factor лезат в основе большинства синдромов craniosynostosis у человека, таких как Apert и Pfeiffer синдромы.
Изучение черепно-лицевых уродств показывает, что они часто возникают из слабых (subtle) повреждений в делениях клеток ы краниальной мезенхиме скорее, чем из-за дефектов основных паттернироующих процессов. Поэтому трудно идентифицировать генетические детерминанты нормальной изменчивости лицевого проявления.
| Expression and regulation of chicken fibroblast growth factor homologous factor (FHF)-4 during craniofacial morphogenesis I. Munoz-Sanjuan, M.K. Cooper, P.A. Beachy, J.F. Fallon, J. Nathans Dev. Dyn. 2001. V. 220. N 3. 238-245 |
Frontonasal process (FNP), lateral nasal processes (LNPs), maxillary processes (MXP) дают верхнюю челюсть, а mandibular process (MNP) дает нижнюю челюсть. FHFs (fibroblast growth factor homologous factors) участвуют в развитии нервной системы и конечностей мышей и кур.Паттерн экспрессии cFHF-4 в мезенхиме FNP и MXP у эмбрионов дикого типа и мутантов talpid2, а также у эмбрионов, обработанных ретиноевой кислотой, указывает на то, что cFHF-4 участвует в формировании паттерна лицевых зачатков. Другие FGFs играют роль в формировании лицевых структур, они экспрессируются в эпителии и передают сигналы подлежащей мезенхиме. Билатерально симметричная экспрессия cFHF-4 в мезенхиме FNP указывает на то, что экспрессия cFHF-4 м. регулироваться сигналами средней линии и/или эктодермы. Известно, что cFHF-4 участвует в формировании инициальных аксональных проэкций в конечности. Его паттерн экспрессии во время развития конечностей и лица у эмбрионов кур указывает на то, что одна функция cFHF-4 используется для обеспечения клеточной миграции.
Лицевые дефекты у talpid2 эмбионов затрагивают развитие верхней и нижней частей клюва. Это сопровождается аномалиями паттернов экспрессии компонентов, связанных как спередачей сигналов Shh так и ретиноевой кислоты. Предполагается, что экспансия и слияние по средней линии экспрессии cFHF-4 в мутантной talpid2 АТЗ и эктопическая экспрессия cFHF-4 в LNPs могут играть роль в возникновении лицевых дефектов у мутантов talpid2.
У эмбрионов, обработанных низкими дозами ретиноевой кислоты, зоны экспрессии cFHF-4 и cMsx-1 сливаются в дистальной части средней линии, что коррелирет с зауживанием FNP вдоль медиолатеральной оси. Этот паттерн согласуется с тем, что воздействие ретиноевой кислоты нарушает латеральную миграцию в дистальных частях FNP, но не паттерн хондргенеза, пролиферации и гибели клеток. Сходные патерны cFHF-4 и cMsx-1 в среднейлинии наблюдаются у talpid2 эмбрионов, это подтверждает идею того, что миграторные свойства мезенхимных клеток в FNP являются критическими для собственно слияния различных лицевых зачатков.
ЧЕРЕПНО-ЛИЦЕВОЕ РАЗВИТИЕ
Gene discovery in craniofacial development and disease – cashing in your chips
Tiong Yang Tan, Christopher T. Gordon,Kerry A Miller, David J. Amor and Peter G. Farlie
YPEL1 overexpression in early avian craniofacial mesenchyme causes mandibular dysmorphogenesis by up-regulating apoptosis
Developmental Dynamics Volume 244, Issue 8, pages 1022-1030, August 2015
Семейство генов YPEL (Yippee-like) представлено 5 высоко законсервированными членами (YPEL1-5), но их биологическая функция оставалась в основном неизвестной. Ранние исследования функции YPEL1 подтвердили, что он участвует в развитии структур, происходящих из фарингеальных дуг. YPEL1 человека располагается в дистальной части хромосомы 22q11.2 , а изменения в числе копий этого гена приводят к разным фенотипическим отклонениям, которые включают лицевой дизморфизм, асимметрию лица и аномалии нёба, характерные для синдрома 22q11.2 deletion/duplication (OMIM 611867). Поэтому была исследована роль YPEL1 в черепно-лицевом развитии кур с использованием ex vivo и in vivo подходов. Было установлено, что ретровирусом обеспечиваемая избыточная экспрессия in vivo YPEL1 вызывает аномалии морфогенеза нижней челюсти, ассоцированные с усилением апоптоза и вовлечением сигнального пути BMP/MSX. Это подтверждает, что экспрессия YPEL1 регулируется с помощью передачи сигналов ВМР и указывает на роль YPEL1 в патогенезе черепно-лицевых аномалий у человека с делециями и дупликациями дистальной части хромосомы 22q11.2.
Table 1. Comparison of microarray studies of the developing craniofacial complex including experimental design and data analysis
Gene discovery in craniofacial development and disease – cashing in your chipsGR Handrigan, M Buchtova, JM Richman 
Clinical Genetics, Volume 71, Issue 2, Pages 109-119
Clinical Genetics, Volume 71, Issue 2, Pages 109-119
YPEL1 overexpression in early avian craniofacial mesenchyme causes mandibular dysmorphogenesis by up-regulating apoptosis
Developmental Dynamics Volume 244, Issue 8, pages 1022-1030, August 2015
Семейство генов YPEL (Yippee-like) представлено 5 высоко законсервированными членами (YPEL1-5), но их биологическая функция оставалась в основном неизвестной. Ранние исследования функции YPEL1 подтвердили, что он участвует в развитии структур, происходящих из фарингеальных дуг. YPEL1 человека располагается в дистальной части хромосомы 22q11.2 , а изменения в числе копий этого гена приводят к разным фенотипическим отклонениям, которые включают лицевой дизморфизм, асимметрию лица и аномалии нёба, характерные для синдрома 22q11.2 deletion/duplication (OMIM 611867). Поэтому была исследована роль YPEL1 в черепно-лицевом развитии кур с использованием ex vivo и in vivo подходов. Было установлено, что ретровирусом обеспечиваемая избыточная экспрессия in vivo YPEL1 вызывает аномалии морфогенеза нижней челюсти, ассоцированные с усилением апоптоза и вовлечением сигнального пути BMP/MSX. Это подтверждает, что экспрессия YPEL1 регулируется с помощью передачи сигналов ВМР и указывает на роль YPEL1 в патогенезе черепно-лицевых аномалий у человека с делециями и дупликациями дистальной части хромосомы 22q11.2.
An unbiased, polygenic approach is needed to unravel the complex molecular bases of craniofacial development and disease. DNA microarrays, the current paradigm of genome-wide analysis, permit the simultaneous study of many thousands of genes, the ready identification of candidate molecules and pathways, and the compilation of gene expression profiles for whole systems – pathologic and embryonic alike. We survey the existing literature applying microarrays to craniofacial biology and highlight the value of animal models, particularly mice and chickens, to understanding molecular regulation in the craniofacial complex. We also emphasize the importance of functional studies and high-throughput assays to extracting useful data from microarray output. It is our goal to help put researchers and clinicians on the same page as microarray technology moves into the forefront of craniofacial biology.
Molecular regulation of craniofacial development
Лицо человека начинается как простой набор тканевых припухлостей или выпячиваний вокруг будущего рта. Каждое выпячивание представлено тонким слоем эпителия, покрывающим клестер мезенхимных клеток, происходящих из нервного гребня. В ответ на паттерн-формирующие сигналы, исходящие из соседних тканей (напр., носовой плакоды) и локальную мезенхимно-эпителиальную передачу сигналов лицевые выпячивания распространяются наружу и сливаются медиально, образуя окончательное лицо (1-8). Лоб, нос, фильтр, резцы и первичное нёбо происходят из медиального носового и парных носовых боковых возвышений. Стороны ротовой полости фланкируются максиллярными возвышениями и дают большую часть верхней губы, вторичное нёбо, верхнюю челюсть и скулы. Нижняя часть лица возникает из мандибулярного выпячивания, которое само по себе является производным первой глоточной дуги (9, 10).
Когда тщательная регуляция черепно-лицевого развития нарушается, то возникают врожденные дефекты. У человека наиболее часто возникают орофациальные расщепления (одно на 700 живорожденных), расщелина лица из-за отсутствия слияния выпячиваний или небных половинок (11-13). Хотя выделены некоторые причинные гены для синдромов, ассоциированных с расщеплением (14-17), генетические основы типичных, несиндромальных расщеплений менее ясны. На сегодня известны основные вовлекаемые гены, включая MSX1, MSX2, SPRY2, TBX10 и TGFβ3, помимо прочих (16, 18). Сходные мультифакториальные основы были установлены для craniosynostosis (7, 19), агенеза зубов (20-22) и holoprosencephaly (23). Разнообразие этих этиологий отражает основу интеграции и сложности молекулярной регуляции черепно-лицевого развития.
Стратегия генов кандидатов была недавно использована Abzhanov et al. (24) для изучения молекулярных основ морфогенеза клюва. Из списка в 10 ростовых факторов они идентифицировали Bmp4 в качестве детерминанта изменчивости размера клюва у 6 видов Галапагоских зябликов. Короче, они показали. что ген наиболее строго экспрессируется в более крупных клювах зябликов и что он может индуцировать изменения в толщине и глубине клюва в ответ на вирусную эктопическую экспрессию у кур. Неожиданно Bmp4 не оказывал эффекта на длину клюва. Из-за отсутствия соотв. прецедента в литературе авт. не смогли предопложить о возможном кандидате, регулирующем рост в этом направлении. Пригодность posteriori подхода для обнаружения генов целиком базируется на имеющемся запасе знаний.
Microarray approaches to gene discovery
Появление 'omics biology' в последнее десятилетие существенно расширило возможности биологии развитии молекулярной биологии. В одном эксперименте исследователи могут теперь идентифицировать многие неизвестные и известные гены кандидаты и пути или экстраполировать целые новые молекулярные пути из генов обладающих общим паттерном экспрессии. После своих исследованиях на зябликах Abzhanov et al. элегантно продемонстрировали ценность беспристрастного, полигенного подхода к открытию генов, участвующих в черепно-лицевом развитии (25). Они использовали сделанный на заказ микромассив комплементарной ДНК зяблика для скрининга регуляторов длины клюва у пяти видов Geospiza. Строгая дифференциальная экспрессия была отмечена для гена Calmodulin, который кодирует calcium сигнальную молекулу, которую ранее не связывали с развитием лица. Пространственная и временная экспрессия Calmodulin в развивающемся клюве безупречно коррелировала с окончательной длиной клюва, а его нижестоящий эффектор CaM kinase kinase (CaMKII) , как было показано, модулирует длину клюва у эмбрионов кур после вирусной неправильной экспрессии.
Массивы complementary DNA (cDNA) являются просто одной из граней в современной технологии микромассивов. Их значительная гибкость делает их пригодными для получения искусственных массивов для не-модельных видов (напр., зябликов) и специфических молекулярных путе (напр., TGFβ, Wnt). Для более широкого анализа транскриптома у модельных видов предпочтительнее базирующиеся на олигонуклеотидах массивы. Oligo массивы, нацеленные на специфические транскрипты используются в коротких комплементарных зондах, разработанных на базе геномных последовательностей. По сравнению с их cDNA аналогами, oligo массивы обеспечивают более всеобъемлющее покрытие генома (следовательно, включают больше неизвестных генов) и более подходящие для cross-platform сравнения (26). Кроме того с использованием биоинформационных программ (software) , учитывающих весь набор данных (таких как Ingenuity Pathway Analysis, Ingenuity® Systems) возможно идентифицировать, какие пути активируются и какие остаются репрессированными (избавляя от необходимости изготовления специфических чипов для путей). Более того, exonic, oligo массивы были недавно разработаны для изучения сплайс-вариантов, которые как известно, существуют для большинства генов (27).
В то время как технология микромассивов продолжает развиваться, существует ряд критических узких мест, ждущих разрешения. Во-первых и прежде всего затраты, ассоциированные с использованием генных чипов (~$1000/chip), которые часто заставлют исследователей ограничивать число биологических реплик в эксперименте (Table 1). Во-вторых, микромассивы могут давать смещенную картину генной экспрессии для транскриптов с небольшим количеством копий (напр., для транскрипционных факторов), часто выпадающих за пределы осуществимого диапазона. Эта изменчивость делает абсолютно необходимыми независимые экспериментальные оценки (Table 1). Наконец, плохая совместимость между некоторыми платформами делает обмен данными разочаровывающей и иногда бесплодной целью (26).
Table 1. Comparison of microarray studies of the developing craniofacial complex including experimental design and data analysis
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Craniofacial expression profiling during normal development
Несмотря на различные технологические вопросы, микромассивы уже начали давать информацию о сложной молекулярной регуляции развития лица в норме. Получены профили генной экспрессии для разных черепно-лицевых тканей животных, включая свод черепа (28), черепные швы (29-31), челюсти и нёбо (32-34) и зубы (35) (Table 1). Для большей части, однако эти исследования представляют собой лишь поверхностное исследование результатов микромассивов. За небольшими исключениями (25, 35, 36), функция генов кандидатов в целом не тестировалась. Во всех случаях оценка ограничивалась лишь предварительной характеристикой генов, тогда как неизвестные гены, включая expressed sequence tags (ESTs), и неаннотированные гены, полностью игнорировались. Хотя фактически неизвестные гены могут часто составлять 50% результата исследования микромассивов, а настоящая ценность микромассивов в их способности выявлять новых игроков в развитии.
В качестве примера того, как эксперименты с микромассивами могут быть использованы для открытия новых генов, экспрессирующихся в лице, мы опишем недавние некоторые неопубликованные данные нашей группы по эмбрионам кур. Мы обсудим только некоторые из выдающихся находок, полностью это будет опубликовано отдельно. Мы определили профили генной экспрессии в первой глоточной дуге и фронтоназальной массе на стадии 17/18 эмбриогенеза кур (приблизительно 5-я неделя у человека; Table 1). В нашем анализе всего 510 генов достоверно отличались между тремя выпячиваниями после учета вариации между тремя биологическими репликами (Fig. 1). Мы выявили значительное большее количество дифференциально экспрессируемых генов между фронтоназальной массой и максилярными выпячиваниями (427), чем между максиллярным выпячиванием и первой фарингеальной дугой (178). Как и ожидалось фронтоназальная масса также имела отличный профиль экспрессии от первой дуги (456 дифференциально экспрессируемых генов). Эти транскрипционные различия согласовались с относительно более близким эмбриональным происхождением между максиллярным и мандибулярным выпячиваниями (9, 37-42).
Рис.1. | Fig. 1. Distribution of genes according to Gene Ontology biological function for stage 18, chicken craniofacial microarray experiment. After analysis of variance test (p = 0.05) and removing duplicates, 510 genes were significantly different amongst the three facial prominences and had a fold change of at least 1.5.
Рис.1. | Fig. 1. Distribution of genes according to Gene Ontology biological function for stage 18, chicken craniofacial microarray experiment. After analysis of variance test (p = 0.05) and removing duplicates, 510 genes were significantly different amongst the three facial prominences and had a fold change of at least 1.5.
Мы установили, что большая пропорция дифференциально экспрессируемых генов (отличается больше чем в 1.5 раза, p меньше 0.05) составляла неизвестные ESTs и гены с распознаваемыми доменами (Fig. 1). Однако наши массивы давали нам не только снимок дифференциальной генной экспрессии на определенной стадии развития. Мы затем оценивали некоторые из известных генов, используя гибридизацию in situ. Преимущество гибиридизации in situ в том, что отсутствующая информация по др. стадиям, может быть получена. Напр., T-box транскрипционный фактор Tbx22 оказался одним из генов, найденным в массиве как более высоко экспрессирующийся в фронтоназальной массе, чем в др. частях лица. Анализ in situ выявил, что этот транскрпицонный фактор лишь слабо экспрессируется на стадиях, ведущих вверх к нашей временной точке (Fig. 2a, b). Однако на ст. 17/18, когда получали ткань наблюдалась строгая экспрессия в фронтоназальной массе (Fig. 2c, d). На ст. 20, транскрипты также обнаруживались в максиллярном и мандибулярном выпячиваниях, это было бы истолковано, что все три области на этой стадии неотличимы, если бы анализировались массивы (Fig. 2e, f). непосредственно перед слиянием губных отростков, наблюдалось резкое подавление в большей части фронтоназальных масс за исключением углов и наиболее каудального края (Fig. 2g). Tbx22 мутантен у пациентов с Х-сцепленным расщеплением нёба и с ankyloglossia (43-47) , а его экспрессия отмечается в нёбных половинках и языке. Наши in situ данные указывают на то, что Tbx22 может быть также ассоциирован с несиндромальным расщеплением губ с или без расщепления нёба, эта идея возникла в некоторых исследования на людях (48, 49).
Рис.1. | Fig. 2. Temporal and spatially restricted expression of two transcription factors. (a, b) Prior to tissue collection, very weak expression of Tbx22 was noted between nasal pits (arrows). (c, d) Strong signal in the frontonasal mass as compared to the first arch. White line outlines area of tissue collection. Microarray analysis showed 6.2-fold difference in Tbx22 expression between the frontonasal mass and the first pharyngeal arch. Although in situ hybridization has not yet shown discrete Tbx22 positive areas in the maxillary region or first arch, microarray analysis revealed 1.5-fold difference between the maxillary region and the first pharyngeal arch. Microarray is perhaps more sensitive than in situ hybridization. (e-g) More Tbx22 signal is visible in the maxillary and mandibular prominences but there is a decrease in the frontonasal mass by stage 26, except at the corners undergoing fusion (arrows). (h-k) Throughout many developmental stages, Dlx5 signal is strong in the first arch and absent from the frontonasal mass (except for the nasal placodes). Similarly, at stages 17-18 array analysis showed 2.22-fold higher expression in the first pharyngeal arch as compared to the maxillary prominence. a, c, e, g, k frontal views; b, d, f, h-j lateral view. Scale bar = 0.5 mm. Key: e - eye, fnm - frontonasal mass, md - mandibular prominence, mxp - maxillary prominence, np - nasal pit, pa1 - first pharyngeal arch, Stg - stage.
Рис.1. | Fig. 2. Temporal and spatially restricted expression of two transcription factors. (a, b) Prior to tissue collection, very weak expression of Tbx22 was noted between nasal pits (arrows). (c, d) Strong signal in the frontonasal mass as compared to the first arch. White line outlines area of tissue collection. Microarray analysis showed 6.2-fold difference in Tbx22 expression between the frontonasal mass and the first pharyngeal arch. Although in situ hybridization has not yet shown discrete Tbx22 positive areas in the maxillary region or first arch, microarray analysis revealed 1.5-fold difference between the maxillary region and the first pharyngeal arch. Microarray is perhaps more sensitive than in situ hybridization. (e-g) More Tbx22 signal is visible in the maxillary and mandibular prominences but there is a decrease in the frontonasal mass by stage 26, except at the corners undergoing fusion (arrows). (h-k) Throughout many developmental stages, Dlx5 signal is strong in the first arch and absent from the frontonasal mass (except for the nasal placodes). Similarly, at stages 17-18 array analysis showed 2.22-fold higher expression in the first pharyngeal arch as compared to the maxillary prominence. a, c, e, g, k frontal views; b, d, f, h-j lateral view. Scale bar = 0.5 mm. Key: e - eye, fnm - frontonasal mass, md - mandibular prominence, mxp - maxillary prominence, np - nasal pit, pa1 - first pharyngeal arch, Stg - stage.
Анализ наших микромассивов выявил также дифференциальную экспрессию транскрипционного фактора Dlx5. На тотальных препаратах строгая экспрессия обнаруживалась в первой дуге до и одновременно со стадией 17/18 (Fig. 2h). Затем уровни транскриптов увеличивались в носовых плакодах (Fig. 2i) и на каудальном крае каждого максиллярного выпячивания (Fig. 2j, k) , но экспрессия всё ещё была далека от наиболее сильной в мандибулярном выросте. Dlx5, как известно, специфицирует качественные особеннрости нижней челюсти, при генетической делеции его происходят mandibular-to-maxillary трансформации (50, 51). Наш анализ массивов д. был выявить др. гены кандидаты, которые важны для спецификации качественных особенностей выростов.
Некоторые гены, которые мы ожидали увидеть в нашем списке, не появились, возможно из-за того что они были в низких концентрациях. В самом деле, углубление в данные показало очень низкую интенсивность сигнала для эпителиально экспрессируемых генов (напр.. Fgf8, Bmp4). Т.о., одним из ограничений техники микровычленения для получения РНК является то, что мезенхимные гены должны быть более обильными, чем эпителиальные гены. Чтобы найти гены, специфически экспрессируемые в эпителии необходимо проведение ферментативного разделения для обогащения эпителия (52). Др. выбором является лазером осуществляемое микроиссечение (53) , которое также нуждается в экстенсивной амплификации РНК. Пока неясно, может ли этот метод дать достаточного качества РНК для анализа микромассивов черепно-лицевых тканей (52). Наконец, один из лучших методов очистки малых субнаборов клеток использует флюоресценцией активируемую сортировку клеток. Мыши, видоизмененные что имеют green fluorescent репортерный белок под контролем отобранных промоторных элементов являются прекрасным источником специфических клеточных популяций (54). Множество специфичных для лица репортерных конструкций необходимо разработать прежде чем этот метод сможет быть использован для черепно-лицевых исследований.
Значение генов, открытых после упомянутых выше исследований животных, для развития человека заключается в том, что во многих случаях существует консервация экспрессии генов и функции генов. Оэ возможно также прямое сравнение набора данных от животных и с таковыми для человека (проверка сходных тканей на сходных стадиях). Craniofacial and Oral Gene Expression Network (COGENE), консорциум исследователей из США и Франции, использует РНК из микровычлененных частей абортированных эмбрионов человека, чтобы получить микромассивы и провести серию анализов профилей генной экспрессии для черепно-лицевого комплекса человека. Их набор данных, который включает отдельные выпячивания в промежутке развития от 4-х до 8.5 недель развития, доступен для всеобщего использования на интернет сайте (http:///). COGENE это лишь самый поверхностный слой этих накопленных данных в отношении их исследования первой глоточной дуги (PA1) (33). Они сравнили профили экспрессии PA1 между 4 и 5 неделями и открыли множество во времени и пространстве дифференциально экспрессируемых генов. При межвидовом сравнении они также выявили сотни генов, уникальных для PA1 человека и множество др. общих с мышами. Мы как и др. обратились к этим данным массивов человека, чтобы обнаружить законсервированные гены, которые являются фундаментальными для формирования паттерна челюстей.
Expression profiling of treated or genetically modified animal tissues
Парные сравнения между 'base-line' профилями экспрессии и теми из экспериментально манипулируемых систем являются мощным средством для идентификации ключевых игроков в молекулярной регуляции болезней и развития. Среди соотв. литературы, касающейся черепно-лицевого развития обработка экзогенными молекулами (55, 56) и генетический нокаут у мышей (35, 57, 58) являются предпочтительными экспериментальными подходами. первый обладает преимуществом своим значительным разнообразием. Исследователи могут использовать разнообразные соединения (напр., белки, фармацефтические препараты, двунитчатые ДНК), чтобы сходным образом вызывать изменения в списке моделей, включая целые эмбрионы, экспланты органов или клеточные культуры. Mukhopadhyay et al. (55), напр., охарактеризовали экспрессию генов в первичных культурах эмбриональных максиллярных мезенхимных клеток после применения bone morphogenetic proteins 2 и 4 (BMP2 and BMP4).
Нижестоящие мишени из ряда важных черепно-лицевых генов недавно были тщательно исследованы с помощью анализа транскриптома мутантных мышей. James et al. (35) выявили множественность в нижестоящей передаче сигналов Runx2 путем сравнения профилей экспрессии между мышами дикого типа и нуллизиготными сибсами, несущими мутации по транскрипционному фактору. В частности они показали, что Runx2 оперирует посредством BMP пути в остеогенезе, но посредством fibroblast growth factor (FGF)-обеспечиваемого каскада в развитии зубов. Это разделение в передаче сигналов может объяснить различия в проявлениях cleidocranial dysplasia (CCD; OMIM #119600), синдрома, приписываемого мутациям RUNX2 (59). В то время как большинство CCD пациентов обнаруживает целую гамму скелетных дефектов (e.g. bulging calvaria, brachydactyly), др. демонстрируют a forme fruste, характеризующуюся только сверхчисленными зубами (60).
Ivins et al. (57) использовали сходный подход для изучения DiGeorge syndrome (DGS; OMIM #188400), созвездия врожденных уродств в тимусе, сердце и менее часто в нёбе. Авт. обнаружили экспрессию в фарингеальных дугах у мышей трансгетерозиготных по Tbx1 и полученную искусственно микроделецию в хромосоме 16, содержащей локус для Tbx1 и синтению с DGS-ассоциированной делецией в позиции 22q11.2 у человека (61). В исследовании РНК от Tbx1+/-: Df1/+ мышей гибридизировали с разными oligo-based платформами (Table 1) и гемизиготные гены были использованы для внутреннего контроля нормализации, что приводило к хорошей крос-платформенной конкордантности. Среди др. генов, оба чипа обнаруживали строгую экспрессию Aldh1a2 (Raldh2), который кодирует фермент. конвертирующий retinol в мощный морфоген ретиноевую кислоту (57). Гибридизация in situ тотального препарата Tbx1+/-: Df1/+ эмбрионов выявила эктопическую экспрессию aldh1a2 в проксимальной части максиллярной области лица, предшественника заднего нёба у эмбрионов кур (9). Это заставило авт. привлечь активированную передачу сигналов RA в этиологию DGS. В комплементарном эксперименте уровни эндогенной RA были увеличены с использованием антагонистов RA разрушающих энзимов (62). Tbx1 нокауты и DGS были фенокопированы путем обработки эмбрионов кур химическим ингибитором Cyp26 энзима. Наконец, пониженные уровни эндогенной RA, за счет введения aldh2a1 гетерозиготной мутации в компаундные гетерозиготы из двух генов внутри Df1 локусов, Tbx1 и Crk1, могут устранять DGS-подобные нарушения тимуса (63). Все эти данные отражают общее увеличение активности RA у мышей с фенокопиями DGS.
Clinical studies using microarrays
Большинство тканей теряют свой эмбриональный характер задолго до рождения с окончательной клеточной дифференцировкой. Следовательно, лишь РНК, получаемые из соотв. эмбриональных тканей во время соответ. временного окна, могут предоставлять пригодную информацию об эффектах генной экспрессии при болезнях. Получение таких выборок не легкая задача. Преодолевая эти препятствия, Lomri et al. (64) получили выборки костей свода черепа от двух 27-недельных плодов с диагнозам синдром Apert (OMIM #101200), который включает craniosynostosis и syndactyly. Затем они получили линию иммортализованных остеобластных клеток из швов нормальных и затронутых плодов и использовали РНК из этих клеток, чтобы получить профили генной экспрессии . Хотя эти авт. использовали микромассивы старого стиля, отпечатанные на мембранах, клеточные линии оказались пригодными для использования их для зондов геномных oligo-based массивов. Они идентифицировали ряд дифференциально экспрессирующихся генов (напр., GTPase RhoA), работающих ниже мутантной формы FGFR2, вызывающей болезнь. Успех этого исследования покоится на двух фактах: Apert синдром может быть легко диагностирован in utero, а образование швов происходит значительно позднее в развитии (после рождения у здоровых детей). Для большинства др. врожденных дефектов, включая расщепление губы, соотв. временное окно наблюдается значительно раньше во время беременности, когда получение клинических выборок невозможно. Животные модели более пригодны для изучения генной экспрессии дефектов с ранним началом, т.к. они могут быть изучены в любой момент развития.
Дифференцированные ткани, конечно, могут предоставить информацию о генетических основах врожденных дефектов. Comparative genomic hybridization (CGH) и single nucleotide polymorphism (SNP) подходы внимательно рассматривают геномную ДНК, которая обнаруживается почти во всех клетках человека, независимо здоровые они или аномальные. Обе платформы выявляют генетические аномалии такие как missense мутации и хромосомные микроделеции, которые могут лежать в основе врожденных черепно-лицевых дефектов. CGH уже была использована для обнаружения презумптивной этиологии для врожденной anopthalmia (65), facial dysmorphia (66) и Nablus mask-like facial syndrome (67).
Генетики сделали пригодным использование COGENE набора данных. В недавнем исследовании 58 пробанд-родители трио, где пробанд имел расщепление губы с или без расщепления нёба (68), идентифицированы 13 SNPs с использованием Sentrix Array (http:///). 10 из генов с достоверным неравновесным сцеплением, как было показано, экспрессируются во время соотв. стадий черепно-лицевого развития человека, исходя из базы данных COGENE. Некоторые ранее неизвестные кандидаты на роль oral clefts были идентифицированы и экспрессию этих генов у эмбрионов ещё предстоит исследовать. Т.о., выгоды COGENE усилий в отношении здоровья и болезней человека только начинают реализовываться.
Linking gene expression to function: high throughput functional assays
Очевидно, что оценка выполнима для огромного количества генов, которые выявлены при скрининге микромассивов, следующей целью является создание беспристрастных, высокопроизводительных методов по выявлению функции генов. Это может устранить предположения о избранных генах кандидатах и поощрить последующие исследования неохарактеризованных новых генов. Гипотетический функциональный скрининг генов, участвующих в в развитии скелета, напр., может использовать RNAi-обеспечиваемый нокдаун в остеогенной линии клеток млекопитающих (напр., MC3T3-E1) в качестве первого хода. Эта стратегия уже оказалась успешной для некоторых линий клеток млекопитающих и Drosophila(69, 70). В качестве второго скрининга д. быть изучена функция генов в micromass или первичной культуре клеток животных, которые являются наиболее близкой моделью эмбрионального развития (70). Наконец, RNAi последовательности, как уже было показано, эффективны в культуре клеток и могут использоваться в методах с целыми эмбрионами. RNAi нокдаун уже был опробован на ряде животных моделей, включая Caenorhabditis elegans, Drosophila, мыши, рыбки данио, Xenopus,и эмбрионы кур (71-74). Более того, рыбки данио и Xenopus, являются доказавшими свою пригодность моделями по индукции и миграции клеток нервного гребня и формирования паттерна фарингеальных дуг (75, 76), и они уже были использованы для генетического и химического скрининга с участием тысяч эмбрионов (77-80). Эмбрионы кур могут быть получены в столь же больших количествах и недавно соединили RNAi и retroviral misexpression технологии (71) с их помощью может быть исследованы онтогенетические аспекты (лицо, конечности, головной мозг) в отношении потери функции генов. Предприняты огромные усилия по мутированию или нокауту генов мышиных эмбрионов (81). В не столь далеком будущем могут быть установлены некоторые типы мутаций, затрагивающие функцию любого из генов мышиного генома. Функция генов, даже, новых генов. затем может быть оценена с использованием этих мутантов.
Conclusions and challenges for the future
Before the great promise of microarrays to craniofacial biology can be realized, current roadblocks to data exchange among researchers must be overcome. First and foremost, the technology requires further refinement. Specific goals include improving compatibility between platforms (26), extending chip coverage to include more novel genes and splice variants, and reducing the expense of the technology. As purveyors of chips work toward resolving these issues, individual researchers can do their part by designing microarray experiments and analyzing data in accordance to standards emerging from the literature (Table 1) and specific guidelines set forth by such standardization initiatives as Minimum Information About a Microarray Experiment (MIAME; http:///) (82). Furthermore, we recommend that researchers follow the lead of the COGENE consortium and make their published data available to the craniofacial community through such internet databases as the National Center for Biotechnology Information's Gene Expression Omnibus (http:///) and the European Bioinformatics Institute's Expression Profiler (http:///).
Only through concerted effort can craniofacial researchers make sense of the staggering output of microarrays and the even more staggering complexity of the developing face.