Посещений:


Glycosylation Pathways
ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ

Characterizing glycosylation pathways

Kevin J Yarema, Carolyn R Bertozzi
Genome Biology 2001 2(5): reviews0004.1-0004.10

Поверхность клеток млекопитающих декорирована комплексом углеводов.  Эти сахара в отдельности известны как гликаны, а вместе составляют гликокаликс ( glycocalyx), собранный из олиго- и поли-сахаридов

>
(Рис.1.)  |  An overview of the glycosylation process

Гликаны обеспечивают коммуникации с внешним миром  и играют критическую роль при оплодотворении. Углеводы продолжают играть критическую роль в течение всего развития и вносят вклад в жизнь зрелого организма. Их аномалии м. приводить к врожденным аномалиям  и к опухолям. Немногие гены известны, влияющие на гликозилированиеs. В отличие др. структурных молекул, таких как белки и нуклеиновые кислоты  олигосахариды не являются первичными продуктами генов.
Общераспространенные сахара, нуждающиеся в ко-субстрате и многие энзимы, необходимые для синтеза сложных углеводов, уже известны. Неясно как эти молекулы работают сочетано так, что превращают небольшое число простых моносахаридов в точный паттерн сложных гликанов клеточной поверхности, которые для каждого типа клеток  обеспечивают уникальную репродуцируемую особенность (identity) (Рис. 1).


(Рис.2.)  |  Molecular details of glycan biosynthesis




(Рис.3.)  |  Factors that impinge on oligosaccharide biosynthesis and result in altered cell surface glycan display




(Рис.4.)  |  Lectin-based cell-selection strategies




(Рис.5.)  |  Strategy for metabolic cell selection for defects in the sialic acid pathway




(Рис.6.)  |  Molecular outcomes of ManLev-based selection

Conversion of monosaccharides into complex oligosaccharides

Метаболические пути, ответственные за  обеспечение каждой клетке ее уникального набора олигосахаридов, делятся на две стадии (Рис. 2а).
Ранняя ступень связана с превращением моносахаридов, получаемых с пищей или из рециклинга и хранилищ, (Рис. 1) в nucleotide-sugar доноров. Эта стадия обычно характеризуется фосфорилированием одной или нескольких гидроксильных групп моносахаридов.  Кроме того они часто вовлекаются в инверсию стереоцентров, чтобы превратить один сахар в родственный эпимер (epimer). В некоторых случаях необходима последовательное действие нескольких энзимов, чтобы трансформировать один моносахарид (такой как  ManNAc; см. (Рис. 1) в совершенно другой сахар (такой как сиаловая кислота см. Рис. 2b).
Однажды фосфорилированный моносахарид, получивший желаемую стереохимическую  конфигурацию, превращается в  UDP, GDP, или CMP аналог (в зависимости от сахара) и в  nucleotide-sugar донора. Нуклеотид функционирует как группа, обладающая высокой энергией, достаточной для сборки моносахаридов в углеводный комплекс в результате ступенчатого действия группы энзимов, известных как  glycosyltransferases, большинство из них располагается в аппарате Гольджи (Рис. 2c). Каждая ступень - это выбор соотв. glycosyltransferases со сходной, но несколько отличной специфичностью к субстрату. Точный состав финального продукта детерминируется, по крайней мере частично, маршрутом перехода растущего олигосахарида по секреторному пути, контактируя или избегая определенных  glycosyltransferases. В результате один из белков м.б. декорирован определенным олигосахаридом, тогда как другой, копия первого белка или даже альтернативный сайт гликозилирования того же самого белка м.б. связан с другим олигосахаридом (Рис.1)и (Рис. 2c).
Отличие  glycoconjugate у разных типов клеток является следствием внутриклеточных метаболических механизмов, реагирующих в большинстве случаев на внешние стимулы (Рис. 3).

Glycosylation changes associated with disease states

Аномалии, связанные с заболеваниями, являются основными источниками  информации о разнообразии в экспрессии гликанов (Рис. 3c). Эти дефекты в большинстве случаев возникают в результате дисфункции отдельных энзимов. Однако многие дефекты гликозилирования вызывают эмбриональную летальность.
Наиболее прямым методом получения редких клеток с дефектом гликозилирования является использование токсических лектинов. Лектины распознают и связываются со специфическими остатками сахаров. Некоторые лектины бифункциональны: помимо сахар-связывающего домена они содержат цитотоксический  (обычно ribosome-inactivating) домен. Редкие мутантные клетки потерявшие связывающий мотив, выживают (Рис. 4a).
Большинство этих токсинов нуждается в ретроградном транспорте в Гольджи или эндоплазматический ретикулем прежде чем они поступят в цитоплазму, поэтому мутанные клетки м.б. и результатом  транспортных дефектов, не имеющих отношения к гликозилированию.  Поэтому для отбора мутантов используют  флюоресцентную метку, нетоксические лектины (или специфичные к углеводам антитела) (Рис. 4b).
Современные методы отбора направлены на последнюю ступень биосинтеза  glycoconjugate, обычно или Golgi transporter или glycosyltransferase стадию (Рис. 2c, 2b)

Externally supplied substrates can illuminate 'masked' metabolic defects

Внешние влияния м. модулировать пути гликозилирования клетки (Рис. 3c). Внеклеточные сигналы м. запускать изменения в биосинтезе олигосахаридов.  Например, ammonia м. оказывать выраженный эффект на наличие углеводных эпитопов на клеточной поверхности.  A  substrate-based intervention легко обратимы и позволяют использовать количественный анализ.
Путь сиаловой кислоты способен энзиматически  преобразовывать неестественные аналоги (Рис. 5). Производные N-acetylmannosamine (ManNAc) м.б. конвертированы в их соответствующие аналоги сиаловой кислоты, располагающиеся на клеточной поверхности.  Использование аналогов, таких как  N-levulinoylmannosamine (ManLev) вызывает включение уникальной химической метки, с функцией кетона,  в гликокоъюгаты клеточной поверхности в форме модифицированной  sialic acid SiaLev (Рис.5). Способность реагировть на кетон-специфические зонды, такие как biotin hydrazide, с engineered сиаловой кислотой позволяет предложить схему отбора клеток с использованием способности ManLev успешно проходить весь путь (Рис. 5). Соотв., мутации, которые или усиливают или уменьшают способность неестественного субстрата экспрессироваться на клеточной поверхности, обнаружимы по всей длине или даже выше пути, проходимого аналогом.
Путь сиаловой кислоты иллюстрирует молекулярную природу ранней стадии 'masked' мутаций, которые м.б. выявлены с помощью подхода. базирующегося на неестественных субстратах (Рис. 6). Один из мутационных исходов, выявляемый с помощью  селекции, базирующейся на ManLevв клетках  Jurkat (T-lymphoma derived) человека, это мутантная форма UDP-GlcNAc epimerase. Мутантный энзим является устойчивым к ингибированию аллостерической обратной связью, из-за потери связи с нижестоящим метаболитом,  CMP-Sia (Рис.6, 1). Причина молекулярного дефекта, одиночная аминокислотная замена, идентична той, что найдена при врожденной болезни человека sialuria, вызывает избыточную продукцию ManNAc, причем конкурентно исключая ManLev с пути и устраняя экспрессию SiaLev на клеточной поверхности. Из-за притока естественного субстрата,  ManNAc, продолжает свой путь, при этом не происходит измененеия экспрессии  гликанов клеточной поверхности в отсутствие ManLev.
Др. преимуществом метаболической селекции, базирующейся на субстрате, является способность быстро компилировать объемные билиотеки мутаций.  Напр., при sialuria охарактеризованы только 3 мутации у пациентов, т.к. болезнь очень редкая. В отсутствие структурной характеристики эти ограниченные данные м. приводить к предположению, что мутации затрагивают регуляторный домен в UDP-GlcNAc 2-epimerase. Substrate-based подход позволяет быстро получать большое число мутаций, на их основе и было установлено существование предполагаемого регуляторного домена.
Др. early-stage замаскировнной молекулярной аномалией, выявлемой только при использовании метаболического селекционного метода, является дефект sialic acid synthase (Рис. 6, 2). В нормальных клеточных культуральных условиях эта мутация будет комплементирована поступлением сиаловой кислоты из сыворотки в культуральную среду. В животных моделях, неспособность продуцировать сиаловую кислоту вызвает гибель эмбрионов из-за важной роли этого сахара в развитии.  Следовательно, только  substrate-based подход способен выявить эту аномалию. Др. важным свойством этого подхода является его пригодность для отбора мутаций с избыточной функцией или избыточной экспрессией. Так, ManLev-based отбор дает мутантные Jurkat клетки, которые начинают экспрессировать полисиаловую кислоту (poly-Sia), и как следствие усиление экспрессии NCAM (Рис. 6c). Эта аномалия параллельна изменениям углеводов клеточной поверхности, наблюдаемым в высоко метастазирующих опухолях.
В будущем, использование метаболических substrate-based forward genetics методов будет расширено за пределы биосинтетического пути сиаловой кислоты. Факт, что клетки м. включать 'ketoGal', кетон-содержащий аналог GalNAc, в гликаны клеточной поверхности открывает дверь для стратегии селекции, использующей молекулярные дефекты, затрагивающие внутренние позиции комплекса полисахаридной цепи. Вместе, селекционная стратегия, базирующаяся на неестественных субстратах, которая направлена на терминальные остатки сиаловой кислоты (доступная с помощью ManLev) и на позицию, проксимальнее пептидного backbone в O-сцепленных гликопротеинах  (доступная с помощью ketoGal) облегчит идентификацию новых генов и регуляторных контрольных точек, которые располагаются на путях к мишеням.

Future challenges

Несмотря на то, что десятки и возможно сотни энзимов участвуют в биосинтезе олигосахаридов, прямой подход с секвенированием остается обескураживающим.  Еще более проблематичные ситуации, при которых причина аномалий гликозилирования не связана с энзимами, непосредственно участвующими в метаболизме углеводов.
Усиление активности NCAM в ManLev-селектированных Jurkat клетках - пример молекулярных дефектов, которые не связаны непосредственно в путем биосинтеза олигосахаридов, а повидимому затрагивают состав сахаров клеточной поверхности.   Neo-экспрессия NCAM, ведущая к экспозиции полисиаловой кислоты на клеточной поверхности, м.б. результатом регуляторных пертурбаций в одном или нескольких еще неидентифицированных транскрипционных факторах. В этом случае м. участвовать не один ген  в качестве причинного фактора. Молекулярные методы еще недостаточно разработаны. Напр., microarray анализ, базирующийся на обширных библиотеках single-nucleotide polymorphisms (SNPs), который теперь используется для развития proteomic подходов, сможет пролить свет на то, как молекулярные игроки физически взаимодействуют др. с др.  и их окружением.

Наконец, необходимо транслировать первичные молекулярные дефекты на общий метаболизм клетки и функционирование всего организма.  Снова пример с клетками 'sialuria' (Рис. 6a). Эффекты одиночной аминокислотной мутации в UDP-GlcNAc 2-epimerase отражаются скорее всего на всей клетке, влияя на метаболические события, удаленные от путей гликозилирования. Напр.,увеличение синтеза сиаловой кислоты в таких клетках требует значительного отвлечения  phosphoenolpyruvate (PEP) от его обычной роли по продукции энергии. Сходным образом, поодукция CMP-Sia отвлекает CTP от обычных клеточных функций, включая синтез РНК и ДНК.  Несмотря на это мутантные клетки продолжают процветать, возможно в результате перестройки притока через множественные метаболические пути, тип изменения которых м.б. определен только с использванием  genome-wide подхода.

В будущем, когда весь геном у высших организмов будет известен, молекулярные дефекты, обнаруживаемые в единичной клетке м.б. внесены в анологичные энзимы стволовых клеток.  Уже такие методы  'reverse genetic' используются для нематод Caenorhabditis elegans. Вскорe эти м-ды будут распространены и на системы млекопитающих и м.б. использованы для решения проблем устранения эмбриональной летельности. Ожидается и быстрый прогресс в выявлении молекулярных сил, упарвляющих биосинтезом олигосахаридов.