Хотя активин был и все еще является великолемной моделью действия морфогена, он м.б. не обязательным для раннего формирования паттерна у позвоночных. Однако, по крайней мере два родственных фактора роста, Nodals и bone morphogenetic proteins (BMPs), определенно ими являются. Они распределяются gradually и эта постепенность иллюстрирует определенные трудности в получении ясных ответов на вопрос где и когда морфогены действуют in vivo. Первой ступенью было клонирование "activin receptors" - рецепторов, которые определенно связывают и делают возможной передачу сигналов активина, но м. иметь широкий круг лигандов из суперсемейства TGF-β. Было установлено, что они являются трансмембранными серин-треониновыми киназами, сходными с TGF-β рецепторами, функционирующими в виде гетеродимеров из рецепторных белков Type I и Type II. Были получены kinase-dead мутантные версии и использованы в качестве диминантно негативных реагентов. Фенотипы, возникающие в результате потери функции, вызываемые экспрессией мутантных рецепторов активина, обнаруживают отсутствие индукции мезодермы и превращения проспективных энтодермальных клеток в нейроэктодермальные. Это было первым указанием на то, что активин-подобная активность недостаточна, но обязательна для мезодермального и энтодермального ("mesendodermal") развития и что помимо потенциальной роли в формировании дорсо-вентрального паттерна активин-подоная активность необходима для формирования паттерна зародышевых слоев анимально-вегетативной оси. Однако, интерпретация таких экспериментов затруднена из-за очевидной перекрестной специфичности мутантных рецепторов и способности разных Type I и Type II рецепторов гетеродимеризоваться др. с др. Т.о., нельзя сказать, что мутанты блокируют передачу сигналов эндогенного активина, а только некоторые активин-подобные сигналы. Более того, отсутствие активиновой РНК у ранних эмбрионов и неспособность специфических активин-блокирующих реагентов нарушать нормальное развитие укащывают на то, что эндогенным играком м.б. вовсе не сам активин.
На мышах и рыбках данио получены более убедительные доказательства существования in vivo существенной дорсо-специфичной активин-подобной активности и что эти гены идентифицированы как ген
nodal у мышей и
nodal-родственные гены
cyclops и
squint у рабок данио. Белки nodal, подобно активину, являются членами сверхсемейства TGF-β. Мутантные
nodal мыши не имеют первичной полоски и всех аксиальных структур, тогда как мутанты рыбок обнаруживают сильно разрушенные оси, но сохраняют общую осевую организацию и некоторые сомиты. Фенокопии
Xenopus мутантов nodal получены в результате экспрессии антагонистов nodal. Эти фенокопии включают Lefty2/antivin и cm-Xnr2, доминантную ингибиторную форму
Xenopus nodal-related-2. Как и в случае потери функции nodal у данио, эмбрионы
Xenopus , обработанные антогонис тами имели нарушенную, но не отсутствие осевой организации. Ситуация осложнена у
Xenopus наличием нескольких nodal-related генов с соотв. сайтами экспрессии и индуцирующей активности, а именно, Xnrs 1, 2, 4, 5,
и 6, и белок Derriere. Различия между мышами, с одной стороны, и рыбами и лягушками, с другой, м.б. также связаны с предачей сигналов между эмбриональной и внеэмбриональной частями у мышей или вообще с сохранением материнских факторов, которые обеспечивают остаточную передачу сигналов. Это м. иметь отношение к тому, что у
Xenopus nodals 1, 2, и 4, и Derriere являются прямыми ранними мишенями для матерински кодируемого T-box транскрипционного фактора VegT и что VegT (известный также как BraT, Xombi) и близко родственный Antipodean белок распределены в виде градиента от вегетативного к анимальному полюсу в яйце (see Fig. 3). Эксперименты по ослаблению VegT показали, что он необходим для образования энтодермы и позиционирования др. зародышевых листков вдоль анимально-вегетативной оси.
Получены доказательства как непрямого не-клеточно-автономного действия VegT с помощью nodals , так и прямого клеточно-автономного действия на гены мезодермальных маркеров, причем прямое действие зависит от дозы, это указывает на то, что VegT служит в качестве внутриклеточного морфогена, неотличимого от bicoid у
Drosophila
Если nodals необходимы для формирования нормального осевого паттерна, то они должны действовать градированным морфоген-подобным образом in vivo и если этот так, то когда и где? Дозовая зависимость была продемонстрирована для activin в клетках эксплантов,см. выше, подобные же доказательства получены и для эндогенно экспрессирующихся nodal сигналов in vivo. Исследования эктопической экспрессии у рыбок данио показали, что Squint (хотя не Cyclops) м. индуцировать различные типы клеток дозово-зависимым способом в дорсо-вентролатеральной последовательности. Более того, прогрессивное ослабление сигнала у мутантов с отсутствием nodal ко-рецептора (One-Eyed Pinhead/Cripto) прогрессивно устраняет ткани в предсказуемой последовательности. У Xenopus титруемая экспрессия экзогенного Cerberus-short, антогониста nodal, продуцирует прогрессвную ventrolateral-to-dorsal ослабление активности мезодермального гена brachyury и это градированное ослабление подтверждает наличие функционального дорсовентрального градиента сигналов nodal.
Но снова четкие доказательства дорсовентрального градиента получены в экспериментах Cho и др., в которых они идентифицировали элемент в промоторе Organizer (dorsal)-специфическом гене
goosecoid, который ответственнен за активин-подобные(или nodal-подобные) стимулы. Когда этот элемент был соединен с репортерным геном и инъецирован в эмбрионы, то не выявлялось различий в активности репортерного гена между дорсальной и вентральной сторонами эмбриона. Имеются, однако, vegetal-to-animal различия, согласующиеся с градиентом индукции с помощью материнского VegT, действующего посредством nodals. Одним из объяснений этого м.б. то, что дорсовентральные различия яволяются слишком слабыми или слишком динамичными, чтобы их м.было бы обнаружить с помощью репортерного гена. Доказательства, подтверждаеющие динамическую природу передачи сигналов nodal и вообще наиболее ясная демонстрация прямого градированного действия эндогенного сигнала nodal-типа in vivo получены при изучении внутрикелточной трансдукции сигналов nodal. Подобно др. факторам сверхсемейства TGF-β nodal сигналы действуют посредством рецепторов, которые фосфорилируют внутриклеточные Smad белки (Smad2 в случае и activin и nodal). Анализ передачи сигналов nodal с высоким разрешением облегчается доступностью антител, которые специфически выявляют активированную (фосфорилированную) форму Smad2. Такой анализ показал, что имеется и в самом деле вегетативно-анимальная градация фосфо-Smad2. Влоль дорсовентральной оси паттерн динамической активации наблюдается такой, что передача сигналов инициируется дорсально и распространяется (progressed) в дорсо-вентральной последовательности, безусловно затухая в той же самой последовательности что и волна активации, распространяющаяся поперек эмбриона, следуя за волной подавления (down-regulation) или негативной обратной связи. У эмбрионов рыбок данио сходная динамическая волна пердачи сигналов наблюдается в экспрессии чувствительного к nodal гена
bikhari. Эти данные являются прекрасным доказательством, по крайней мере одного "well-behaved" себя вегетативно-анимального nodal градиента и возможно второго дорсально-вентрального функционалного градиента или распространяющегося фронта, действующего чуть позднее и с помощью некоего более динамическго механизма. Заметьте, что даже перемещающийся фронт активации должен, если клетки м. со временем интегрировать активацию, интегрироваться как градированный сигнал (Рис. 2). Однако, следует отметить, что nodals в конечном счете экспрессируются вдоль всей дорсовентральной оси, с экспрессией (на уровне РНК) прогрессирующей от дорсальной стороны к вентральной стороне эмбриона. Т.о., они необходимы только для действия всего на расстояние нескольких клеточных диаметров, чтобы сформировать паттерн всей мезодермы и энтодермы. Следовательно, возможно, что nodals действительно действуют клеточно автономно и что их градированное действие - , измеренное по прогрессивной экспрессии и прогрессивному фосфорилированию Smad - является функцией еще до градиента чего-то еще. Однако, на границах домена его экспрессии, скорее всего что nodal белок будет действовать как морфоген in vivo, даже если это действие распространяется на короткое расстояние, соответствующее нескольким клеточным диаметрам. Действие на короткие расстояния не мешает активности морфогена. Напр., градиент морфогена Wingless (Wnt) необходим для формирования паттерна малой шкалы (fine-scale) сегментов
Drosophila. Обнаружение такого градиента у
Xenopus или рыбок данио находится за пределами разрешения анализа.У эмбрионов мыши ситуация м.б. более сложной, т.к. функции организатора (Organizer) разделены между эмбриональным узлом и переденей висцеральной энтодермой и т.к. оба они оперируют в быстро растущем и жилдком клеточном содержимом (context).
Хотя nodals м.б. более важными, чем активин в качестве дорсализующих факторов в раннем развитии и действуют они по-разному, но активин все еще используется как модельный морфоген в экспериментах, анализирующих диффузию морфогена в тканях.
MORPHOGENS IN VIVO. PART II: FGFS
AND BMPS
Факторы FGFs не были столь интенсивно исследованы как классические морфогены. Напр., у
Xenopus, он чаще всего рассматривается как мезодермальный индуктор ил фактор компетентности, который обеспечивает позитивную петлю обратной связи для поддержания индуцированного nodal мезодермального гена
brachyury. Однако, FGF м.б. также морфогеном. Эксперименты по дозовой зависимости вместе с активином подтверждают модель, согласно которой FGF представлен в виде анимально-вегетативного (т.e., приблизительно передне-заднего) градиента в мезодерме. FGF, по-видимому. способен диффундировать на расстояние нескольких клеточных диаметров и как полагают, является морфогеном для формирования раннего заднего паттерна нервной системы у
Xenopus: embryonic FGF (eFGF) м. действовать на ст. гаструляции, чтобы индуцировать экспрессию задних Hox генов и задних нейральных маркеров. Однако, более детальный анализ FGF's потенциальной морфогенетической активности затруднен из-за быстрого увеличения анатомическрой сложности. Интересны попытки оценить количественно FGF активацию in situ с высоким разрешением, используя studies анти-phospho-ERK антитела, которые выявляют передачу синалов FGF signal, сейчас phospho-Smad2 антитела получены и для передачи сигналов nodal.
В конечностях позвоночных, имеются некоторые указания на то, что FGF м. действовать как проксимо-дистальный морфоген. До сих пор формирование проксимодистального паттерна объясняли с помощью модели т.наз. прогрессивной зоны. Эта модель не базируется на морфогене, в ней FGF в основном поддерживает клеточную пролиферацию в дистальной мезенхиме, а клетки формируют паттерн в соответствии со временем. которое они провли в этой прогрессивной зоне. Однако, эта модель была поставлена под сомнение доказательтвами, что спецификация паттерна осуществляется за счет более статического механизма в ранних зачатках конечностей и что FGF в апикальном эктодермальном гребне играет роль анти-апоптозного фактора. Эта модель ставит два связанных с градиентами вопроса: что за молекулы специфицируют домены в ранних зачатках конечностей и каков механизм, обеспечивающий прогрессию детерминации стабильных судеб?
BMPs (за исключением BMP1) являются членами TGF-β сверхсемейства. У частие BMPs в морфогенетических градиентах впервые было отмечено при изучении ортологов ВМР у
Drosophila,
Decapentaplegic (
Dpp), для которого продемонстрировано участие в дорсо-вентральной дозо-зависимой спецификации типов клеток. Если происходит избыточная экспрессия BMP4 у эмбрионов
Xenopus, то в результате наблюдается четкая вентрализация и исчезнеовение Organizer. Экспрессия доминантно-негативной мутантной формы BMP рецептора соответственно блокирует вентральное развитие и инджуцирует частичные эктопические оси, если РНК инъецируется на вентральную сторону. Ясно, что BMPs действуют во время ст. гаструлы, ограничивая дорсализующие эффекты Organizer. BMP2, BMP4 и BMP7 мутанты, экспрессирующиеся соответсвенно у
Xenopus, а BMP2 (
swirl) и BMP7 (
snailhouse) мутанты у рыбок данио, дорсализованы.
Когда были клонированы дорсализующие молекулы noggin и chordin, то вскоре стало ясно, что это антогонисты BMP. Noggin клонирован в результате инъекций пула in vitro-транскрибируемых РНК в ранние эмбрионы и наблюдения признаков образования эктопической оси. Позитивные пулы были затем подразделялияь и повторно исследованы вплоть до одиночных РНК, содержащих ось-индуцирующую активность. В результате клонировано несколько интересных генов. Chordin клонирован в качестве гена, богатого в дорсальных областях эмбриона. Выделение достаточного количеста материала из специфических анатомических областей облегчается большими размерами эмбрионов
Xenopus embryos, а дорсализующие манипуляции оказались единственно возможными из-за доступности ранних эмбрионов и их изученности. Установлено, что белки noggin и chordin связывают непосредственно BMP4, чтобы ингибировать его активность.
Антогонизм между BMP и chordin пример консервации эмбриональных механизмов формирования паттерна. У
Drosophila, BMP гомолог Dpp противостоит гомологу chordin, short gastrulation (sog). Они сохраняют дорсализующую и вентрализующую активность в экспериментах с перекретстно-видовой экспрессией. Правда, BMP является вентральным, а chordin дорсальным, а у мух напротив: Dpp является дорсальным, а
sog вентральным. Это согласуется с некоторыеми анатомическими особенностями, из которых наиболее наглядые те, что нервный тяж вентрален у мух и дорсален у позвоночных. Это подтверждает старую идею, что позвоночные и артроподы обладают общим "bilaterian" предшественником, один из которых был инвертирован в ходе эволюции.
Напр., BMP1 и его гомолог у
Drosophila, Tolloid, в отличие от др. BMPs, являются протеазами, оба функционируют, расщепляя и тем самым инактивируя BMP/Dpp антогонистов chordin/sog. Twisted gastrulation является непосредственно связывающим BMP антогонистом/модулятором, который также законсервирован у мух и позвоночных. Т.о., дорсовентральный антогонизм ранних
Drosophila и
Xenopus эмбрионов является изощренным балансом сил. Устойчивость к нарушениям градиентов д. зависеть от обратных связей и антогонистических механизмов, поэтому неудивительно, что ранние эмбрионы регулируют эти мощные морфогены посредством антогонизма на множественных уровнях.Кроме того, антогонистические морфогены способны в приципе обеспечить четкие пороги чувствительности как часть механизма "winner-takes-all" . Существование дополнительных ингибиторов, а именно, белков follistatin, cerberus и gremlin, подтверждет это мнение.
Каковы же доказательства, что система BMP является морфогенетической in vivo? Лучшее доказательсто этот то, что BMP4 целиком соответствует определению морфогена.
Правда, имеются некоторые доказательства того, что градиент активности BMP4 используется не для градированного распределения BMP4 как такового, а для обратного градированного распределения своих ингибиторов, noggin и chordin.
MORPHOGENS IN VIVO. PART III:
INTERACTING MORPHOGENS
Морфогены существуют не только в сверхсемействе TGF-β. Существует два упрощенных обобщения, которые помогают понять сложность морфоген-зависимого формирования паттерна. Первое, хотя имеется множество lqcndbntkmys[ или похожих молекул морфогенов, фактически имеется относительно небольшое количество форм "usual
suspects (подозреваемых)" и второе, что эти немногие часто действуют в комбинации, или ортогонально, in opposition, или с быстрой succession. Так, Gerhart описал 5 основных путей, которые высоко законсерированы в эволюции и повторно используются в раннем развитии и др. 5 общих путей в позднем развитии и органогенезе. Ранние пути это Wnt-β-catenin genm, receptor
serine-threonine kinase (TGF-β superfamily) путь, receptor tyrosine kinase
(epidermal growth factor [EGF], FGF, etc.) пути, Hedgehog путь и Notch/Delta путь. За возможным исключением Notch/Delta передачи сигналов, которые в целом управляют ингибирующими сигналами от соседних клеток, каждый из этих путей м. оперировть в парах,
некоторые из которых м. действовать как ортогональные градиенты. Напр., intersection (т.e., пространственное перекрывание) Wnt-β-catenin-родственных сигналов и TGF-β (nodal) сигналов запускает локальную инициацию
Xenopus Organizer.
Специфически, Организатор генерируется взаимодействием, по крайней мере одного prior "south-north" градиента (VegT) с локальной концентрацией (еще неидентифицированных) "dorsal determinants" на одной стороне раннего эмбриона (Рис. 3). Градиент VegT индуцирует nodals, тогда как дорсальные детерминанты действуют подобно сигналу Wnt в том смысле, что они ведут к локальному обогащению внутриклеточным β-catenin. Организатор формируется там, где промежуточная концентрация активности nodal совпадает с высокими уровнями β-catenin. Возможно интерпретировать это пространсвенное ограничение как чистый и простой комбинаторный механизм без участия градиентов. Однако, имеются некоторые указания на то, что м. работать более изощренный механизм ортогональных градиентов. Организатор полностью структуирован даже на ранних стадиях.
М. предположить, что дорсальные детерминанты (или β-catenin? которым они богаты)
составлют или инициируют градиент морфогенеа снаружи -> кнутри (Рис.3 ). Градиенты д.б. чисто внутриклеточными (т.e., VegT и β-catenin) и/или экспрессироваться в виде концентрационных градиентов внеклетоных факторов роста (nodal). Такие ортогональные градиенты м. состоять из TGF-β (nodal) и FGF. Конечно, ортогональность не является несгибаемым правилом. Напр., Wnt и TGF-β (т.e., BMP) действуют в противоположных градиентах, чтобы сформировать паттерн нервной трубки.
Тем не менее, идея ортогональных градиентов создает настоящие Картезианские (Cartesian)
координаты для клеток, что очень привлекательно. Напр., молекулы формирующие паттерн мещзодермы у
Drosophila. Исследования потери функции и целенаправленной неправилной экспрессии Wingless (Wnt) и Dpp (BMP)показали, что ортогональные полоски этих факторов детерминируют предшественников мышечных клеток. Внутри кластеров этих предшественников происходит даленйшее формирование паттерна с помощью FGF и EGF. Точный тип мышц зависит отлокальной концентрации EGF, это подтверждает, что градиенты, а не только бинарные комбинации ростовых факторов м.б. важными.
Как градиенты морфогенов интерпретируются и как морфогены собственно распределены.
INTERPRETATION OF GRADIENTS. PART
I: THRESHOLD RESPONSES AND SHARPENING MECHANISMS
Превращение аналога входящего сигнала (input) (концентрации морфогена) в
digital исход (output) (т.e., одна клеточная судьба или др.) является интригующим, доволно необычным процессом в том смысле, что как биологи, мы больше используем довольно постепенные изменения в пространстве и во времени. На практике, конечно,пороговые реакции широко распространены. Чтобы дать отличающиеся типы клеток, интрерпретация морфогена д. базироваться на остроте (sharpness) пороговых реакций на клеточыне стимулы. Эти находки указывают на определенного типа кооперативность, ведущую к ступенчатой S-образной (sigmoid) реакции интерпретации клетками. Спустя определенное время инициальная ступень сигмовидной реакции м.б. сильно обострена за счет позитивной обратной связи, перекрстного ингибирования (Рис. 4) и физических механизмов, таких как клеточная сортировка.
Элегантным примером простой кооперативности в развитии является промотор
hunchback у
Drosophila. Здесь, происходит прямое кооперативное связывание множественых молекул Bicoid для того, чтобы найти промотор
hunchback, в раннем эмбриональном синцитии. Градиент морфогена в таком случае, необременен необходимостью присутствия рецепторов клеточной поверхности и молекул сигнальной трансдукции. Др. пример, который работает ортогонально по отношению к Bicoid и
hunchback, это регуляция
dorsal с помощью basic helix-loop-helix транскрипционных факторов. Важным фактором в кооперативности такого базирующегося на промоторе переключения является, по-видимому, присутствие конкурентных ингибиторов. Детальная оценка такого типа молекулярного переключения получена в более ранних исследованиях промоторов фага lambda и переключения транскрипции с помощью действия белка на хромосому. Др. крайностью являются кооперативные взаимодействия, происходящие с рецепторами и ассоциированными кофакторами и трансдукционными молекулами на поверхности клетки. Примерами этого являются хорошо известные реакции иммунных клеток на разные уровни антигена. В промежутке, кажущийся довольно простым механизм позитивной петли обратной связи внутри каскада сигнальной трансдукции киназ, обеспечивающий практивески переключение типа все-или-ничего, как в случае активации MAPK с помощью прогестерона ооцитах
Xenopus. В этом случае, петля обратной связи обеспечивается фосфорилированием MAPK более вышестоящего трансдуктора, Mos, что ведет к увеличению накопления Mos белка.
У
Xenopus детальный анализ регуляции
Xenopus brachyury (
Xbra)мезодермального гена выявил, что как позитивные, так и негативные петли обратной связи участвует в его пороговой реакции (Рис. 4). С увеличением дозы активина индуцируется транскрипция сначала Xbra, а затем и goosecoid. Первоначальные границы доз индукции Xbra связаны с инициально довольно "нечеткими" дозовыми порогами, но они прогрессивно уточнаяются (sharpens) со временем в течение нескольких часов. Идентифицированы два механизма, которые вносят вклад в это уточнение порогов. Одним из таких механизмов является клеточный контакт-зависимый и согласующийся с позитивной петлей механизм обратной связи между Xbra экспрессией и передачей сигналов FGF. Т.о., FGF индуцирует транскрипцию гена Xbra и в свою очередь белок Xbra является транскрипционным фактором гена FGF. Такая аутокаталитическая петля имеет тенденцию амплифицировать низкий уровень экспрессии Xbra, но не играет роли в отсутствие Xbra; хотя, она и делает более четким порог экспрессия/отсутствие экспрессии. Проявлением этого является "community effect", при котором критическая масса (т.e., количество) кластрированных Xbra-позитивных клеток необходимы для поддержания судьбы мышечных клеток. Этот эффект проявляется в образовании сэндвичей из активином-индуцированных клеток или одиночного или в глыбках между неиндуцированными анимальными шапочками. Активином обработанные клетки, окруженные необработанной тканью ревертируют к эпидермальной судьбе, тогда как глыбки индуцированных клеток дифференцируются в мышцы.
Этот эффект опосредуется eFGF и возможно возникает в результате процесса, при котором eFGF в изолированных индуцированных клетках диссипирет слишком быстро, чтобы быть в состоянии поддержать индуцированное состояние cells.
Второй механизм ограничения порогов дозовой зависимости Xbra, который был описан, это перекрестное ингибирование Xbra с помощью goosecoid. Специфически, goosecoid индуцируется только высокими дозами activin/nodal и репрессирует экспрессию Xbra.
Goosecoid является сам по себерепрессором транскрипции и, по-видимому, репрессирует Xbra непосредственно. Xbra, с др. стороны, не м. непосредственно репрессировать экспрессию Goosecoid, но вообще-то редуцирует его поддержку или посредством FGF или внутриклеточно вообще-то посредством супрессии действия Xlim-1 и Otx1. Такого типа перекрестная репрессия скорее всего является общим свойством интерпретации морфогена клеткой, т.к. активная репрессия, по-видимому, является более важной по сравнению с активацией в детерминации пространственно ограниченной репрессии некоторых генов.
Анализ точности градиентов морфогенов у ранних эмбрионов
Drosophilaиллюстрирует, что еще очень многое предстоит узанть о механизмах увеличения резкости порогов градиентов и точности развития. Изучение тонкого распределния Bicoid и Hunchback белков у ранних эмбрионов показало, что хотя распределение Bicoid очень изменчиво, распределение Hunchback (который в первую очередь регулируется с помошщью Bicoid) чрезвычано плотное в определенных критических позициях эмбриона (viz.вариация средней на эмбрион 30% и 4% длины яйца для Bicoid и Hunchback, соотв.). Более того, распределение Hunchback хорошо масштабировано к общей длине яйца, тогда как распределение Bicoid нет. Далее было установлено, что среди всех генов кандидатов и из большой пропорции цеого генома только ген, который отвечает за точность градиента Hunchback является материнским геном
staufen. Механизм, с помощью которого продукт гена
staufen обеспечивает такую точность все еще неизвестен.
INTERPRETATION OF GRADIENTS. PART
II: FROM RECEPTORS TO NUCLEUS
Механизмы поддержания порогов предполагают простую количественную корреляцию между концентрацией внеклеточного морфогена и внутриклеточной активацией имеющих отношение к делу трансдуцирующего(х) фактора(ов). Однако, неизвестно м. ли идти речь о любом из морфогенов, т.к. определенно м. существовать и др. механизмы. У
Xenopus детальный анализ того, как клетки "воспринимают (sense)" прилагаемую концентрацию ростового фактора проводился в серии элегантных опытов Gurdon и сотр. с использованием активниа в качестве модельного морофгена. Было показано, что пороги чувствительных доз, обнаруживаемые в клетках
Xenopus м.б. конвертированы в позиционную информацию. Конструировали искусственные источники активина (кусочки, смоченные фактором роста) и помещали их рядом с тканью чувствительной анимальной шапочки. Наблюдали, что такие кусочки провоцируют волну или волновую пульсацию экспресссии
Xbra, что сопровождается появлением домена экспрессии
goosecoid в тесной близи к кусочку. Т.о.,
Xbra и
goosecoid
транскрипционные ответы обнаруживались дальше от и бли;е к кусочку, соотв., как и ожидалось исходя из высокого-к-низкому градиента активина в ткани. Ткань накапливает и "запоминает" концентраци активина, которые она восприняла, феномен обозначен как " храповик (ratchet)-подобный" механизм. Это контрастирует со многими биологическими системами, где стимулы сопровождаются затуханием (damping) или привыканием, что ведет к временному скорее, чем кумулятивному эффекту. Пометив белок активин, удалось показать, что чувствительность клеток зависит от абсолютного количества рецепторов, занимающих (скорее, чем скажем, от соотношения занятых и незанятых рецепторов) и это количество относительно невелико: на клетку, приблизительно 100 для транскрипции
Xbra и 300 для
Gsc. Важно, что активин соединяется с высоким сродством и длительной оккупацией (off-time лиганда), это создает основу для кумулятиивной памяти об концентрации активина.
Детальное понимание механизма передачи сиглалов сверхсемейства TGF-β предоставляет существенную информацию о том, как работают сигналы активина и возможно nodal. Путь трансдукции короток: лигандом димеризованные рецепторные киназы фосфорилируют внутриклеточные Smad белки (преимущественно Smad2 для activin и
nodal; Smad1, Smad5, и Smad8 для BMPs). которые затем с помощью кофакторов вступают в ядро и действуют как позитивные транскрипционные факторы. Учитывая каталитическую природу рецепторных киназ, этот процесс должен по теории быть высоко амплифицированным (как это имеет место в случае с пргестероном и MAPK каскадом). Однако, трехкратного отличия в ядерной концентрации фосфорилированного Smad2 достаточно чтобы дифференцировать Xbra и Gsc ответы, точно также как и ответы на внешнюю концентрацию активина, и это изменение, вызывающее изменение активина будет менять количество ядерного Smad2 в точном соотношеними 1:1. Эти находки показывают, что не происходит амплификации сигнала активина. Установлено, что обмен (turns over) Smad2 довольно быстрый и это является продолжением активности serine-threonine киназ, возможно с активированных рецепторов, это необходимо для поддержания ядерных концентраций Smad2.
Итак, мы имеем картину, в которой активин накапливается на рецепторах и остается здесь, обеспечивая продолжение фосфорилирования Smad 2 а, следовательно, продолжение притока Smad2 из цитоплазмы к ядру. Этот механизм объясняет эффект храповика (ratchet) и клеточную память о приложенной дозе активина. Было бы интересно узнать, оперирует ли nodal или любой др. член сверсемейства TGF-β точно таким же образом.
По ходу развития, клетки теряют свою способность отвечать на специфические индуцирующие агенты, в случае акивина, это происходит во время гаструляции. Эта потеря компетентности обеспечивается исключением Smad2 из ядра. Потеря компетентности является важной, как способ ограничения распространения сигнала и для поддержания многочисленных раундов формирования паттерна, с помощью которых эмбрион подразделяется на все меньшие и меньшие территории.
ESTABLISHMENT OF MORPHOGEN
GRADIENTS. PART I: EVIDENCE FOR DIRECT, LONG-RANGE ACTION
Хотя и возможно определить внутриклеточный градиент Bicoid in situ на уровне распределения РНК и белка для длительного периода времени, однако имеется определенный пессимизм относительно возможности определения градированного распределения факторов роста in vivo. Дело в том, что ростовые факторы чрезвычайно мощны, часто имеют биологические эффекты уже на picomolar концентрациях и , следовательно, м.б. никогда не обнаружены с помощью обычной техники антител. Однако, достигнут определенный успех в определении градиентов морфогена in situ в тканях позвоночных с помощью антител. Напр., улучшенные антитела позволяют продемонстрировать градиенты морфогенов Sonic Hedgehog и Indian Hedgehog в некоторых структурах (напр., зубах, нервной трубке, сомитах) эмбрионов мыши. У
Xenopus также получена прямая визуализация ранних эндогенных секретируемых морфогенов. Для этого использовали смоченные ростовым фактором кусочки для визуализации искусственных градиентов активина и TGF-β1 на физиологических функциональных уровнях, которые продуцируют соотв. дозо-зависимые эффекты. У
Drosophila, использование green fluorescent protein (GFP)-нагруженного Decapentaplegic (Dpp), позволило визуализировать градиент этого морфогена.
Даже без прямой визуализации имеются доказательства прямого действия некоторых морфогенов на расстоянии в несколько клеточных диаметров. Считалось в течение длительного времени, что ретиноевая кислота является морфогеном, которая обеспечивает формирование паттерна переднезадней оси конечностей позвоночных, детерминируя количество и тип пальцев. Это мнение базировалось на дозово-зависимых экспериментах. Однако, эксперименты с репортерным геном ретиновевой кислоты, среди прочих, показали, что ретиноевая кислота не действует как морфоген, а вместо этого локально индуцирует источники реального морфогена с прямым, распространяющимся на дальнее расстояние действием, а именно белка Sonic Hedgehog.
Доказательства возможности прямого дальнодействия сигналов морфогенов TGF-β сверхсемейства также обнаружены у
Xenopus. Направленность является важной, т.к. по ней отличаются морфогены от индукторов морфогенов (как в случае Shh/retinoic
acid). Во-первых, активированные мутации по activin/nodal рецепторам действуют клеточно-автономно, исключая тем самым механизм, с помощью которого активин или nodal индуцируют вторично дальнодействующий фактор ("relay mechanism"). Во-вторых, активин и TGF-β1 способны перадавать сигналы поперек слоя клеток, лишенных рецепторов, указывая тем самым, что эти факторы не являются индукторами др. морфогенов и , следовательно, действуют непосредственно на клетки на некотором расстоянии от своего источника. Использование клток, лишенных рецепторов, привело к сходному заключению относительно передачи сигналов Dpp (BMP4) и Wingless (Wnt) у
Drosophila.
У
Xenopus использование лигандов и рецепторов (activin и TGF-β1 и TGF-β рецепторов) невозможно, т.к. они не экспрессируются у эмбрионов.
Доказательства прямой передачи сигналов с помощью морфогенов сверхсемейства TGF-β у позвоночных получены на рыбках данио. Установлено, что Squint (nodal) вызывает дальнодействующие эффекты, которые зависят от nodal корецептора One-Eyed
Pinhead/Cripto, после этого сигналы пересекают клетки, лишенные этого корецептора.
Однако, даже Squint распределение эндогенного nodal, вызывает некоторые предостережения. Во-первых, хотя и используется "endogenous" лиганд, он экспрессируется эктопически в данном эксперименте. Во-вторых, отсчетом для этих экспериментов была транскрипция маркеров, отвечающих на nodal (хотя и отвечающих непосредственно), и отсутствовала прямая визуализация градиента. В-третьих, мутантные клетки, лишенные корецепторов, м. давать аномально пермиссивную ткань для дальнодействующей диффузии лиганда. Т.о., хотя доказательства того, что активин и нодал способны к дальнодействию в тканях при коректных условиях, специфические доказательства прямого дальнодействия in vivo мучительно неполны.
Сходные эксперименты были использованы, чтобы показать, что Sonic Hedgehog (Shh) действует прямо, дозо-зависимым и на длинные расстояния в нервной трубке эмбрионов кур. Изменения силы сигнала Shh от хорды м. сдвигать положение различных позиционных маркеров в лежащей сверху нервной трубке, но если клетки на разных расстояниях от источника сделать нечувствительными к Shh (с помощью экспрессии мутантного рецептора, то их судьбы сдвигаются. Кроме того для морфогенов Hedgehog и TGF-β-related activin и nodal получены доказательства на
Xenopus бластуле и гаструле для дальнодействия ингибиторов BMP noggin и chordin. Учитывая, что нет доказательств для градиента самого BMP4 и что BMP4 обладает только коротким действием, то очевидные градированные эффекты передачи сигналов BMP4 у эмбрионов м.б. обусловлены оппозитно направленным градиентом этих BMP ингибиторов in vivo.
Оказалось, что ранг действия мофрогенов сверхсемейства TGF-β e
Xenopus затрагивается вариациями как природы морфогена, так и тканью, в которой он действует. Напр., TGF-β1 сам по себе обладает довольно коротким рангом, когда вносится в ткань посредством экспрессии с инъецированной РНК, но способен диффундировать на расстояние многих клеточных диаметров, если вносится как активный белок, пропитавший кусочек (beads). Возможно, что процессинг TGF-β1 из своего неактивного предшественника м.б. ограниченным. Процессинг членов сверхсемейства TGF-β сложен, но очень важен. Они синтезируются как зимоген-подобные пре-протеины, чей С-конец на 1/3 является действительным лигандом, тогда как 2/3 N-конца являются "latency peptide" или "pro-domain." Про-домен отщепляется от, но м. оставаться связанным нековалентно с пептидом лиганда. В некоторых случаях, второе протеолитическое отщепление высвобождает про-домен. Структура и процессинг про-домена данного члена сверхсемейства TGF-β м. регулировать его активность. Напр., BMP-4 нуждается в двух последовательных протеолитических расщеплениях, а модификации места расщепления существенно меняют ранг их действия и стабильность. Сходная роль выявлена для про-домена nodal у млекопитающих. У
Xenopus, было показано, что немодифицированный Xnr2 действует только на короткие расстояния, однако химерный белок, состоящий из N-терминального про-домена активина, слитого с лигандной областью Xnr2 обладает свойством передачи на дальные расстояния. Т.о., тип предшественника, из которого продуцируются лиганды TGF-β и в особенности N-терминальны про-домен, м. предопределять ранг действия. Это м. служить предупреждением некритического действия эндогенных nodals. Выявлен еще один слой регуляторной сложности: показано, что многие члены сверхсемейства TGF-β м. формировать гетеродимеры, и между BMPs, nodals, и derriere, и что гетеродимеры обладают др. индуцирующими свойствами.
Важность состояния ткани, через коорую морфогены распространяются выявляется в экспериментах с дисагрегацией и реагрегацией клеток анимальной шапочки, эффект которых вызывает дальнодействие у коротко-действующего Xnr2. Конечно, такое искуственное нарушение струтуры ткани лишь намек на важность взаимодействия с внеклеточным матриксом. Четкие доказательства этого получены на
Drosophila. Мутации
Drosophila tout-velu и
dally предупреждают нормальную диффузию морфогена Wingless и вызывают дефект синтеза ассоциированного с внеклеточным матриксом heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). Роль таких матричных факторов в диффузии морфогенов все еще изучена плохо, хотя они определенно действуют как корецепторы в клетках мишенях. Вообще важно, что HSPGs уствует в формировании мезодермы и что ограничение ранга действия BMP4 зависит существенно от HSPG-связывания трех аминокислотных мотивов на его N-терминальной области.
ESTABLISHMENT OF MORPHOGEN
GRADIENTS. PART II: PHYSICAL MECHANISMS OF MORPHOGEN DISTRIBUTION
Большой интерес привлекли недавно действительные физические механизмы, с помощью которых морфогены распределяются градиентно. Пассивная диффузия существует, она лишь один из возможных механизмов. Относительная простота пассивной диффузии делает ее базой огромного количества теоретических математических моделей действия морфогенов. Francis Crick, напр., считал разумным что, определив эффективность диффузионных констант и учитя время патерн-формирующих событий (5-10 ч) и расстояние, которое необходимо преодолеть при формировании паттерна (менее 1 mm), простая модель м.б. сконструирована, базируясь на пассивной диффузии малых (300-500 Da) молекул морфогена.
Более детальная модель с использованием пассивной диффузии была предложена для специфического случая формирования паттерна мезодермы у эмбрионов
Xenopus. В этих моделях, устойчивый (steady-state) градиент генерируется, исходя из предположения наличия источника морфогена и дистального его снижения или распределения распада морфогена. Теперь известно, что морфогены м.б. болше, чем постулированые Crick's"small molecule," но сохраняется идея механизмов пассивной диффузии. Такие модели достаточно эластичны, чтобы воспринять новые открытия.
Недавно предложены более изощренные модели. Kerzberg and Wolpert (1998) показали, что включение кинетики рецепторов в диффузионую модель приводит к существенному отличию моделируемой прогрессии морфогенов через ткани. Они нашли, что рецепторы имеют тенденцию отлавливать молекулы морфогена, так что вместо формирования градиента морфоген распространяется через поле клеток т.к. путешествует фронт насыщения рецепторов. Такой перемещающийся фронт м. в принципе вызывать градированную реакцию, если клетки могут интегрировать (запоминать) их экспозицию в течение определенного времени, т.к. проксимальные клетки насыщаются пропорционально дольше, чем боле дистальные (Рис. 2). Такая интеграция (dose = concentration Ч time) устанавливается собственно, напр., для реакции на активин в клетках
Xenopus и является скорее всего результатом медленной диссоциации активина от его рецептров и устойчивой активности рецепторных киназ. Перемещение фронта наблюдается в форме прогрессирования активации (фосфорилирования) Smad2 от Организатора на др. сторону бластулы/ ранней гаструлы
Xenopus и былок данио. Фронт перемещения активации Smad2 сопровождается перемещением фронта инактивации. Т.о., любая градиент-подобная интерпретация клетками должна происходить в течение сильно ограниченного временного промежутка.
Чтобы объяснить действительное образование градиента - наблюдаемого, напр., для градиента Dpp у
Drosophila, Kerzberg и Wolpert предположили "bucket brigade" модель, согласно которой молекулы морфогена связывются с рецепторами на одной клетке м.б. переданы (handed off) рецепторам соседней клетки. Этот процесс восстанавливает формирование мощного градиента без необходимости привлечения пассивной диффузии, но обнаруживаются недостатки, которые противоречат такому механизму. Недавно, Lander et al. (2002) предложили простую альтернативную модель с участием пассивно диффузии и рецепторной кинетики, которая не связана с отлавливанием морфогена. Эта модель вместо этого включает хорошо известный процесс интернализации лиганд-рецепторных комплексов (endocytosis) и деградацию лиганда. Даже если интернализация обратима, модель хорошо предсказывает образование градиента с правдоподобной кинетикой и физическими рангами (range).
Эта модель выдвигает предположение, что если эндоцитоз является важным для формирования градиента, то он д.б. частью transcytosis, т.e., эндоцитотического поступления, переноса через цитоплазму и экзоцитотической секреции лигандов. Модель трансцитоза базируется на нескольких наблюдениях формирования градиентов Dpp и
Wingless у
Drosophila. Прямая визуализация градиентов морфогена (с использованием или антител или биологически активных с GFP-конъюгированных мофрогенов) выявила, что существенная доля молекул локализована во внутиклеточных пузырьках.
В случае Dpp, их распределение и последующее образование градиента зависит от dynamin, GTPase, которая обеспечивает clathrin-покрытый эндоцитоз, который нарушен у мутантных эмбрионов
shibire. Такое эндоцито-зависимое перемещение морфогена обнаруживается как для Dpp так и для Wingless. Это наблюдение ведет к модели, согласно которой молекулы морфогена транспортируются через клетку с помощью эндоцитоза с одной стороны, везикулярного транспорта через цитоплазму и экзоцитоза с др. стороны клетки. Трансцитоз делает возможной изощренную регуяцию движения морфогена. Должен быть также механизм для предупреждения удаления морфогена из ткани. Такое избегание м.б. проблематичным в таких случаях как имагинальные диски
Drosophila, где эпителиальный слой, будучи patterned, сильно складывается, так что становится возможным несоответствующий переход морфогена из одной слкадки в др. Однако, математическое моделирование показывает, что эндоцитоз является столь же важным для формирования базирующегося на диффузии градиента, как и трансцитоз. Предполагается, что кинетика образования градиента морфогена in vivo слишком быстра по сравнению с подсчитанной скоростью трансцитоза. Сходным образом, bucket brigade relay à la Kerzberg-Wolpert, должна быть столь же медленной - по крайней мере в случае TGF-β-типа морфогенов с их медленной диссоциацией из рецепторов. Следует добавить, что динаминовые (
shibire) мутации в эндоцитозе также м. влиять на уровни экспрессии рецепторов и др. молекул клеточной поверхности и тем самым ингибировать движение Dpp с помощью механизмов, иных чем трансцитоз или лигандом обусловленный эндоцитоз рецепторов.
бразование градиента
Drosophila Wingless, в отличие от Dpp, не зависит от функции dynamin, а градиент белка Wingless в основном обнаруживается внеклеточно. Это необходимо принять как аргумент, трансцитоз или эндоцитоз необязательны для образования такого градиента. Однако, имеются неоторые указания на то, что существует и
Wingless transcytosis. Wingless обнаружен в популяции активно транспортируемых пузырьков. дублирующих "argosomes". Эти аргосомы очень быстро пересекают клетку, что согласуется с действием активных молекулярных моторов, и они м. содержать Wingless белок, но они регулируются и селективно выбирают переносимый ими груз.
Cytonemes являются др. типом клеточных органелл, которые м. вносить вклад в распределение морфогенов. Cytonemes являются большими, длиной в клеточный диаметр, содержащими актин филаментозными клеточными выпячиваниями или филоподиями, которые в принципе м. воспринимать морфогены от несоседних клеток. Cytonemes недостаточно охарактеризованы и трудно сказать, играют ли они на самом деле роль в формировании градиентов морфогена. Однако, они служат предупреждением тем моделям, в которых клетки считаются плотно упакованными.
Кажется возможным, что разные мофрогены или даже один и тот же морфоген м. формировать градиент, используя разные механизмы у разных видов и тканей. Однако, то что сами морфогены эволюционно законсервированы открывает возможность, что существует лишь немного успешных механизмов. Трансмиссия и распределение мофрогенов это одна область, где теория ведет успешный диалог с экспериментом. Так, распределение TGF-β1 через ткань анимальной шапочки, экспрессирующей рецепторы высокого сродства, не зависит от чувствительного к температуре процесса интернализациии. Даже учитывая, что это является искусственной ситуацией, использующей возможно травматизированную эксплантированную ткань, она все еще делает возможным, что несмотря на теорию и экспреименты на
Drosophila, этот тип градиента целиком базируется на диффузии. Необходимо добавить, что большинство исследований функции морфогенов проведены на эпителии (напр., имагинальные диски
Drosophila) или плотно упакованной ткани бластулы
Xenopus. Однако, большинство передач сигналов происходит в мезенхиме или между мезенхимой и эпителием(напр., конечности, зубы). Остается открытым вопрос, как могут формироваться градиенты в рыхлой структуре мезенхимы, или как градиенты формируют паттерн, когда клетки плотно упакованы.
MORPHOGENS NOW: GENERAL PRINCIPLES AND EMERGING THEMES
Когда стало возможным секвенирование полного генома, стало возможным думать о конечном количестве типов генов и о классификации морфогенов. TGF-betas, Wingless/Wnts, и Hedgehogs наиболее часто используются у ранних эмбрионов, м. надеяться, что эти три смогут объяснить значительное большинство процессов раннего формирования паттерна. Следует также подчеркнуть, что имеется множество градиентов, но каждый имеет относительно немного порогов. Напр., активин м. индуцировать множество реакций в клетках, но из этих реакций, вообще-то, только две прямые ( Xbra
и Goosecoid), а остальные возникают в результате вторичных взаимодействий между индуцированными клетками. Исходя из математических моделей gradient patterning, резонно отметить: легче достичь точности на данной территории, используя множество последовательных раундов формирования паттернов, чем используя одиночный градиент с многочисленными порогами.
В последнее время возникала новая тема, что детальное понимание биохимии сигнальной трансдукции станет центральным в расшифровке intricacies пространственной регуляции и действия градиента морфогена. В этой связи,
Xenopus является мостиком между биохимическими и patterning исследованиями ведущей системы для выяснения путей трансдукции TGF-β и Wnt среди прочих.
Три области скорее всего будут иметь критическое значение для понимания действия морфогенов в ближайшем будущем. Во-первых, ясно из анализа трансмиссии морфогенов, большая часть результатов будет получена с помощью субклеточной анатомии и классической клеточной биологии. Так, чтобы получить детальное знание киназ и фосфатаз, связанных с "signal transductionologists," необходимо изучить молекулы. которые регулируют эндоцитоз, аргосомы, cytonemes и перенос пузырьков (и др внутриклеточный trafficking). Во-вторых, необходимо и дальше анализировать роль регуляции с помощью обратных петель связи. Исследования очерчивания порогов, упомянутые выше, определенно лишь царапина на поверхности проблемы, как достигается масштабирование (scaling) и регенерация. В третьих, процессы, которые предшествуют и сопровождают установление градиентов морфогенов, а именно установление границ и клеточной полярности, станут интегрированными в онтогенетическое повествование. Установление границ имеет очевидное интуитивное механистическое значение, но наше знание физических механизмов, которые управляют ими, все еще в детстве. Так, полярность, способ, с помощью которого градиенты морфогенов обеспечивают и скалярную и векториальную информацию клеткам, предопределена для настоящих морфогенов. Достигнуты определенные успехи в объяснении детальных молекулярных механизмов плоскостной полярности. Выявляется картина, согласно которой градированные внеклеточные сигналы обеспечивают склон для движения специфических молекул из одного конца клетки к др. и что эти внутриклеточные распределения пересмативаются с помощью очень локальных позитивных инегативных петель обратной связи. Эти исследования проведены исключительно на
Drosophila, но они технически возможны и на
Xenopus laevis
MORPHOGEN GRADIENTS: HISTORICAL
NOTE
Before he did the Organizer experiment, Spemann showed that bisected
amphibian embryos give small but anatomically normal embryos (see Hamburger, 1988),
whereas Waddington showed that adding extra tissue to a frog embryo modifies the
size but not the anatomy of the resulting tadpole (Waddington,1938).
These are but two amphibian examples among many other experiments from the late
1800s through to the 1930s on diverse species, demonstrating long-range
coordinated regulation of patterning in embryos. To explain such phenomena, the
concept of the "morphogenetic field" was developed and elaborated on in the
1920s and 1930s (reviewed in Gilbert,2000) to describe the tissue or region in which such long-range pattern regeneration or stability could be observed. This idea became the "gradient field," essentially identical to the current concept of
morphogen gradients. Many articles and books were written on the subject (see
Gilbert, 2000). A particularly intriguing example was Dalcq and Pasteels, who
proposed a two-coordinate gradient system for early amphibian patterning (Dalcq
and Pasteels,1937; Dalcq,1938)that fits well with some of our current ideas (Рис. 3).
Although it was at one time popular, the idea of gradient fields fell out of
favor in the late 1930s and early 1940s. This trend was partly due the decline
of German embryology under the Nazis, but there were two scientific reasons. One
was the rise of genetics: ironically, T.H. Morgan, who had been among the first
to think about gradients, became actively hostile to this idea from "old style" experimental embryology, which challenged the new focus on genes. A second reason was the spectacular failure of biochemists to identify morphogens, in particular the Organizer substance (Witkowski,1985,1987).
Interest in morphogens was revived when mathematicians and physicists brought
a theoretical inclination to problems in biology after WWII. One of the first of
these investigators was Alan Turing, who (after developing the mathematics that
underlies all digital computing) devised a "reaction-diffusion" model for regulating morphogens and by the way coined the term "morphogen" (Turing,1952).
However, Turing's was a lonely voice: as late as 1970, Crick (another physicist
who went into biology) could write that "gradients have become a dirty word" (Crick,1970]). In the 1970s, led by Wolpert (1969]), Crick, Meinhardt, and Gierer, there was a surge in gradient theories informed by a new confidence in the power of molecular biology, although with little molecular support.
The 1980s brought the power of
Drosophila genetics to the problem of
developmental patterning with the fruition of the work of Lewis,
Nusslein-Volhard, and Wieschaus, among others. Meanwhile, the growth of
molecular biology and the characterization of protein growth factors in cell
culture led to the discovery of real morphogens in vertebrate embryos (see main
text). This might be described as the end of "Morgan's Detour," from amphibian gradients by means of
Drosophila genetics and back again.
Сайт создан в системе
uCoz
