Развитие метанефрических почек начинается с пустотелой эпителиальной трубки (Вольфова протока), взаимодействующей с группой неэпителиальных клеток, метанефрической мезенхимой (ММ). Первая фаза в развитии разветвленной собирающей системы связана с выростом инициальной эпителиальной структуры, называемой уретрическим зачатком (uretric bud, UB), индукция которого зависит от решения группы клеток Вольфова протока вблизи ММ врастать (to sprout). Эти клетки и формируют всю почечную собирающую систему от треугольника мочевого пузыря до собирающих канальцев. UB врастает в ММ, период, характеризующийся многочисленными итерациями морфогенеза ветвления. Сложные молекулярные взаимодействия происходят между UBи ММ во время, когда ММ коммитируется встать на путь эпителиальной дифференцировки ( ведущего к формированию эпителиальных клубочков дистальными канальцами нефрона) а UB индуцируется к ветвлению на эпителиальные канальцы, которые сформируют собирающую систему. На каждой округлой дихотомной веточке количество UB кончиков дублируется; каждый из этих кончиков оказывается доступен для индукции дополнительных нефронов через эпителизацию окружающей ММ.

Помимо решения ветвиться, должно постоянно специфицироваться направлние роста развивающихся структур. Согласно гипотезе векторного ветвления UB веточки чувствительны к морфогенетическим градиентам растворимых факторов. Они растут в направлении ( или прочь от) источника ростовых факторов. Эти градиенты могут возникать в результате продукции ростового фактора мезенхимными и стромальными клетками, а также в результате селективного связывания и процессинга внеклеточным матриксом (ВКМ) факторов, которые усиливают или ингибируют фрмирование канальцев и/или ветвления. Клетки ветвящегося UB могут также продуцировать аутокринные факторы, которые в ответ на мезенхимные факторы, регулируют свое собственное ветвление. ММ может также создавать стоп сигнал для ветвления.

Во время ветвления происходит экстенсивное ремоделирование базальных мембран и селективная модуляция клеточной адгезии с ВКМ. Регуляция, по-видимому, связана с изменяющимися наборами дистальных эффекторных молекул (матричные белки, матрикс-деградирующие протеиназы), секретируемые различными клетками, а также с адгезивными молекулами. Фигура ветвящегося UB постоянно меняет основу ( окружающие клетки и матрикс).

Индукция выроста уретрического зачатка (UB)

Первая ступень - формирование UB из каудальной части Вольфова протока. У мутантных гомозигот LIM1 Вольфов проток не образуется, а у РАХ-2 мутантов образуется неполностью, что ведет к агенезу почек. При нормальном Вольфовом протоке индукция UB происходит в результате взаимодействия с окружающей мезенхимой. Этот процесс зависит от Wilms' tumor (WT-1) супрессорного гена и пептидного ростового фактора GDNF в мезенхиме. У мышей с нулевой мутацией по этим генам UB не образуется несмотря на нормально развитый Вольфов проток.

WT-1, транскрипционный фактор с цинковыми пальчиками, обычно экспрессируется в неиндуцированной мезенхиме, а в случае нулевой мутации эта популяция клеток подвергается апоптозу на ст. Е11. GDNF экспрессируется и секретируется метанефрической мезенхимой на ст Е11 и действует на c-ret, рецепторную тирозин киназу, которая экспрессируется Вольфовым протоком, а позднее и развивающимся ги, особенно на кончиках веточек. Для активации GDNF, c-ret нуждается в glycosyl phosphatidylinositol (GPI)- сцепленном ко-рецепторе, рецепторе GDNF family receptor α1 (GPI), который обнаруживается в клетках UB<. Если какая-либо из этих молекул (WT1, GDNF, c-ret или GPI) функционально делетирована, наступает агенез почек в результате нарушения развития ги. В 3-х последних случаях иногда образуются гипопластические почки. Следовательно, существует, но он недостаточен, компенсаторный путь индукции UBи морфогенеза ветвления. Экзогенный GDNF индуцирует множественные дистопические UB из Вольфова протока, провоцируя избыточные веточки в ги, действует как хемоаттрактант на веточки и, по-видимому, усиливает пролиферацию и экспрессию Wnt-11 на кончиках ги. Wnt-11 экспресируется исключительно на ведущем крае UB и его производныхветочек на всех стадиях образования собирающей системы. 2 других члена семейства GDNF, persepin и neurturin, также оказывают сходное влияние на GDNF in vitro. Neurturin экспрессирется ги.

Ряд других делеционных фенотипов и естественно возникших мутаций , связанных с отсутствием UBвыростов, включают limb-deformity (ld), homeobox-A11/D11 нокаут и Danforth Short-tail мутация. "rcghtccbz ld в ги, по-видимому, зависит от c-ret сигнализации.

Векторизованное ветвление развивающегося уретрического дерева

Потеря одного из инициальных событий ветвления уменьшает число нефронов вдвое, некоторое снижение (менее 1%) эффективности ветвления также уменьшает число нефронов наполовину или более. Предполагается, что веторизованное ветвление регулируется (а) дально-действующими морфогенетическими (или хемоаттрактивными/ репульсивными) градиентами (такими как ретиноиды); (б) коротко-действующими растворимыми факторами паракринно-аутокринным способом (такими как TGF-β); (в) прямыми межклеточными контактами с ММ ( такие как сигнальные пути в нервной системе Eph-Ephrin или Notch-Delta); (г) внутренне присущими свойствами самой ткани UB при действии рост-стимулирующих растворимых факторов из ММ.

Медиаторы морфогенеза ветвления в изолированных ub

Морфогенез ветвления UB и даже его выживание абсолютно зависят от контакта с мезенхимой. Однако экзогенно добавляемые растворимые ростовые факторы или растворимые факторы, продуцируемые изолированной ММ, могут индуцировать взрослые и эмбриональные эпителиальные клетки, происходящие из UBветвиться. Стало возможно культивировать изолированные UB в присутствии ЕСМ, GDNF и кондиционой среды после Е11.5 ММ клеток.

Роль мезенхимных контактов

Свеже полученная ММ демонстриует помимо ветвления еще и влияние на элонгацию веточек, т.е. векторное ведение. Предполагается, что ММ создает ключевой стоп-сигнал для ветвления. Кондиционная среда от ММ существенно активирует экспрессию эфринов А5 и В2 в UBклетках. при культивировании в трехмерном геле свыше 7 дней. Эфринымембран-связанные молекулы могут могут передавать сигналы Eph-рецепторным тирозин киназам только при связанном с мембранами состоянии. Передача стгналов Ephrin:Eph является критической в двух онтогенетических процессах: регуляция наведения аксонов ЦНС и формировании паттерна эмбриональной сосудистой системы. Это взаимодействие выявлено и при эпителиальном морфогенезе.

Ростовые факторы, модулирующие морфогенез ветвления эпителиальных клеток в трех-мерных культурах

В культуре морфогенез ветвления в UBзависит от HGF, при его участии формируются трубочки с просветами. UBклетки, отвечающие на HGF формированием клетоных отростков и мнгоклеточных структур, реагируют и на EGFR лиганды и др. растворимые фаеторы. С-met, рецепторная тирозин киназа, трансмембранный рецептор для HGF, экспрессируется в ветвящихся эпителиях различных развивающихся органов, включая и почки., тогда как HGF экспрессируется в соотв. мезенхиме. Ни с-met, ни HGF нулевые мутанты мыши не обнаруживают нарушения развития почек до Е14-16, когда они гибнут из-за нарушений в печени или плаценте.

Подтверждена вырожденность эффктов для определенных факторов роста. Так с-met нокаутные мыши формируют клеточные отростки и тяжи в ответ на действие TGFα, лиганд EGFR. Нокаутные EGFR мыши на определенном генетическом фоне дают аномалии собирающей системы и почечную недостаточность.

Фактически EGFR лиганды, HGF, IGF-I, FGF-2 или GDNF или их комбинация не индуцируют ветвящиеся трубочки с просветами. Все они менее специфичны для морфогенеза ветвления и скорее важны для пдвижности клеток, выживания, пролиферации или последних ступеней ветвления.На морфогенез ветвления молочных желез существенное влияние оказывает epimorphin.

Фактор TGF-β1, 2 и 3 обнаруживают ингибирующее влияние на ветвление. ВМР2 и 7, также члены сверхсемейства TGF-β тоже ингибируют ветвление (ВМР7) только при высокой концентрации.

Предполагается, что биполярные градиенты способствующих и ингибирующих ветвление факторов могут вести к векторному ветвлению развивающейся собирающей системы.

ЭФФЕКТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ: ПРОТЕИНАЗЫ, ЕСМ и МОЛЕКУЛЫ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ
Ферменты, деградирующие ВКМ

Некоторые протеиназы и ингибиторы протеиназ обнаружены в связи с морфогенезом ветвления. EGFR лиганды и TGF-β регулируют экспрессию коллагеназы I, TIMP-I, урокиназы и урокиназых рецепторов, влияя на локальное соотношение протеиназ и их ингибиторов. В органной культуре ветвление ингибируется в присутствии TIMP-1 или TIMP-2. Все это указывет на участие металлопротеиназ (ММР) и их ингибиторов в ремоделировании внеклеточного матрикса во время ветвления. Функция разных MМР, по-видимому, существенно перекрывается и они могут реагировать на одни и те же ингибиторы. Они продуцируются в основном в мезенхиме и могут накапливаться во ВКМ, но могут продуцироваться и в UB в присутствии тубулогенных растворимых факторов.

Имеются указания на то, что связанная с мембранами МТ1-ММР вместе с ингибиторами TIMP-2 и 3 играет важную роль в регуляции локального ремоделирования ВКМ во время морфогенеза ветвления UB. Наивысшая концентрация ММР на кончиках веточек.

Состав ВКМ

Различные матриксы, такие как коллаген типа Ш или препарат из базальных мембран Матригель, ведут к морфологически отличному росту в трехмерных гелевых структурах. Гиалуронан, по-видимому, увеличивает выживаемость клеток и поддерживает образование веточек через его рецептор СВ44, который активируется в ГИ в условиях роста и локализуется на кончиках клеточных отростков.

Интегрины

Интегрины, по-видимому, играют ключевую роль в морфогенезе ветвления благодаря их взаимодействую с различными компонентами ВКМ. α6β1 интегрин связвается с ламинином; α3β1 интегрин связывается с коллагеном, ламинином и фибронектином;% α8β1 интегрин, по-видимому, связывает фибронектин, витронектин и тенасцин. Во время развития собирающей системы α1- и &alpha5-цепи ламинина обнаруживаются в базальной мембтране ветвящегося UB мыши на 13-й день беременности. Ламинин α2 экспрессируется исключительно мезенхимными клетками, слабое окрашивание все-таки обнаруживается в базальных мембранах структур, производных UB.

Нарушение экспрессии интегрина -α2β1 ингибирует in vitro тубулогенез. Интегриновые субъединицы α3, α6 и β1 экспрессируются на поверхности клеток ветвящегося UB, их блокада ведет к образованию маленьких почек с малым количеством собирающих канальцев. Интегриновая α субъединица обнаруживатся в большинстве клеточных типов, включая UB и собирающие канальцы, ее блокада ведет к дезорганизации UB веточек. У нулевых мутантов по интегриновой α8 субъединице почки не развиваются вообще или очень аномальны, хотя экспрессия интегрина α8β1 ограничена мезенхимой, окружающей UB и ее развивающиеся веточки. Следовательно, этот интегрин участвует в эпителиально-мезенхимном взаимодействии. Однако существуют компенсаторные механизмы.

Протеогликаны

После врастания в ММ UB становится Т-образным, дихотомически ветвящимся. У нулевых мутантов по гепаран сульфат 2-сульфотранферазе развитие UB останавливается в точке события первого ветвления. HGF, как известно, нуждается в связывании с гепарн сульфатом, а TGF-β с бетагликаном для осуществления их функции. Очевидно протеогликаны обеспечивают локальную концентрацию этих и других ростовых факторов, необходимых для ветвления и роста. Возникающих после инвазии в МM мезенхимных кондесатов не образуется у мышей, дефицитных по гепаран сульфату, не обнаруживается экспресия Wnt-11, а экспрессия c-ret и GDNF быстро снижается. Следовательно, подавление продукции гепарана и ходроитин/дерматана селективно ингибирует морфогенез ветвления UB без нарушения мезенхимной дифференцировки. Помимо HGF протеогликаны связывают TGF-β, FGFs, концентрируя их в местах высвобождения или взаимодйствия с рецепторами.

Другие молекулы клеточной адгезии

Клеточная адгезивная молекула L1, член сверхсемейства иммуноглобулинов, обнаруживается исключительно в структурах, производных UB во врмя их ветвления. L1 образуют гомодимеры, но димеризуются также с интегринами, протеогликанами, GPI-сцепленными адгезивными молекулами и FGF рецепторами во время роста нейритов, передающих сигналы в клетки, где L1 связывается с фтлнкшт и актиновым цитоскелетом. Если в UB L1 связывается с теми же партнерами, то L1 может играть роль в модификации и регулировании передачи сигналов извене внутрь от факторов роста или ВКМ.

Взаимодействие факторов роста и дистальных эффектроных молекул

Сложное взаимодействие факторов роста, матричных белков, молекул клеточной адгезии, ММР и TIMЗ ответственно за эффективные характерные морфологические взаимодействия в разивающией собирающей системе. Дополнительная сложность иллюстрируется на примере HGF, которым м.б. активирован урокиназой, возможно продуцируемой на кончиках веточек. Это может приводить к высоким локальным концентрациям HGF, который может тесно связываться гепаран сулфат-содержащими протеогликанами. Высокие концентрации HGF (действующие через рецептор с-met) в свою очереь могут приводить к изменению экспрессии MMPs, TIMPs. интегринов, матричных белков и тем самым участвовать и генерации большего количества урокиназы. Когда протеиназы и новые матричные белки секретируются, они будут менять физические и биохимические свойства матрикса, меняя его сродство к факторам роста. Различия в количестве и локализации ростовых факторов снова будет влиять на субнабор MMPs, TIMPs, интегринов и матричных белков, экспрессирующихся локально. Этот процесс может проходить в несколько циклов давая в конечном итоге очень отличную локальную экспрессию этих белков, превращая исходные филоподиальные структуры в разветвленное древо.

ЭФФЕКТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ: ВЫЖИВАНИЕ КЛЕТОК - АПОПТОЗ

Когда UB ветвится в трехмерной культуре, то как про- так и антипролиферативные гены экспрессируются. Постулируется действие ангиотензина на рецепторв AT2R. В норме большинство тканей, экспресирующих AT2R, подвергается апоптозу. Однако гомозиготная мутантная мезенхима неспособна коммитировать апоптоз, очевидно присутсвует физический барьер UB ветвелению и последующей индукции нефронов. Следовательно, фенотип м.б. результатом различий в врастании UB в мезенхиму. Образование почечных лоханок и сфднсуы из первичных веточек скорее всего связано не только с дифференциальным ростом, но и с апоптозом.

СИГНАЛЬНАЯ ТРАНСДУКЦИЯ и РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Регуляция экспрессии генов

Нокаут генов PAX-2, WT-1, LIM1, GDNF и др вызывает нарушение раннего развития почек до ГИ ветвления. Интересное исключение фактор транскрипции ЕМХ2, который, по-видимому, важен для событий, связанных с первым событием ветвления. У нулевых ЕМХ2 мышей UB индуцируется и проникает в ММ, но никогда не дает Т-образной формы и экспрессия РАХ-2, LIM1, GDNF и c-ret последовательно снижается от первоначально нормального уровня. ЕМХ2 экспрессируется исключитеьно Вольфовыми протоками и развивающимся UB, это указывает на его участие в генной регуляции UB ветвления.

Гомеобоксные гены могут играть ключевую роль в процессе влетвления, так как помимо регуляции событий ветвления, действует и механизм структурной ( и функциональной) сегментации вдоль древа. Во время ветвления UB увеличивается количество активриемых Нох генов.

У дрозофилы процесс ветвления трахей контролируется генами trachealess и tango, кодирующих bHLH-period, aryl hydrocarbon htwtgnjh, single-minded (PAS) домен содержащие транскрипционые факторы. Ешьудуыы (также кодирующий bHLH-PAS белок) дифференциально экспрессируется в ветвящихся клетках UB. Селетивное подавление Ешьудуыы экспрессии мРНК заметно ингибирует морфогенез ветвления UB Таким образом, Timeless, ген циркадного ритма, выполняет дополниттельные функции в клеточной реакции на стимуляцию ростовых факторов или регуляцию ( и возможно ешьштп) ветвления.

ETS-1 первоначально обнаружен во всех развивающихся органах мыши, но преимущественно ассоциирует с органами с морфогенезом ветвления на поздних стадиях плодного развития. Эпителиально специфичные ETS (ESE)-1 и ETS-родственные транскрипционные факторы экспрессируются исключительно в эпителиальных клетках, включая лекги и почки плодов.

Сигнальная трансдукция

HGF через свой рецептор c-met вызывает 3 различных эффекта - рассредоточение, рост и тубулогенез - каждый, по-видимому, связан с разными внутриклеточными путями. Рассредоточение почечных клеток нуждается в связывании phosphatidylinositol (PI)-3-киназы для цитоплазматического хвоста c-met и в вовлечении малых GTP-связывающих белков Rac. PI-3 киназа вазна и для тубулогенеза. Стимуляция роста почечных клеток сопровождается активацией Ras-MAP киназного пути, обеспечиваемого Grb2, а тубулогенез нуждается в связывании STAT3 с c-met. Адапторный белок Gab1 также может связываться с c-met, усиливая тубулогеннуй и рассеивающий эффекты. Множественные каскады фосфорилирования модулируют этот путь Чтобы сформировать трубочки из сферических кист клетки образуют клеточные отростки, затем многоклеточные тяжи, которые постепенно образуют просветы. Во время этого процесса клеточные соединения и клеточная полярность сначала теряются, затем восстанавливаются в канальцах. Рассеивание (диссоциация клеток) нуждается в ступени деградации, обеспечиваемой цитозольными протеосомами, которые м.б. мишенями для белков соединений, молекул клеточной адгезии или модуляторов этих молекул.