Хрусталик возникает из примитивной эктодермы головы в ответ на индуктивные влияния со стороны зачатка сетчатки, называемого оптическим или зрительным пузырьком, который является боковым выпячиванием передней части диэнцефалона [1] [2] [3] [4]. Индуцированная эктодерма испытывает серию морфологических изменений: утолщение слоя клеток, ведущее к образованию хрусталиковой плакоды, инвагинация плакоды, формирование хрусталикового пузырька, который отделяется от эктодермального слоя, затем трансформация пузырка в хрусталик [5] [6]. На перыой ступени клетки наружной стороны пузырька формируют хрусталиковый слой эпителиальных клеток, сохраняющий митотический потенциал, а клетки на периферии эпителия, посылаются на внутреннюю сторону, где они становятся постмитотическими и удлинняются вертикально формируя клетки хрусталиковых волокон, которые практически заполняют полость хрусталикового пузырька. Переходная зона между хрусталиковым эпителием и хрусталиковыми волокнами называется 'bow region', там происходят динамические изменения клеточных состояний. Дифференцировка хрусталиковых волокон зависит от гуморальных факторов, преимущественно происходящих из сетчатки и ассоциированых с ней тканей, среди которых семейства белков факторов роста фибробластов(FGF) и инсулин-подобных факторов (IGF)[7] [8] [9].

Параллельно с этими морфологическими изменениями происходят четкие изменения в экспрессии генов. Хрусталиковые клетки обильно синтезируют группу белков, называемую кристаллинами [10].

В зрелом хрусталике кристаллины накапливаются в высоких концентрациях, но в растворимой форме, и сохраняют прозрачность и высокую рефракцию (reflactivity) хрусталика. Основные кристаллины расклассифицированы на α- β- <δ- и γ-кристаллины у позвоночных : <δ-кристаллин присутствует в хрусталиках птиц и рептилий, замещая γ-кристаллины, обнаруженные у других видов позвоночных. Экспрессия большинства кристаллинов ограничена хрусталиками и небольшим числом тканей, поэтому экспрессия генов, кодирующих кристаллины является хорошим показателем дифференцировки хрусталика.

Имеется некоторая вариабельность во временном порядке экспрессии кристаллинов у разных видов позвоночных, но схема экспрессии кристаллинов в развивающемся хрусталике эмбрионов кур, представленная на рис.1. Fig. 1 в целом приложима к различным видам позвоночных. Экспрессия α -кристаллиновых генов (αA и αB) начинается на стадии хрусталикового пузырька, тогда как экспрессия β и γ-кристаллинов обычно происходит одновременно с дифференцировкой хрусталиковых волкон. <δ-кристаллин уникален по своей экспрессии, которая начинается раньше всех на стадии плакоды и указывает на то, что транскрипционная регуляция начинается на ранних стадиях дифференцировки хрусталиковых клеток в ответ на индукцию со стороны оптического пузырька. Экспрессия <δ-кристаллина заметно увеличивается в хрусталиковых волокнах, с помощью механизма, сходного с тем, что используется для активации β- и γ-кристаллиновых генов в хрусталиковых волокнах.

2. Экспрессия кристаллинов и транскрипционных факторов во время ранней фазы развития хрусталика у эмбрионов кур, схематически показана серым.

Помимо инициации экспрессии кристаллинов во время инвагинации и отделения хрусталикового пузырька от эктодермы экспрессируются молекулы клеточной адгезии N-cadherin, которые, по-видимому, вытесняют Е-кадхерин, экспрессрующийся в эктодерме [11]. Удлиннение клеток в компартменте хрусталиковых волокон ассоциирует с экспрессией белков промежуточных филамент filensin/CP49 [12]. Вступление в постмитотическую фазу клеток волокон зависит от экспрессии Cdk ингибиторов p27 и p57, мутантные мыши с отсутствием p27 и/или p57 обнаруживают дефекты созревания хрусталиковых волокон [13] [14•].

Несколько транскрипционных факторов участвует в регулфции этих процессов. Некоторые обнаружены как регуляторы экспрессии кристаллинов, тогда как другие обнаружены в другой связи Fig. 1.

Distinct roles of Pax6

Классические мутации грызунов, называемые Small eye (Sey) (гетерозиготы). Гомозиготы Sey неспособны формировать глаза [15]. Известно, что эти мутанты у грызунов и пациенты с аниридией несут мутации гена Pax6 [16] [17] [18]. Белки, кодируемые Pax генами имеют Paired домен в качестве одного из ДНК-связывающих мотивов, а некоторые, включая Pax6, содержат также paired-типа гомеодомен в качестве второго ДНК-связывающего мотива [19]. Pax6 белок имеет домен трансактивации вблизи С-конца [20] [21].

Изоформы транскриптов гена Pax6 дают различные изоформы белков. Основная форма имеет нормальный paired домен, тогда как вторая форма, называемая 5a, несет инсерцию аминокислотного участка в N-проксимальной половине paired домена вследствие использования минорного экзона 5a [22] [23] и характеризуется нарушением ДНК-связывающей специфичности [24] [25].

Pax6 функция, по-видимому. хорошо законсервирована в царстве животных, так как Pax6 может восстанавливать генетические дефекты of eyeless, Drosophila гомолога Small eye (Pax6)[26] [27].

Pax6 экспрессируется как в оптическом пузырьке/ретине, так и в латеральной головной эктодерме, воспринимающей сигналы от оптического пузырька. Экспрессия Pax6 в последней не зависит от первых, инициируется намного раньше, чем происходит аппоцизия оптического пузырька и не меняется при удалении оптического пузырька [28]. Известно, что экспрессия Pax6 управляется множествеными регуляторными элементами, которые индивидуально управляют экспрессией в разных тканях [29] [30]; Pax6 экспрессия в головной эктодерме и в хрусталике управляется энхансером, расположенным выше промотора P0 [30] [31].

У мутантных гомозиготPax6 опитический пузырек (увеличен по сравнению с нормой) оказывется тесно примыкающим к головной эктодерме, однако индукции хрусталика не происходит, не происходит утолщения эктодермы и образования хрусталиковой плакоды — оптический пузырет затем регрессирует [15] [32]. Этот фенотип, по-видимому, связан с вовлчением в дефект как хрусталика, так и сетчатки, но отсутствие индукции обусловлено эктодермальным дефектом: в рекомбинантных тканевых культурах Pax6 мутантная эктодерма не реагирует на оптический бокал дикого типа, тогда как Pax6 мутантный оптический бокал индуцирует хрусталик в эктодерме дикого типа [33]. Следовательно, Pax6 является пререквизитом для ответа головной эктодермы на индуктивные эффекты оптического бокала. Очевидно, что экспрессия Pax6 наделяет эктодерму компетентностью формировать хрусталик, так что эктодерма оказывается готовой к восприятию сигналов от оптического пузырька.

Однако возникновение компетентности головной эктодермы зависит не только от функции Pax6. Pax6 продолжает экспрессироваться во всем хрусталиковом пузырьке и когда хрусталик созревает экспрессия Pax6 в основном ограничивается хрусталиковым эпителием [28] [32], это указывает на то, что функция Pax6 в хрусталике связана с самого начала с природой эпителиальных клеток. Активность β-кристаллинового промотора в трансфицированных клетках репрессируется экзогенным Рах6 [34••] и эта репрессия устраняется мутацией сайта связывания Pax6. Следовательно, экспрессия β-кристаллина репрессируется в хрусталиковом эпителии и дерепрессируется в хрусталиковых волокнах с помощью одного механизма. <δ-кристаллин экспрессируется в хрусталиковом эпителии, но эксрессия его сильно увеличивается в хрусталиковых волокнах. У трансгенных мышей с нехваткой большей части сайта связывания Pax6 <δ-кристаллинового энхансера ведет к дерепрессии этого энхансера в хрусталиковом эпителии (Muta et al., unpublished data). Ясно, что важная функция Pax6 - это поддержание эпителия хрусталика в незрелом состоянии за счет подавления специфичных для волокон генов.

Имеются также сообщения, что происходит активация с помощью Pax6 регуляторных элементов кристаллиновых генов [35] [36] [37] [38•]. Эта функция Pax6 подтверждается экспрессией гена в хрусталиковом эпителии –bow области (напр., у морской свинки ζ-кристаллина), но не объясняет механизма высокой активации α- и δ-кристаллинов в хрусталиковых волокнах.

Pax-6 белок, по-видимому, функционирует на разных ступенях развития хрусталика и на разных ступенях он может или активровать или репрессировать. FLAG-tagged Pax6 экспрессируется у эмбрионов Xenopus в результате инъекции РНК на ранних стадиях дробления, клеточные аггрегаты, экспрессирующие βB1-кристаллин, появляются в ассоциации с ростральным доменом эктодермы, некоторые приобретают хрусталик-подобную сферическую форму [39].

Sox proteins from induction to maturation

Kamachi and Kondoh [40] идентифицировали группу родственных транскрипционых факторов в ядре хрусталиков названную δEF2, котрые связываются с существенным сайтом энхансера <δ-кристаллина. Те же самые факторы связывают и промотор γ-кристаллина и это связывание обязательно для активности промотора. Последующее молекулярное клонирование идентифицировало эти факторы как as Sox1–3, относящихся к Sry-related high-mobility group domain семейству белков [41]. Sox1, 2 и 3 очень сходны друг с другом и представляют группу Group B Sox белков [42].

Эти Sox белки, фактически, активируют <δ-кристаллиновый энхансер и γ-кристаллиновый промотор, но только в клетках хрусталика. Sox других групп не активируют кристаллиновые элементы [43••] [44•]. Это клеточно-специфическое действие определяется уникальными свойствами Sox белков, нуждающихся в факторах-партнерах для проявления трансактивационного потенциала([44•]); факторы-партнеры в активации кристаллиновых генов по-видимому, имеют ограниченное клеточное распределение.

Экспрессия <δ-кристаллинового гена начинается рано на стадии хрусталиковой плакоды. Белки Group B Sox являются активаторами энхансера <δ-кристаллина, значит экспрессия Sox генов активируется в ответ на индукцию с помощью оптического бокала и как следствие активируется <δ-кристаллиновый ген [43••]. У эмбрионов кур Sox2 экспрессируется слабо в вентральной половине головной эктодермы перед стадией аппозиции оптического пузырька (ст 11; 40 ч после инкубации яйца), сильная активация экспрессии Sox2 появлется в области напротив оптического пузырька и в полоске, распространяющейся в вентральную сторону, которая будет faced будущей оптической ножкой на стадии 12 (44 ч инкубации). Sox2 экспрессия в других регионах латеральной глоловной эктодермы подавляется начиная с этой стадии, а с оптической ножкой связанная полоска постепенно теряется.

Экспрессия Sox3 в головной эктодерме сходна: ее экспрессия активируется точно в области, обращенной к оптическому пузырьку, и Sox3-экспрессирующая эктодерма трансформируется в хрусталиковую плакоду и иницирует экспрессию <δ-кристаллина на стадии 12 (48 инкубации). Sox1 начинает экспрессию на стадии 15, когда формируется хрусталиковый пузырек и Sox1 становится основным Sox геном, экспрессирующимся в хрусталике в поздний период.

Существуют варианты в экспресии генов Group B Sox среди видов животных. У мышей Sox2 экспрессия в головной эктодерме вплоть до стадии инвагинации хрусталика протекает почти по тому же самому сценарию как и кур [43••], тогда как Sox3 не обнаруживает экспресии в ткани хрусталика [45]. Когда формируется хрусталиковый пузырек Sox2 резко подавляется и усиливается экспрессия Sox1 [43••] [46••]. Когда формируется зрелый хрусталик с полостью заполненной хрусталиковыми волокнами, низкий уровень экспрессии Sox2 в хрусталиковом эпителии все еще обнаруживается, но экспрессия Sox1 обнаруживаетя во всем хрусталике и значительно выше в компартменте волокон [43••]. У Xenopus Sox3 активируется во время индукции хрусталика [47••] [48]. Таким образом, высокий уровень Sox2 и/или Sox3 экспрессии индуцируется в Pax6-экспрессирующей головной эктодерме в ответ на аппозицию опитического пузырька и эта область затем следует по пути развития хрусталика. Когда развиваются хрусталиковые волокна основным игроком является Sox1.

Sox2 нокаутные мыши получены, но гомозиготы погибают вскоре после имплантации [49], и неинформативны. BMP4 нокаутные эмбрионы мыши [50••] погибают в то время, когда формируются рудименты глаз, это позволяет мутантные глаза культивировать. Furuta and Hogan [50••] обнаружили, что у этих мутантов нет плакод или структур похожих на хрусталики и что этот дефект хрусталика ассоциирует с отсуствием экспрессии Sox2 в эктодермальном компартменте. При добавлении экзогенного BMP4 Sox2 экспрессия восстанавливается и формирование хрусталика тоже. BMP4 не является простым индуктором экспрессии Sox2, хотя его присутствие необходимое условие для индукцииSox2.

Sox1-нокаутные мыши жизнеспособны и их основной фенотип - дефект хрусталиковых волокон([46••]; Fig. 2). Хрусталиковые волокна начинают удлинняться, но преждевременно наступает арест. Все γ-кристаллиновые гены тяжело повреждены,и белки первоначально присутствуют на низком уровне , по-видимому, благодаря остаточному эффекту Sox2, синтезированного ранее в хрусталиковм эпителии, но вскоре они становится необнаружимы [46••], в соответствии с законсервированными γ-кристаллиновыми промоторами, нуждающимися в Sox1/2 связывании для своей активности [41]. Напротив, экспрессия αи β-кристаллиновой мРНК происходит нормально у Sox1 мутантных хрусталиков, это указывает на то, что эти кристаллины зависят от других регуляторных систем.

1. Сравнение фенотипов хрусталиков Sox1 и Prox1 мутантных мышей.

Pax6 и Group B Sox белки, следовательно, являются транскрипционными факторами, существенными для дифференцировки хрусталика, но их явно недостаточно для достижения окончательного статуса хрусталика: другие сенсорные плакоды и ЦНС также экспрессируют эти транскрипционные факторы. Третьим необходимым белком может быть большой Maf белок.

Large Mafs in different lens compartments

Maf белки являются семейством bZIP (basic leucine zipper) транскрипционных факторов, которые обычно димеризуются с другим Maf или сходным белком и связываются с ДНК сиквенс-специфическим способом [51]. Белки называемые 'large Mafs', включают онкобелок v-Maf, обладающий трансактивационным потенциалом благодаря наличию активационного домена проксимальнее N- конца. c-Maf (cellular гомолог v-Maf) и MafB (регуляторный мутант с нарушением слуха и называемый kreisler [52]) принадлежат к группе больших Maf , экспрессирующихся в хрусталике и других тканях [53]. c-Maf (maf-2 у крыс) экспрессируется сначала в хрусталиковой плакоде, хрусталиковом пузырьке и в хрусталиковых волокнах, тогда как MafB (maf-1 у крыс) экспрессируется в хрусталиковом эпителии [54]. Другой large Maf, neural retina leucine zipper protein (NRL), строго экспрессируется в сетчатке, а также в хрусталике, в основном в bow области [55].

Ogino and Yasuda нашли, что large Maf белок связывается и активирует α-кристаллиновый промотор и открыли новый член large Maf, L-Maf, у эмбрионов кур [56••]. Регуляторные свойства м экспрессия L-Maf в хрусталике может быть сходной с c-Maf, но L-Maf экспрессируется исключительно в раннем хрусталиковм клоне, начиная с хрусталиковой плакоды и кончая хрусталиковыми волокнами. Функция L-Maf может перекрваться с функцией c-Maf в хрусталике. Эта находка подтвержадет предположение, что Maf белки являются основными регуляторами α-кристаллиновых генов, которые не находятся под регуляцией Sox [46••].

Ogino и Yasuda сделали еще одно наблюдение, что избыточная экспрессия L-Maf обусловливает развитие кристаллин-экспрессирующих лентоидов в культуре нейральных ретинальных клеток (экспрессирующих также Pax6 и Sox2) и в эктодермальной области непосредственно вентральнее по отношению к нормальны глазам эмбриона [46••]. Эта эктодермальная область соответствует той, где Sox2 строго экспрессируется будучи противопоставлена будущей оптической ножке [43••], это указывает на то, что комбинаторная экспрессия Sox2/3 и large Maf играет ключевую роль в инициации развития хрусталика после экспрессии Pax6 в головной эктодерме.

Prox1 for transition from epithelium to fibers

Prox1 был первоначально клонирован как мышиный гомолог гена Drosophila Prospero, который участвует в спецификации клеточных типов в нейрогенезе благодаря неравномерному распределению белка между дочерними клетками [57]. У эмбрионов мыши и кур в органогенезе наиболее выдающимся местом экспрессии Prox1 является хрусталик наряду с другими тканевыми рудиментами [57] [58]. ЭкспрессияProx1 начинается на стадии хрусталиковой плакоды, позднее чем активируетсяSox2/3, и сохраняется во всем хрусталике, но экспрессия наивысшая в bow области, это указывает на то, что Prox1 может участвовать в переходе от эпителия хрусталика к клетками хрусталиковых волокон.

Prox1 нокаутные мыши получены Oliver's группой [59••] (Fig. 2). У гомозиготных Prox1мутантов хрусталики не формируют клеток хрусталиковых волокон и остаются маленькими пузырьками. Мутантные хрусталики неспособны экспрессировать p27^KIP1/ p57^KIP2 и как следствие этого продолжают синтезировать ДНК на внутренней стороне, обнаруживая персистирующую экспрессию Е-кадхерина, который обычно исчезает из компартмента хрусталиковых волокон. Дифференцировка волокон инициируется в Prox1 мутантных хрусталиках на это указывает экспрессия большинства кристаллинов и фибер-специфических компонентов промежуточных филамент,filensin и CP49. Мутантные хрусталиковые пузырьки были слабо, но заметно поляризованы, более толстый клеточный слой имеет более высокий уровень βA-кристаллиновой мРНК и более низкий уровень К-кадхерина на внутренней стороне. Очевидно, что дифференцировка хрусталиковых волокон начинается, но останавливается на этой стадии. Это наблюдение выявляет ступень в развитии хрусталика: завершение терминальной дифференцировки волокон, которое целиком зависит от активности Prox1. Возможно, что Prox1 мутантный хрусталик дефектен в отношении рецепции и/или трансдукции некоторых сигналов от сетчатки и поэтому он неспособен проити стадию прогрессии несмторя на инициацию дифференцировки волокон.

Other transcription factors

Другие факторы транскрипции также участвуют в развитии хрусталика. Six3 —, кодируемый гомологом позвоночных Drosophila's Sine oculis — экспрессируется со стадии хрусталиковой плакоды и его экспрессия снижается по мере развития хрусталика [60] [61]. Его экспрессия у трансгенных рыбок медака вызывает эктопическое образование хрусталика в отическом пузырьке (снова ткань обильно экспрессирующая Sox2) не клеточно-автономным способом [62]. Во-вторых, транскрипционные факторы участвуют в передаче ретиноидных сигналов: элементы, реагирующие на ретиноиды присутствуют в γ-кристаллиновых энхансерах [63] а RAR нокаутные мыши имеют дефекты хрусталиков с изкой пенетрантностью [64]. В-третьих, AP2 белки, кодируемые одиночным геном, присутствуют во многих формах благодаря альтернативному использованию экзонов и включают как активаторы, так и репрессоры. AP2 активируются ретиноидами. В хрусталиках AP2 экспрессируется в эпителиальных клетках хрусталика как и Pax6, указывая тем самым, что активаторные формы могут активировать эпителиальные гены, тогда как репрессорные формы могут супрессировать активацию генов, экспрессируемых в хрусталиковых волокнах [65]. Так как AP2 экспрессируется в широком круге тканей, то мутантные AP2 мыши имеют высоко плейотропные фенотипы и отсутствие глаз из-за неправильного положения оптического пузырька [66] [67]

Conclusions

Итак, Pax6 на ранней фазе регулирует реакцию головной эктодермы на индуктивные влияния оптического пузырька, Prox1 ,по-видимому, регулирует восприятие сигналов от сетчатки и способствуетразвитию хрусталиковых волокон. С другой стороны, Sox2/3 и Maf белки в комбинации, по-видимому, являются ключевыми факторами дифференцировки клеток хрусталика per se. Pax6 ингибирует экспрессию генов, характерных для волокон, в эпителиальных клетках, тогда как Sox1 и c-/L-Maf поддерживают дифференцировку волокон.

Неясна природа индуктивных влияний от оптического пузырька. Описан фенотип c-Maf нокаутных мышей [68] [69]. У гомозигот хрусталиковые пузырки формируются, формрование волоконнарушено, судя по волонкна-специфической экспрессии c-Maf. Экспрессия γ-кристаллиновых генов почти отсутствует а уровень αA- и β-кристаллинов может быть снижен. c-Maf активирует γ-кристаллиновые промоторы путем соединения с законсервированным мотивом, ранее иддентифицированным как 'γF-1 binding site' [70] [71].