Lipid rafts

Поворотным пунктом явилась гипотеза липидных плотиков-платформ (lipid raft). Она исходит из исследований полярности эпителиальных клеток и ее централным постулатом является существование липидных платформ, представляющих собой динамичные ансамбли холестерола и сфинголипидов
(Box.1), в
EXOPLASMIC LEAFLET бислоя. Преобладание насыщенных углеводных цепей в клеточных сфинголипидах позволяет холестеролу быть плотно интеркалированным, подобно организации жидкостно-упорядоченного состояния в модельных мембранах. Внутренний листок, по-видимоу, богат фосфолипидами с насущенными жирными кислотами и холестеролом. Пока неясно как внутренний листок купируется с наружным. Возможно, что длинные жирные кислоты сфинголипидов в наружном листке связывают экзоплазматический и цитоплазматический листки с помощью interdigitation. Трансмембранные белки также должны стабилизировать эту связь. Мембраны, окруженные липидными плотиками, более жидки, т.к. большинство фосфолипидов с ненасыщенными, а, следовательно, изогнутыми жирными acyl цепями и cholesterol. Др. словами, диспергированные липидные плотики образуют иную жидкостно-упорядоченную фазу в липидном двуслое из жидкостно-неупорядоченного матрикса ненасыщенных glycerolipids (Box 2). <вшм>Одним из наиболе важных свойств липидных плотиков является то. что они м. включать или исключать белки. Белками, обладающими сродством к плотикам, являются glycosylphosphatidylinositol (GPI)-закрепленные белки, doubly ацетилированные белки, такие как Src-family kinases или α-субъединицы гетеротримерных G белков, cholesterol-связанные и palmitoylated белки такие как Hedgehog, и трансмембранные белки, особенно palmitoylated. GPI-закрепленные белки или белки, несущие гидрофобные модификации, по-видимому, включаются в плотики благодаря предпочтительной упаковке их насыщенных мембранных якорей. Palmitoylation м. усиливать сродство белков к плотикам, но ее недостаточно для ассоцииации с плотиком. Даже небольшие изменения состава липидных плотиков, в результате их ассоциации, м. инициировать сигнальные каскады.

Caveolae

Один субнабор липидных плотиков обнаруживается в инвагинациях клеточной поверхности, называемых кавеолами (Box 3). Эти бутылко-образные инвагинации мембран образуются из липидных плотиков с помощью полимерзации caveolins — шпилька-образных palmitoylated интегральных мембранных белков, которые плотно связывают холестерол. В целом функция кавеол неясна. Они участвуют в эндоцитозе и
TRANSCYTOSIS альбумина и др. белков через эндотелиальный монослой. В развивающихся миоцитах ленточки из многих кавеол превращаются в Т-трубочки, которые необходимы для регулируемой кальцием мышечной контракции. Кавеолы участвуют также в сигнальной трансдукции, но они не являются абсолютно необходимыми для некоторых типов клеток, в которых отсутствует кавеолин, таких как лимфоциты и нейроны.

Raft distribution and trafficking

Распределение липидных платформ по клеточной поверхности зависит от типа клетки. В поляризованных эпителиальных клетках и нейронах липидные плотики накапливаются в
APICAL а аксонаьных плазматических мембранах, соотв.
BASOLATERAL и
SOMATODENDRITIC MEMBRANES также содержат плотики, но в меньших количествах. Кавеолы присутствуют в основном на базолатеральной стороне эпителиальных клеток, которая обращена к кровоснабжению инаиболее активна во время передачи сигналов. В лимфоцитах и фибробластах плотики распределены на клеточной поверхности, лишенной видимой полярности. Обычно сфинголипиды составляют около 45% клеточной поверхности фибробластов и примерно 30% поверхности лимфоцитов.

Липидные платформы наиболее многочисленны в плазматических мембранах, но м. обнаруживаться в
BIOSYNTHETIC и
ENDOCYTIC PATHWAYS . Холестерол синтезируется в endoplasmic reticulum (ER), синтез sphingolipid и модификации head-group заканчиваютсяв основном в Golgi. Предполагается, что cholesterol–sphingolipid платформы впервые собираются в Golgi. Перемещение липидных плотиков происходит, по-видимому. в основном в направлении плазматических мембран. Включение белков в плотики является важным для поляризованного высвобождения их на клеточной поверхности. После такого высвобождения белков липидные плотики постоянно подвергаются эндоцитозу. Из ранних эндосом плотики или прямо повторно отправляются к клеточной поверхности или возвращаются непрямо после рециклинга эндосом, который высвобождает плотики в Golgi.

Raft size

В фибробластах белки плотиков быстро диффундируют в ансамбли примерно 50 nm в диаметре, что соответсвует примерно 3500 молекулам sphingolipid. Количество белков, приходящееся на каждый плот зависит от плотности упаковки, но, по-видимому, не более 10-30 белков. Кластеры до 15 молекул одного и того же белка наблюдались в одном и том же плотике, указывая на то, что некоторые белки м.б. распределены неслучайно. Однако имеются указания на то, что такие кластеры могут составлять лишь незначительную популяцию.

Methods to study rafts

Одним из подходов для анализа плотиков являются манипуляции с их составом (Box 4). Диссоциация белков из плотиков
(Табл.1)| Techniques to identify rafts.
С помощью этого подхода показано, что жирные кислоты, обеспечивающие связь белков с плотиком обычно насыщены. Замена их ненасыщенными жирными кислотами ведет диссоциации белков из плотиков. Добавление экзогенных
GANGLIOSIDES м. вести к их включению в плотики и вызывать диссоциацию из них белков.

Отсутствие стандартизованной методологии ведет к накладкам в современной номенклатуре между плотиками из резистентных к детергенту мембран и кавеол
(Табл.2)| Raft nomenclature

Rafts in signal transduction

Наиболее важной ролью плотиков на клеточной поверхностия является их участие в сигнальной трансдукции (Табл.3). Известно, что в случае передачи сигналов tyrosine kinase, адапторы, scaffolds и энзимы привлекаются к циоплазматической стороне плазматической мембраны в результате активации лиганда. Предполагается. что плотики образуют платформы, концентрирующие индивидуальные рецепторы, активируемые связыванием с лигандом. Если активация рецептора происходит в липидном плотике, то сигнальный комплекс оказывается защищенным от non-raft энзимов, таких как мембранные фосфатазы, которые м. влиять на сигнальный процесс, и в то же время он оказывается окружен локальными киназами и фосфатазами , обеспечивающими далнейшую передачу сигналов.
(Табл.3)| Signal transduction processes involving rafts

Immunoglobulin E signalling.

Путь передачи сигнала immunoglobulin E ( IgE) во время аллергической иммунной реакции (Рис.1a) активируется, когда IgE соединяется через свой Fc сегмент с рецепторами ( FcεRI), располагающимися на плазматической мембране
MAST CELLS и
BASOPHILS . FcεRI является мономером и связывает одну молекулу IgE. Рецептор активируется путем связывания олигомерных антигенов с IgE, соединенным с рецептором. Поперечное связывание Fc εRI олигомерными антигенами активирует процесс трансмембранной передачи сигналов, ведущий к высвобождению химических медиаторов аллергической реакции.

(Рис.1.)| Initial signalling events in rafts for a | IgE receptor (FcεRI)- and b | T-cell antigen receptor (TCR)-mediated signalling.

Рецептор Fc является тетрамером, состоящим из одной α-, одной β- и двух γ-цепей. γ-цепь связывает IgE, a β- и γ-цепи содержат immune receptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs), общий всем мультисубъединичным иммунным распознающим рецепторам. Поперечное связывание двух или более таких рецепторов с помощью антигенов привлекает дважды ацетилированную нерецепторную Src-подобную тирозин киназу Lyn, которая и инициирует сигнальный каскад путем фосфорилирования ITAMs так, что они оказываются способными связывать семейство Syk/ ZAP-70 тирозин киназ посредством своих phosphotyrosine остатков. Syk активируется с помощью фосфорилирования и это в свою очередь ведет к активации фосфолипазы Cγ ( PLCγ). Наконец, передача сигналов вниз увеличивает уровень кальция вблизи мембраны и это запускает процесс высвобожения гистамина из соседних гранул.

Было установлено, что FcεRI растворимы в Triton X-100 в статичном состоянии, но становятся нерастворимы при низких конц. этого детергента после поперечного связывания. Поперечное связывание FcεRI вызывало перераспределение компонентов плотиков, включая ганглиозиды и GPI-закрепленные белки. Это наблюдение указывало также на то, что происходит образование кластеров плотиков при активации рецепторов. Передача сигналов IgE прекращалась, если поверхностный холестерол устранялся
METHYL-β-CYCLODEXTRIN .

Предполагается, что поперечное связывание увеличивает сродство FcεRI к липидным плотикам. В этой модели изменение в partioning рецептора должно вести к усилению фосфорилирования его ITAMsс помощью raft-ассоциированной Lyn киназы, возможно в результате исключения ирнгибирующих фосфатаз. Поперечное связывание FcεRI должно, кроме того, сводить вмпсте небольшие отдельные плотики. Линкерные белки, такие как члены семейства BASH (B cell adaptor containing SH repeats) и LAT (linker for activation of T cells), являются прекрасными кандидатами на эту работу. В результате амплификации даже небольшие изменения в receptor partitioning должны взывать сильные сигналы.

T-cell antigen receptor signalling.

T-cell antigen receptor ( TCR) является еще одним мультисубъединичным immune recognition рецептором, который использует липидные плотики во время передачи сигналов (Рис. 1b ). TCR состоит из α β-гетеродимеров, которые ассоциированы с CD3 (α δ ε) комплексом и ζ-гомодимером. Если α- и β-субъединицы содержат сайт внеклеточного связывания для пептидов, которые представлены белками
MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) class I и II на поверхности
ANTIGEN-PRESENTING CELLS (APCs), то CD3 и ζ-субъединицы содержат цитоплазматические ITAM мотивы. Самым ранним сигнальным событием после вовлечения TCR является фосфорилирование ITAM tyrosine остатков с помощью дважды ацетилированными нерецепторными Src-подобными тирозин киназами, Lyn и Fyn. Когда ZAP-70 соединяется с фосфорилированными ITAMs он активируется и в свою очередь фосфорилирует LAT, трансмембранный белок, который связан с активацией TCR для нескольких сигнальных путей. Некоторые GPI-сцепленные белки и акцессорные молекулы помогают амплифицировать события активации Т-клеток. Фосфатазы также необходимы для переключения этих путей.

Лишь 10–100 сходных пептидов–MHC комплексов среди общего пула в 10⁴–10⁵ MHC молекул экспрессируется в APC, распознается рецепторами Т клеток для генерации иммунного ответа. Это возможно потому, что один и тот же TCR м.б. активирован снова и снова. Этот процесс м. потребовать часы для своего окончния и облегчается сборкой иммунологических синапсов в несколько микрометров в диаметре в контактной зоне с APC. Сложная серия событий, затрагивающая актиновый цитоскелет, ведет к формированию иммунологических синапсов — контактной зоны между APC и T клетками, где происходит активация Т-клеток. Во время образования иммунологических синапсов Т клетки поляризуют свою актиновую и микротрубочковую сеть в направлении сайта контакта и направляют также перенос к мембранам в этом направлении.

Образование клестеров плотиков является важным для образования иммунологических синапсов. Как и IgE рецепторы, мономерные TCR cкомплексы обладают слабым сродством к плотикам в статическом состоянии. После поперечного связывания рецпторов их связь с плотиками увеличивается и они становятся нерастворимыми в детергенте. В условиях, вызывающих активацию TCR signalling многие белки, включая гиперфосфорилированный TCR мультисубъединичный комплекс и цитоплазматические белки, такие как ZAP-70, Vav, PLCγ, Grb2 и phosphatidylinositol 3-OH kinase становятся резистентными к детергенту, что указывает, возможно, на ассоциацию их с плотиками. Активация Lck с помощью TCR должна приводить к образованию кластеров плотиков посредством белков адаптаров , которые постоянно ассоциированы с плотиками, такими как LAT. Этот каскад взаимодействий, включая scaffolding белки и адапторы и создает иммунологические синапсы (immunological synapse) на поверхности Т клеток. Более того, плотики функционируют также как концентраторы MHC class II молекул, нагруженные специфическими пептидами, на APC стороне синапсов.

GDNF signalling.

Семейство лигандов Glial-cell-derived neurotrophic factor ( GDNF) важно для развития и поддержания нервной системы. Кроме того, оно функционирует во время дифференцировки почек и сперматогний. GDNF связывается с мульти-компонентным рецепторным комплексом , состоящим из GPI-сцепленного GDNF receptor-α (GFRα) и transmembrane tyrosine kinase, RET. Рецепторные субъединицы GFRα и RET не связаны др. с др. в отсутствие лиганда. После внеклеточной GDNF стимуляции , RET поступает в плотики, которые ассоциированы с GFRα. Сигнальная трансдукция зависит от ко-локализации RET и GFRα в липидных плотиках, а снижение уровня холестерола с помощью methyl-β-cyclodextrin снижает передачу сигналов GDNF.

GDNF является димером и достаточен для запуска инициальных событий. Будучи димером он обеспечивает поперечное связывание своих рецепторов. Неясно происходит ли передача сигналов внутри единичных плотиков или необходимо образование их кластеров для достижения порога, необходимого для передачи сигналов.

Известно, что GDNF может также передавать сигналы через GFR α RET-независимым способом. Более того, автофосфорилированный RET м. запускать различные сигнальные пути в зависимости от того он внутри или вне плотика.

Ras signalling.

Малая GTPase Ras является центральной во многих процессах передачи сигналов. Она действует как переключатель, который когда активирован рекрутирует serine/threonine kinases из семейства Raf в плазматическую мембрану. Это в свою очередь активирует ERK–MAP kinase путь и другие мишени. Две изоформы Ras, K-Ras и H-Ras, почти идентичны по последовательностям, но имеют разные сигнальные свойства. Обе имеют С-терминальные prenylated CAAX последовательности, но если K-Ras имеет polybasic область, необходимую для локализации на плазматической оболочке, то H-Ras является palmitoylated и, следовательно, скорее всего включена в плотики.

Hedgehog signalling.

Drosophila melanogaster Hedgehog и его гомолог у млекопитающих действуют как short-range морфогены во время формирования паттерна тканей. В отсутствие сигналов Hedgehog чувствительный к стеролу мембранный белок Patched репрессирует конституитивную сигнальную активность второго сигнального белка, Smoothened, в результате образуется некативный Patched–Smoothened комплекс. Hedgehog, соединяясь с Patched высвобождает Smoothened, который активирует сигнальный каскад.

Hedgehog модифицируется пост-трансляционно чтобы воспринять cholesterol moiety в карбоксильный конец и palmitate moiety в amino конец. Cholesterol-модифицированный Hedgehog становится связанным с мембраной и ассоциирует с липидными плотиками у эмбрионов Drosophila. Холестероловая модификация ограничивает размах передачи сигналов Hedgehog, делая его коротко-действующим морфогеном. Если Hedgehog мутирует и теряет гидрофибный якорь, то он секретируется и м. активировать клетки более дальним путем, чем в норме. Очевидно. что ассоциация Hedgehog с плотиками важна для его функции, но недостаточна. Если холестерол замещен GPI-якорем — кторый также локализует белок в плотике — То Hedgehog больше не высвобождается с поверхности, экспрессирующих его клеток. Дpугой, чувствительный к стеролу белок, Dispatched, также нужен для высвобождения Hedgehog. Механизм высвобождения связан или со смещением связи с холестеролом или потерей мембранных пузырьков клетками, продуцирующими Hedgehog.

Models for signal initiation in rafts

Обычно отдельные плотики собираются вместе, чтобы соединить белки плотиков и их взаимодействия в сигнальные комплексы, напр., дважды ацетилированную нерецепторную tyrosine kinases и G белки из разных плотиков.

Рецепторы ведут себя, по крайней мере, тремя разными способами в плотиках

(Рис.2.)| Models of how signalling could be initiated through raft(s).

Во-первых, рецепторы, ассоциированные в статическом состоянии с липидными плотиками, должны активироваться путем соединения с лигандом (Рис. 2A, a). Во-вторых, индивидуальные рецепторы со слабым сродством к плотикам, должны олигомеризоваться при соединении с лигандом и это поведет к увеличениювремени пребывания в плотиках (Рис.2A, b).Наконец, активированные рецепторы могут рекрутировать crosslinking белки, которые будут связывать белки с другими плотиками, что будет приводить к слиянию плотиков (Рис.2B ). Эти модели не являются взаимоисключающими. Благодаря образованию кластеров сеть взаимодействий между адапторами, scaffolds и закрепляющими белками будет давать сигнальный комплекс в пространстве и времени. Этот комплекс будет выделяться в кластере плотиков (платформ) от окружающего жидкостно-дизорганизованного липидного матрикса. Образование клестеров будет вести к амплификации за счет концентрации сигнальных молекул и исключения нежелательных модуляторов.

Кластеры плотиков м. разбираться с помощью негативных модуляторов и/или с помощью удаления некоторых компонентов плотиков с помощью эндоцитоза. Слияние отдельных плотиков с образование кластера наблюдались повторно, напр., при поперечном сцеплении компонентов плотиков с антителами. Движение и поведение кластеров м. зависеть также от взаимодействия с цитоскелетными элементами и вторичными мессенджерами, такими как phosphoinositide PtdIns(4,5)P₂, который помогает организовать актиновые ансамбли га цитоплазматической поверхности плотиков.

ЛИПИДНЫЕ ПЛАФТФОРМЫ-ПЛОТИКИ

LIPID RAFTS AND SIGNAL TRANSDUCTION

Links