Семейство LNs представлено крестообразными гликопротеинами, состоящими из трех разных цепей α, β и γ, сцепленными с помощью дисульфидных мостиков. Идентифицировано 5 α, 3 β и 3 γ цепей, их комбинация дает, по крайней мере 12 отличающихся вариантов. Известно, что LN состав ВМ является ткане-специфичным и варьирует в ходе эпителиального органогенеза. В легких динамическая экспрессия LNs во время развития охарактеризована плохо. Virtanen et al (1996) описал определенный паттерн экспрессии для β1 и β2 цепей в легких плодов человека: экспрессия цепи β1 первоначально исчезает из развивающихся легочных бронхов, но позднее начинает обнаруживаться в бронхах, когда исчезает β2 цепь, в том же положении. В легких плодов мыши выявлено присутствие цепей LN α3 и α5. Pierce et al. (2000) выявили α5 LN цепь в ВМ всего респираторного эпителия.
LN5 представлен α3 цепью, ассоциированной со специфическими для LN5 укороченными β3 и γ2 цепями. Этот адгезивный лиганд является существенным компонентом временного и слущивающегося эпителия ВМs (Aberdam et al. 1994) и м. связываться с различными интегриновыми рецепторами, такими как α2β1 α3β1, α6β1 и α6β4 Ints (Niessen et al., 1994; Rousselle and Aumeilley, 1994, Orian-Rousseau et al., 1998). LN5 играет важную роль в стабильности соеднинений между DRV и эпителием. LN5 является компонентом закрепляющих филамент, структур, проходящих через lamina lucida ВМ и ассоциирующих с hemidesmosomes (HDs). HDs - это электрон-плотные мультибелковые комплексы, формируемые Int α6β4, HD1/plectin, collagen XVII и bullous pemphigoid antigen BP230. HDs соединяются с закрепляющимися фиблилами посредством якорных филамент. Эти адгезивные структуры обеспечивают стабильное прикрепление базальных эпителиальных клеток к подлежащей ВМ (Jones et al., 1994; Borradori and Sonnenberg, 1996; Green and Jones, 1996). Показано, что LN5 опосредует множественные клеточные функции. Помимо его роли в клеточной адгезии он играет центральную роль в клеточном рассеивании (scattering)(Miyazaki et al., 1993; Grassi et al., 1999), миграции в том числе при заживлении ран и опухолевой инвазии (Pyke et al., 1995; Zhang and Kramer, 1996; Giannelli et al., 1997; Goldfinger et al., 1999; Koshikawa et al., 2000) и в пролиферации эпителиальных клеток (Gonzales et al., 1999).
Ints семейство αβ гетеродимерных трансмембранных гликопротеинов, являющихся рецепторами клеточной поверхности, которые обеспечивают взаимодействие между эпителиальными клетками и белками ВКМ. Субъединицы 18 α и 8 β Int м. комбинироваться, чтобы сформировать, по крайней мере, 23 различных клеточных рецептора, участвующие в клеточной адгезии, миграции, пролиферации и дифференировке (Hynes, 1992; Tournier et al., 1992; Agrez et al., 1994; Herard etal., 1996). Распределение некоторых Int рецепторов во время развития легких у плодов человека чатично известно. Авт. уже сообщали о экспрессии Int-α2, -α4, -α5, -α6, -αv и -β1 в плазматической мембнране клеток эпителиального зачатка во время реннего морфогенеза ветвления и продемонстрировали появление Int-β4 в дифференцирующемся трахейном эпителии (Coraux et al., 1998). Во время альвеолярной дифференцировки Virtanen et al. (1996) описали локализацию Int-α2, -α3, α6 и β4 в дистальных воздушных путях, показав дифференциальную экспрессию Int во время развития легких человека.
В данной работе изучали распределение LN5 во время развития воздушных путей и дифференцировки респираторного эпителия у человека. Установлено, что LN5, составляющие ее цепи и ее Int рецепторы обладают дифференциальной экспрессией в воздушных путях в ходе их развития с дифференциальной локлшизацией во время морфогенеза ветвления и дифференцироваки эпителия. Установлено также, что HD nucleation ассоциирована с дифференцировкой эпителия трахей.
LN5 and Its Int Receptors During Human Airway Branching Morphogenesis
Ранняя экспрессия LN5 во время ветвления воздушных путей человека обнаруживает два паттерна распределения: LN5 локализуется как в ВМ проксимальных респираторных тубул с увеличивающейся плотностью в расщепе (clefts) разветвления и в цитоплазме клеток, которые формируют эпителиальные почки, проникающие в мезенхиму.
Было предположено, что в морфогенезе ветвления в легких белки ВКМ функционируют как физический барьер (Hilfer, 1996). Расширяющийся матрикс препятствует ветвлению образующихся воздушных путей, покрывая их и устанавливая точки разветвления за счет действия в качестве барьера росту в месте расщепа. Присутствие LN5 в ВМ проксимальных частях репираторных тубул и увеличение его плотности в точке расщепа указывает на его роль.
Эпителиальные почки являютя областями интенсивной пролиферации клеток (Goldin et al., 1984) и миграции, которая сопровождаетм инвазию окружающей мезенхимы. В этих почках, LN5 больше не обнаруживается в ВМ, но обнаруживается в клеточной цитоплазме. Сходное внутриклеточное распределение LN5 наблюдается при инвазии опухолей. Известнро, что LN5 специфически ассоциирует с отпочковывающимися опухолевыми клетками , локализуясь во фронте инвазии и всегда обнаруживается в цитоплазме опухолевых клеток (Pyke et al., 1995). LN5 и в особенности γ2 цепь рассматриваются как маркеры инвазивности колоректальных, желудочных, цервикальных и легочных карцином, и их повышенная экспресся ассоциирует с миграцией клеток (Sordat et al.,1998; Koshikawa et al., 1999; Maatta et al., 1999; Skyldberg et al., 1999). Все это указывает на участие LN5 в морфогенезе ветвления легких за счет модуляции пролиферации и/или миграции эпителиальных клеток.
Во время ранней псевдогландулярной ст. развития (7-14 неделя беременности) почкующиеся эпителиальные клетки экспрессируют α2β1, α3β1, и α6β1 Int, которые располагаются на плазматической мембране (Coraux et al., 1998). Во время поздней псевдогландулярной ст. (14-17 недель) и каналикулярногой ст. развития (18-24 недель) почкующиеся клетки экспрессируют α2β1 и α3β1 Int. Следовательно, эти рецепторы участвуют в морфогенезе ветвления путем модуляции миграции или пролиферации. Int-α2 выявлен в плазматической мембране почкующихся респираторных эпителиальных клеток у мышей (Wu and Santoro, 1996) и in vitro морфогенезе ветвления эпителиальных клеток молочных желез (Berdichevsky et al., 1994) и клетках почек собак (Saelman et al., 1995). Показано также, что Int-α3 модулирует развитие легких in vivo и что Int-α3-нулевые мыши имеют аберрантный морфогенез ветслвения воздушных путей (Kreidberg et al., 1996). Исследования in vitro показывают, что антитела против Int-α6 ингибируют морфогенез ветвления подчелюстнгых слюнных желез и почек. Однако Int-α6-нудевые мыши обнаруживают нормальный морфогенез ветвления почек.
Итак, Int рецепторы α2β1, α3β1, и α6β1 являются рецепторами для некотоых изоформ LN в основленности для LN1? который играет ключевую роль во время развития легких. При этом коэкспрессируется LN5 со своими Int рецепторами в ветвящихся респираторных эпителиальных зачатках в течение всей псевдогландулярной ст. развития. Int α6β1? по-видимому. подавляется во время каналикулярной стадии. Значит эти рецепторы м. связывать не только LN1, но и LN5 во время мофогенеза ветвления.
LN5 and Its Int Receptors During Human Respiratory Epithelium Differentiation
На 7 неделе беременности ВМ трахей плода человека уже экспрессируют LN5. На этой ст. развития эпителий трахей недифференцирован и клетки, лежащие на ВМ экспрессируют Int-α2, Int-α3 и Int-β1 на своих плазматических мембранах. Int-α6 ограничен базальной плазматической мембраной, тогда как Int-β4 не обнаруживается (Coraux et al., 1998). Несмотря на присутствие LN5 и Intα6 не обнаруживается HD-подобных структур в месте соединения недифференцированного эпителия с ВМ. Следовательно, адгезия в это время осуществляется не за счет HDs. Установлено, что клеточные взаимодейстия с LN5 инициируются за счет Int α3β1 в фокальных адгезиях, которые обеспечивают динамическое прикрепление клеток, тогда как стабильное закрепление клеток на ВМ обеспечивается соединением Int α6β4, которое индуцирует нуклеацию HD-подобных стабильных крепежных контактов.
В эпителии трахей плодов человека HDs впервые обнаруживаются в конце псевдогландулярной стадии, когда начинается эпителиальная дифференцировка. Начинает обнаруживаться Int-β4 в базальной плазматической мембране вновь дифференцированных клеток, которые колокализуются с Int-α6 (Coraux et al., 1998). Это указывает на участие Int-β4 в нуклеации HD и дифференцировке эпителия трахей. Критическая роль Int-β4 в сборке HDs выявлена в кератиноцитах (Gagnoux-Palacios et al., 1997; Schaapveld et al., 1998). Более того, теперь выявлена роль Int α6β4 как сигнальнго медиатора. Связывание Int α6β4 LN5 ведет к фосфорилированию тирозина в цитоплазматическом домене Int-β4, что активирует Ras/MAP-киназный путь путем связывания и фосфорилирования Shc адапторного белка и рекрутирования Grb2, пути участвующего в контроле клеточной дифференцировки (Cowley et al., 1994).
В дистальных частях дифференцирующихся легких, на альвеолярной стадии и у взрослых ВМ, участвующие в формировании дифференцированных бронхиол, содержат LN5. Экспрессия его коррелирует строго с экспрессией Intα2, Int-α3, Int-α6 и Int-β1 при этом подавялется экспрессия Int-β4. LN5 экспрессируется также и в альвеолярной паренхиме, это м. указывать на его участие в развитии альвеолярных структур (Mizushima et al., 1998).
Итак, Во время морфогенеза ветвления в легких LN5 взаимодействует с α2β1, α3β1, и α6β1 в результате м. регулировть пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток в респираторных почках, проникающих в окружающую мезенхиму и м. также участвовать в установлении точек ветвления и дифференцировке эпителия трахей.
Branching morphgenesis
МОРФОГЕНЗ ВЕТВЛЕНИЯ
Начиная примерно с 10.5 дня эмбриогенеза у мышей начинается branching morphogenesis, создающий бронхиальное дерево и определяющий проксимо-дистальную ось легких в конце псевдогляндулярной стадии (Е16.6). Инициальные веточки возникают в результате образования почек; в последующих дихотомических подразделениях ВКМ играет, по-видимому, важную роль, накапливаясь в расщепе (clefts).
FGF-10 обеспечивает базу для ветвления тубул
FGF-10 основаная движущая сила при индукции почек во время ветвления. Трехмерный паттерн FGF-10 в мезенхиме путем диффузии активирует FGFR-2IIIb в ближайшем эпителии, в рузльтате появляется почка в стереотипическом положении и возникает регулярный паттерн разветвления. FGF-10 экспрессируется динамически в дистальной легочной мезенхиме (рис.4D). Экспрессия АПА-10 осуществляется последовательно с короткими интервалами между Е11.5-12.5, транскрипты обнаруживаются в проспективных местах образования почек, как только почка образуется, локальный сигнал исчезает, чтобы появиться в другом месте. Следовательно, FGF-10 участвует в пространственном контроле почкования с помощью механизма, аналогичному механизму формирования паттерна трахей у дрозофилы. FGF беспозвоночных (branchless) управляет почкованием в соответствующих позициях. FGF-10 оказывает эффект хемоаттрактанта и индуцирует локальное почкование.
Дистальные легкие как сигнальные центры во время морфогенеза ветвления
Важной характеристикой FGF-10 механизма является его сеграгация от проксимальных легких. FGF-10 мРНК экспрессируется дистально. Предполагается, что проксимальная мезенхима противодействует эффектам FGF-10. В дистальных легких, экспрессия индукторов и репрессоров динамически сбалансирована, чтобы способствовать почкованию и обеспечиват правильный паттерн. Важные регуляторы формирования паттерна, такие как Ыhh и его рецептор Patched (Ptc), BMP-4, Nkx-2.1 преимущественно экспрессируются на кончиках ветвящихся тубул. Предполагается, что дистальные легкие действуют как сигнальные центры, контролирующие рост и судьбу клеток, как это происходит в прогрессивной зоне развивающихся конечностей. Во время ветвления ВМР-4 динамически экспрессируется в дистальном легочном эпителии. Экспрессия ассоциирует с периодами увеличения почек, чем с периодом их инициации. Напротив type 1 BMP receptor идентифицируется в развиающихся легких от проксимального до дистального эпителия. Идея, что сигнальный центр регулирует проксимо-дистальную судьбу клеток в легких высказана Weaver et al(1999). Экспрессия доминантного негативного ВМР репрессора Alk6 (BMPR1B) или секретируемого ВМР-4 ингибитора Xenopus Noggin (XNoggin), направленная на дистальные части легких вызывает нарушение дистального развития и проксимализацию легочного фенотипа. Авт. предположили, что ВМР-4 является частью дистального сигнального центра, который специфицирует судьбу клеток вдоль проксимо-дистальной оси респираторного тракта. Клетки на кончиках дистальных тубул, подвергнутые воздействию высоких концентраций этих сигналов получают дистальные характеристики, тогда как клетки, которые все дальше от этой зоны приобретают проксимальный фенотип. Разрушение этого центра ведет к нарушению формирования дистального паттерна.
На
FGF-10, ВМР-4 и образование дистльного сигнальнго центра
На
Рис. представлена возможная модель ветвлений в легких. Она показывает генерацию первичной почки на дистальном кончике и трех вторичных почек (1, 2, 3). (A) Реакция растущего кончика. Wnt7b и Fgf10 стимулируют пролиферецию эпителия и мезенхимных клеток. По мере роста зачатка уровень BMP возрастает в дистальном кончике и достигает уровня, который способен ингибировать FGF10. (B) Латеральное ингибирование предупреждает латеральные части зачатка от образования ответвлений до тех пор, пока происходит взаимодействие в дистальном кончике. (C, D). Когда взаимодействия в дистальном кончике ингибируются Bmp4, то FGF10 обнаруживается в латеральной мезенхиме и индуцируются вторичные почки, каждая из них со своей собственной зоной латаральной ингибиции. (D) Внеклеточный матрикс отклоняет наиболее дистальные области и стабилизирует образование почки(Hogan et al., 1999; Warburton et al., 2000).
Взаимодействия между мезенхимными и эпителиальными компонентами дистальной почки м.б. фундаментальными для возникновения и поддержания этого сигнального центра (рис. 3). Показано, что высокий уровнь ВМР-4 на кончике почки м.б.функцией близости почки к FGF-10-экспересирующим клеткам. FGF-10 способен индуцировать эктопичский домен ВМР-4 в эпителиальных эксплантантах, отделенных от проксимальных воздушных путей, в отсутствие мезенхимы. Высокие уровни ВМР-4 на кончиках м.обусловливать лимит опосредуемому FGF-10 росту почки.
Т.обр., FGF-10 сам по себе не может действовать как фактор дифференцировки для респираторного эпителия или напротив м. избирательно влиять на дифференцировку в направлении фенотипов иных, чем фенотип клеток типа II. Предполагается, что передача сигналов ВМР-4 будет индуцировать дифференцировку альвеолярных клеток типа I. Избыточная экспрессия ВМР-4 в дистальных частях легких трансгенных мышей дает маленькие легкие с расширенными дистальными почками, выстланными сквамозным эпителием, напоминающим клетки типа I, такие легкие имеют сниженные количествпа клеток, экспрессирующих сурфактантный белок SP-C.
Помимо FGF-10 еще 2 транскрипционных фактора влияют на ВМР-4. Nkx2/1 (TTF-1) обычно обнаруживается в эпителии кончика почки на ранних стадиях развития легких. Легкие Nkx2.1-/- мышей не дают типичных дистальных структур, а экспрессия ВМР-4 резко снижена. Pod1 bHLH фактор экспрессирует в мезенхиме легких и др. развивающихся органов, егоинактивация нарушает дистальный морфогенез и дает гипопластичные легкие. Отсутствие Pod1 в мезенхиме таких мутантов не влияет на экспрессию FGF-10, но обусловливает подавление экспрессии ВМР-4 в эпителии. Следовательно, экспрессии FGF-10 не достаточно для поддержания адекватного уровня ВМР-4 в дистальных частях легких. Очевидно Pod1 и FGF-10 влияют на ВМР-4 разными путями.
Антогонизм сигналов FGF и ВМР в сигнальном центре
Sprouty и Noggin молекулы, которые скорее всего поддерживают границы этого сигнального центра. Sprouty (Spry) гены кодируют семейство богатых цистеином белков, которые являются антогонистами сигналам FGF. У дрозофилы Spry индуцируется FGF сиганлами на кончике почки трахейной системы, где он ингибирует латеральное почкование. Известны 3 сходных гена у мышей mSpry1,2,4 в специфических типах клеток разных органов. Не все FGF индуцируют экспрессию Spry, Spry2 и Spry4 экспрессируются в развивающихся дистальных частях легких, в эпителии и мезенхиме, соответственно. Инактивация Spry2 оказывает стимулирующий эффект на дистальное ветвление и дифференцировку в органной культуре. Noggin является секретируемым антогонистом сигналов ВМР, он конкурирует с ВМР рецепторами за связывание с высоким сродством с ВМР (преимущественно с ВМР-2 и ВМР-4). Низкие уровни Noggin присутствуют в мезенхиме дистальных частей легких вплоть до Е13.5; Noggin экспрессируется также в трахейной мезенхиме дорсально, комплементарно ВМР-4. Другой ВМР антогонист Chordin и Cerberus-related fgactor Cer1 присутствуют в развивабющихся легких и имеют перекрывающиеся функции.
Антогонистом образования дистального сигнального центра выступает также ретиноевая кислота. Появление вторичных почек и инициация морфогенеза ветвления делаются заметными при резком подавлении сигналов RA как в эпителии, так и мезенхиме легких. Обработка высокими уровнями RA нарушает дистальное развитие и поддерживает легкие на проксимально-подобной незрелой стадии. В этих культурах экспрессия FGF-10 ингибируется, а ВМР-4 сигналы на кончиках почек низки и диффузны.
Shh и контроль индукции почек
Предполагается, что в интактных легких эпителий продуцирует растворимые факторы, которые являются ингибиторами для FGF-10. Имеются доказательства, что Shh один из таких факторов. Shh преимущественно экспрессируется в дистальном эпителии, из которого диффундирует, формируя комплекс с Ptc и Smoothened (Smo) и активирует передачу сигналов в мезенхиму. Мишени для Shh первоначально мезенхимные. Одной из функций Shh, по-видимому, является гашение экспрессии FGF-10, когда почка растет в направлении хемотактического центра. Shh ингибирует экспрессию FGF-10. Механизмы, предупреждающие широкое распространение FGF-10 сигналов, важны для поддержания пространственного градиента FGF-10. В легких Shh-/- мышей экспрессия FGF-10 не фокальна, по сравнению с контролем, а скорее диффузна, а морфогенез ветвления нарушен. Другим важным признаком у Shh-/- является повышенная гибель клеток и пониженная пролиферация в мезенхиме. Следовательно, Shh выступает как трофический фактор в легочной мезенхиме.
Контроль элонгации и экспансии почки
Когда почка индуцирована, то петля обратной связи с мезенхимой может определять как далеко должна расти почка и насколько велика она должна быть. Рост эпителиальной поски стимулируется с помощью продуцируемых мезенхимой митогенных факторов, таких как EGF, PDGF или HGF, индивидуально или синергично с FGFs. Напротив сигналы ВМР ингибируют пролиферацию легких. По мере роста легочной почки в направлении источника хемоаттрактанта, уровень ВМР-4 на кончике почки увеличивается при приближении к клеткам, экспрессирующим FGF-10. Увеличение уровня ВМР-4 и активация передачи сигналов в эпителии ограничивают пролиферацию на кончиках. Установлено, что TGFβ-1 негативно регулирует ветвление легких в органной культуре, путем взаимодействия с пролифеацией эпителиальных клеток и с FGF-10-обусловленной хемоаттрактацией, т.к. TGFβ-1 подавляет экспрессию FGF-10 в легких. Его мPНК экспрессируется в субэпителиальной мезенхиме, где экспрессия FGF-10 устранена. Более того TGFβ-1 стимулирует синтез матричных компонентов, которые откладываются в месте взаимодействия эпителия и мезенхимы и стабилизируют расщепы и предупреждают локальное почкование. (Рис.3).
Сигналы FGF в ветвлении легочного эпителия и его дифференцировке
Ограниченное количство FGF лигандов и все FGFRs присутсвуют в эмбриональных легких и их экспрессия регулируется во времени и пространстве. В культурах АЕС клеток FGF-7 может индуцировать АЕС2-подобные фенотипы, тогда как FGF1 этого не может, хотя оба связывают один и тот же субтип FGFR-2IIIb. Некоторые эффекты FGF лигандов,по-видимому, детерминируются пространственно-веременным распределением FGFRs и гепаран-сульфат протеогликанов, которые также влияют на взаимодействия легандов с рецепторами: FGF1 индуцирует почкование в культтуре эпителия в местах с наивысшей концентрацией FGFRs. FGF10 экспрессируется на высоком уровне в дистальной мезенхиме в проспективных местах образования почек. Предполагается, что FGF10 может действовать как сигнал наведения для дистального эпителия. Но FGF10 не взаимодействует с эпителиальной дифференцировкой и оказывает слабое влияние на пролиферацию. У FGF10 нулевых мутантов отсутвуют легкие дистальнее carina и отсутствуют конечности, следовательно, сигналы FGF10 играют роль в организации как конечностей, так и легких.
Трансплантации или эктопическая экспрессия зоны поляризующей активности вызывают удвоения конечностей. Ключевые сигнальны процессы в морфогенезе конечностей связаны с FGF8, -10, Shh, BMP2 и ретиноевой кислотой. Последняя необходима для инициальных индуктивных событий и не нужна для последующего роста конечностей. Антогонисты ретиновевых рецепторов нарушают паттерн конечностей: блокируют образование ЗПА, экспрессию Shh и ВМР2, но не FGF-8 и гомеобоксный ген HoxD-13. Морфогенетические эффекты ретиноевой кислоты могут быть опосредованы ею активируемой цистеин киназой-1, которая активирует и стабилизирует протеин киназу С.
Сайт создан в системе uCoz