МОЛОЧНЫЕ ЖЕЛЕЗЫ: МОРФОГЕНЕЗ
Postnatal mammary gland morphogenesis Gary B Silberstein Microsc. Res. & Techn. 2001. V. 52. N 2. P. 155-162
Развитие молочных желез проходит 2 морфогенетически отличные фазы. Первая начинается с дифференцировки рудимента протока молочной железы из эмбрионального эпидермиса и заканчивается после созревания элегантной разветвленной системой протоков (Рис.1а). Во второй фазе, начинающейся при беременности, развиваются ацинарные секретирующие молоко дольки в этой первичной сети. Во время развития сети протоков влияние стромы наиболее заметно. Более 90% рака молочных желез у человека возикает из протоков. У гомозиготных по мутантному гену Нохс6 мышей торакальные грудные железы слегка недоразвиты при рождении и полностью лишены эпителия у взрослых, а inguinal протоки молочных желез расширены и неспособны регрессировать в ответ на оварийэктомию. У новорожденных ветвление протоков и формирование жировой подушки нарушено. У гомозиготных Нохс6 мутантных мышей выявляется также гомеозисная трансформация второго торакального позвонка в первый в 60% случаев, что соответствует передней граница экспрессии этого гена и уровню наиболее выраженных дефектов в грудных молочных железах. H. Mori, A. T. Lo, J. L. Inman, J. Alcaraz, C. M. Ghajar, J. D. Mott, C. M. Nelson, C. S. Chen, H. Zhang, J. L. Bascom, M. Seiki, M. J. Bissell Transmembrane/cytoplasmic, rather than catalytic, domains of Mmp14 signal to MAPK activation and mammary branching morphogenesis via binding to integrin β1 Development 140, 343–352 (2013) Matrix metalloproteinases (MMPs) важны для инвазии эпителиальных клеток в окружающую строму, поскольку их протеолитическая активность способна деградировать внеклеточный матрикс (ECM) и высвобождать сигнальные молекулы во внеклеточное пространство. Сообщается, что Mmp14 функционирует в ветвлении эпителиальных трубок молочных желез независимо от её протеолитического домена. В то время как Mmp2 и Mmp3 в первую очередь экспрессируются в строме, Mmp14 экспрессируется в строме и на кончиках эпителиальных веточек в развивающихся молочных железах мышей in vivo. Первичные молочных желез органоиды и агрегаты клеточной линии молочных желез EpH4 культивировали в плотном (3 mg/ml) трехмерном коллагеновом матриксе, чтобы воссоздать предраковые условия в моложных железах или в разреженном (1 mg/ml) трехмерном коллагеновом матриксе, который воспроизводит нормальные микроусловия в молочных железах. Как в плотном, так и разреженном матриксе индуцируемая fibroblast growth factor 2 (FGF2) инвазия в коллагеновый матрикс и ветвление эпителиальных клеток предупреждались воздействием короткой шпилечной РНК (shRNA), нацеленной на Mmp14. Однако ингибиторы протеолитической активности MMPs предупреждали инвазию только в плотном геле. В то время как обработка EpH4 клеток ингибиторами MMP не оказывали эффекта на активность mitogen-activated protein kinase (MAPK) Erk, молчание Mmp14 снижало обилие фосфорилированных (активных) Erk, а также концентрацию интегрина β1 (Itgb1) и фосфорилированных (активных) Itgb1. Замалчивание Itgb1 с помощью shRNA предупреждало ирнвазию и снижало концентрацию как Mmp14, так и фосфорилированных Erk в EpH4 клетках, культивруемых на разреженном матриксе. Концентрация Itgb1 также снижалась в молочных железах у Mmp14 нокаутных мышей по сравнению с контрольными гетерозиготами. Сходным образом, обработка с помощью ингибитора MAPK снижала инвазию и концентрацию как Mmp14, так и Itgb1 в EpH4 клетках, культивруемых в разреженном матриксе. Совместная иммунопреципитация и эксперименты с fluorescence resonance energy transfer (FRET) показали, что Mmp14 и Itgb1 ассоциированы др. с др. в EpH4 клетках. Трансгенная экспрессия полной длины, связанной с мембраной Mmp14 или мутантной версии Mmp14, лишенной внеклеточного каталитического и hemopexin доменов, восстанавливала как инвазию, так и концентрацию фосфорилированного Itgb1 в EpH4 клетках, в которых Mmp14 находилась в нокдауне. FRET анализ подтвердил, что эта мутантная версия Mmp14, которая состоит только из трансмембранного и цитоплазматического доменов, ассоциирует с Itgb1. Итак, эти данные демонстрируют модель, согласно которой трансмембранный или цитоплазматический домены Mmp14, или оба, способствуют сигнальному пути MAPK посредством Itgb1, чтобы стимулировать ветвление эпителиальных трубок во время нормального развития молочных желез. Осталось неясным, играют ли роль некаталитические активности Mmp14 в прогрессировании опухолей, но полученные результаты указывают, что некаталитические домены MMPs необходимо учитывать в попытках воздейстовать на MMPs при лечении рака. More Than a Protease Annalisa M. VanHook (6 March 2012) Sci. Signal. 5 (214), ec71. [DOI: 10.1126/scisignal.2003016] Tissue Inhibitors of Metalloproteinases in Cell Signaling: Metalloproteinase-Independent Biological Activities William G. Stetler-Stevenson (8 July 2008) Sci. Signal. 1 (27), re6. [DOI: 10.1126/scisignal.127re6]	Рисунки в оригинале статьи Рис.1 A. Система протоков молочной железы у 5-нед. нуллипарозных мышей. "Открытая" архитектура протоков более чем у 80% железы лишена паренхимы. Концевые почки (большие стрелки), которые указывают на растущие протоки, расположены вдоль левой стороны желызы находятся на разных стадиях регрессии. Латеральные веточки (маленькие стрелки) - нерастущие протоки, темны объект в основании рисунка - сосок. ув. 15X. B. Открытая архитектура обусловлена локальной регуляцией, в результате чего почки не сталкиваются с соседними протоками (большие стрелки), латеральные веточки лишены утолщений (маленькая стрелка). Ув. х 250. Рудименты молочных желез состоят из одиночного протока, который постепенно распространяется от соска во време первых 3-х недель после рождения. Начиная с 3-4 недель начинают фунеционировать оварии и скорость роста протков и ветвление увеличивается. В 5 недель протоки обычно заполняют примерно 2/3 жировой подушки сильно разветвленной системой с веточками второго и третьего порядка. В отличие от развития аморфной гландулярной ткани, морфогенез протоков нуждается в динамической структуре, в которой постоянное добавление новых клеток совпадет с канализацией и продвижением вперед. В молочных железах концевые почки обеспечивают эту многостороннюю функцию, а растущие протоки предопределяются их присутствием. Когда протоки приближаются к краю жировой подушки или оказываются окружены другими протоками, рост ингибируется и концевые почки трансформируются в blunt-tipped (тупые сверху)структуры с небольшим количеством или без делещихся клеток. Обозначение "открытая" архитектура по отношению к железам небеременных мышей указывает на высокую степень регуляции локального роста, т.к. действием системных гормонов нельзя объяснить высоко локализованный поворот в направлении движений и ингибирование, необходимые для образования пространств. Т.к. протоки являются морфологически дифференцированными, то они обладают существенной пролиферетивной способностью. При действии на них гормоном беременности, прогестероном, и проклактином индуцируется рост вторичных веточек, которые заполняют пространства между протокаим ацинарными структурами, называемыми лобулоальвеолами (lobuloalveoli), молоко-продуцирующими элементами желез, а также дополнительными боковыми веточками. Прекращение вскармливания вызывает поетерю секреторных альвеол в результате апоптоза и возвращение желез более или менее к предбеременному состоянию. Морфогенез протоков Финальные двухслойные структуры протоков молочных желез образуются в концевых почках, где сар клетки представлены монослоем стволовых клеток, которые дают контрактильный миоэпителий и лежащую поверх вторую большую популяцию клеток, предназначенную для выстилки просвета (рис. 2). Рис.2 A. Продольный срез через концевую почку, показывающий слой клеток шапочки (звездочка) с выраженным субкапсулярным пространством, отделяющим ее от подлежащих pre-lumenal тел клеток (маленькая стрека). Фиброзная соединительная ткань (большие стрелки) появляется в концевых почках в точке сужения, где начинается проток. Ув. 280X. B. Бифуркация концевой почки. Видны два фокуса фибротической индукции (связаны пунктирной линией). Фиброзная ткань в расщепе (полая стрелка) распространяется частично и поверх новых концевых почек, по-видимому, направляет рост доли слева под углом. (Сплошная стрелка) фиброзная индукция на флангах.Ув. 250X. Сар клетки мигрируют в последний компартмент, указывая тем самым, что они м. быть источником клеток предшественников для всей железы. Е- и Р-кадгерин участвуют в становлении структуры эпителиальных слоев и трубок, концентрируюясь на латеральных мембранах сар клеток и клеток тела, соответственно. Анти-Е-кадгериновые антитела селективно дизорганизовывали просветные клетки, оставляя сар клетки интактныи. Анти-Р-кадгериновые антитела вызывают лишь частичные нарушения слоя сар клеток, указывая тем самым, что структура эта более сложная, чем лежащих над ними клеток. И другие механизмы участвуют в подразделении на компартменты. Несмотря на расположение на базальных мембранах сар клетки обладают слабой апикально-базальной поляностью, на это указывет обнаружение на их внутренней (псевдо-апикальной поверхности макромолекул базальных мемран, гиалуроната и ламинина. Гиалуронат сильный гидрофильный гликозаминогликан м. создавать пространства внутри развивающихся структур. Часто обнаруживаются "суб-капсулярные" пространства, разделяющие развивающиеся слои концевых почек, появление которых м. связать с присутствием гидрофильных молекул. Рис.3 Иммунолокализация Е- и Р-кадгерина и эффекты cognate блокирования антител на организацию концевых почек. A. P-cadherin окрашивание оболочек клеток шапочки (головки стрелок) и небольшого числа клеток в просвете (стрелка). Ув. 400X. B. E-cadherin окрашивание оболочек клеток просветов (головки стрелок). Отсутствует окраска клеток шапочки (стрелка). Ув. 400X. C. Эффект анти-Р кадгерина на организацию клеток шапочки. Фокальная дизорганизация (стрелка). Ув. 400X. D. Эффект анти-Е кадгерина на организацию клеток просвета. Интактный слой клеток шапочки (стрелка). Ув.300X. Формирование просвета Образование просвета в протоках молочных желез явлется скорее внутренним свойством морфогенеза концевых почек. Тем неменее выясняется, что многие, если не сплошные, то полностью забиты люминальными клетками. Получены доказательства, что апоптоз участвует в редукции клеточной массы концевых почек, возможно обеспечивая образование просвета. Высокий уровень апоптоза выявляется в слоях клеток тела непосредственно рядом с просветом и совпадает с местом снижения уровня синтеза ДНК. Расширение протока и преобразоание концевой почки в проток Морфогнез и удлиннение протока происходят одновремено. Получены доказательства, что расширение зависит от давления, создаваемого внутри концевой почки. Это и отсутствие филоподиальных выростов из сар клеток в жировую строму характеризует структуру, которая выталкивается, а не тянется вперед. Давление исходит определенно от добавления новых клеток к телу концевой почки. Преобразование концевой почки в дуктальную структуру одновременно вызывает ее движение вперед. Возможно эти механизмы включают контракцию филоподий миоэпителиальных клеток, которые покрывают фланги концевых почек перед реорентацией продольно вдоль противолежащих протоков, и ремоделирование ВКМ. Значительное ремоделироание ВКМ совпадает со сжатием и утолщением коллагена типа I и фланговых ВКМ покрытий, богатых сульфатированными гликозамионогликанами (SGAG). Индукция этих фиброзных покрытий создает пространство для добавления новых клеток и создает пояс, который должен создавать и направлять давление вперед, обеспечивая тем самым пассивное удлиннение. ВКМ является сложным морфогеном молочных желез, а коллаген, в частности, важен для тубулогенеза. Эпителиальные клетки молочных желез утопают в коллагеновом геле и образуют узкие трубочки, которые видны и in vivo. С помощью связывания членов семейства интегринов рецепторов ВКМ коллаген м. стимулировать образование актин-цитоскелетных фокусов, которые способны изменять форму клеток молочных желез. β1- интегрин локализован на базальной поверхности эпителия концевых почек, а соответствующие антитела обратимо ингибируют развитие концевых почек in vivo и тубулогенез in vitro. Бифуркация концевых почек Точка будущего ветвления обнаруживает себя как расщепление дистальной поверхности концевой почки, которое содержит скопление коллагена типа I и SGAGs. ВКМ в расщепе зеркально отражает индукцию сходных фиброзных тканей с теми, что на флангах концевой почки. Очевидно, что сильно сконцентрированный синтез SGAG и коллагена инициирует расщепление и вызывает активное ветвление. FGF рецептор с отсутствием киназной активности (Fgfr2-IIIb) строго ингибирует лобулоальвеолярный морфогенез, этот эффект зависит от FGF7. Это указывает на то, что FGF является регулятором, по крайней мере, одного типа ветвления в молочных железах. В развивающихся легких FGF-7 исходит из мезенхимы и действует как хемоаттрактант, управляющий бифуркацией. Однако нет доказательств, что хемоаттракция играет роль в бифуркации или расширении концевых почек молочных желез. Легочная модельпредсказывает, что сигналы, генерируемые эпителием, должны влиять на экспрессию генов в соседней соединительной ткани. Когда протоки множатся выявляются многочисленные ДНК-синтезирующие клетки перед фронтом концевой почки на расстоянии 250µм. Чего не наблюдается перед нерастущими протоками или в пустой строме. Кроме того большие количества нетрофилов и других клеток белой крови агрегируют вокруг концов концевых почек, указывая на то, что хемоаттрактанты генерируются вблизи. СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА И МОРФОГЕНЕЗ Выявлена эндокринная основа роста протоков Рост протоков Установлено, что стромальные, а не эпителиальные рецепторы эстрогена стимулируют рост протоков. Рецепторы эстрогенов концентриуются в ядрах стромальных клеток вокруг концевых почек, но не в быстро делящихся сар клетках. паракринная роль эстрогена подтверждена и экспреиментами по тканевой рекомбинации. Нокаут эстрогенных рецепторов (ERKO) ведет у мышей к развитию лишь укороченных рудиментов протоков. Они растут на строме дикого типа. Но строма ERKO не поддерживает рост эпителия дикого типа. EGF стимулирует рост концевых почек, он м. заменять собой эстроген. EGF-обеспечиваемый паракринный механизм действия эстрогена подтвержден при действии антител против EGF, блокирующи стимуляцию эстрогеном концевых почек. Сильное подавление роста протоков наблюдается при нокауте EGF рецепторов (EGFR) у мышей. Местом действия EGF являются стромальные клетки, которые генерируют вторичные маммотрофные сигналы, которые еще неизвестны. Показано, что EGFR не нужны для лобулоальвеолярного развития. Основой действие гормона роста также сказывается на стромальных клетках. Гормон роста, а не пролактин, стимулирует синтез IGF-1 в молочных жеоезах. Важная роль IGF-1 в формировании концевых почек и удлинении протоков подтверждена с помощью целенаправленной делеции IGF-1, которая вызывает полную остановку роста протоков, которая м.б. преодолена внеклетчоным IGF-1, но не гормоном роста. Лобулоальвеолярное развитие Прогестрон и пролактин необходимы для секреторного развития. Целенаправленное разрушение гена пролактина и его рецептора (PRLR) выявляет место его действия. Редуцируется образование боковых веточек, но сохраняются концевые почки. Если PRLR-нуллевой эпителий трансплантировать на жировые подушки дикого типа, то развитие протоков осуществляется нормально, но при беременности лобулоальвеолярное развитие ингибируется. Делеции прогестеронового рецептора (PRKO) вызывают редукцию лобулоальвеолярного развития, удлиннение же протоков осуществляется нормально Рецепторы прогесторона обязательны для субнабора стволовых клеток в луменальном компартменте протока, они маркируют, по-видимому, клон секреторных предшественников. При беременности негативные по прогестероновому рецептору клетки используются для лобулоальвеолярного развития и продукции молочного белка (β-казеина). Следовательно, прогестерон обычно действует путем передачи межэпителиальных паракринных сигналов. Активины и ингибины, члены сверхсемейства TGF-β, участвуют в регуляции как лобулоальвеолярного развития, так и роста протокв. Целенаправленная делеция субъединицы ингибина βB устраняет три из димерных молекул и обусловливает задержку удлиннения протоков и альвеолярный морфогенез, ведущий к неспособности лактации. Передача сигналов от стромы к эпителию продемонстрирована и с помощью гетеролигичной рекомбинации ткани, в которой βB-дефицитный эпителий давал нормальные протоки и лобулоальвеолярное развитие на жировых подушках дикого типа. Показано, что потеря любого из указанных выше факторов, не компенсируется другими, следовательно, их пути пересекаются и взаимодействуют. ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ И ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА ПРОТОКОВ Создание открытой гландулярной архитектуры зависит от активного подавления расширения концевой почки в границах жировой подушки, а также от предупреждения заполнения пространств между протоками с помощью образования боковых веточек. Рис.4 TGF-β1 flux через образующуюся, латеральную почку с сильным TGF-β1 иммуноокрашиванием, ассоциированным с коллагеновыми воллокнами в перидуктальном ВКМ (большие стрелки). Латеральная почка (box) уже начала pushing (маленькая стрелка) на ВКМ, which lacks immuno-detectable TGF-β1. Резкая потеря окрашивания начинается на латеральном крае почки. Ув. 300X Члены семейтва TGF-β быстро и необратимо ингибируют рост концевх почек. Экспрессия TGF-β1 во всей системе протоков указывает на его потенциальную роль в формировании паттерна железы. Эктопическая экспрессия активированного TGF-β1 существенно редуцирует образование латеральных веточек, тогда как альвеолярные структуры развиваются нормально. Экспрессия мутантного рецептолра концентрируется не в эпителии, а в перидуктальной строме и характеризуется драматическим увеличением латерального ветвления. Следовательно, TGF-β1 регулирует латеральное ветвление и местом его действия являются стромальные рецепторы, а не эпителий. Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует ветвление эпителиальных трубок молочных желез in vitro и уровень мРНК HGF увеличивается вдвое у мутантов по TGF-β рецептору. Следовательно, хроническое ингибирование с помощью TGF-β1 ветвления обусловлено подавлением экспрессии РПА в околопротоковом ВКМ. Ветвление стимулируетс также матрикс-деградирующими ферментами, стромелизином-1 и IGF-1, активность которых не зависит от сигналов TGF-β1. Роль TGF-β1 выявляется и в секреторном развитии, так, при избыточной экспрессии TGF-β1 в эпителии беременных подавляется лобулоальвеолярное развитие и продукция молока, тогда как ингибирование действия TGF-β в эпителии обусловливает преждевременную секреторную дифференцировку. TGF-β1 и ВКМ TGF-β1 локлаизуется в молочных железах в высокой концентрации в фиброзных элементах перидуктального ВКМ. Предполагается, что ВКМ является резервуаром TGF-β1, который функционирует обычно ингибируя латеральное ветвление. Механизм связи TGF-β1 с ВКМ возможно базируется на декорине. Ингибирование роста концевых почек: роль TGF-β1? Тот факт, что экзогенный TGF-β1 индуцирует фиброзную сар (шапочку) поверх кончика концевой почки позволяет предполагать. что высокие уровни естественно появившегося TGF-β1 во фронте концевой почки м. индуцировать ВКМ и ингибирование. Однако ингибирование синтеза ДНК и появление матричной шапочки говорят против такого объяснения. Отсутствие прямого ВКМ-опосредованного механизма, терминации концевых почек м.б. связано с увеличенными уровнями диффундирующих факторов, которые м. включать и TGF-β1. Два типа и ингибиции концевых почек необхоимы для создания открытой архитектуры системы протоков; один действует, когда концевая почка приближается к краю жировой подушки, другой, когда она оказывается влизи других протоков. Испускание ингибирующих сигналов соседними протоками или стромой м. объяснить последний и TGF-β1 м.б. здесь активнм агентом. Трудность возникает из-за того, что интерстициальный TGF-β обычно латентен и связан с α-2-макроглобулином, который также ингибирует его активность. Регрессия концевых почек по краям жировой подушки также мало удовлетворяет. Можно думать, что соединительнотканная оболочка (фасция) жировой подушки испускает сигналы. Имеющиеся данные указывают, что такие ингибирующие сигналы должны возникать во фронте концевой почки.

Рудименты молочных желез состоят из одиночного протока, который постепенно распространяется от соска во време первых 3-х недель после рождения. Начиная с 3-4 недель начинают фунеционировать оварии и скорость роста протков и ветвление увеличивается. В 5 недель протоки обычно заполняют примерно 2/3 жировой подушки сильно разветвленной системой с веточками второго и третьего порядка.

В отличие от развития аморфной гландулярной ткани, морфогенез протоков нуждается в динамической структуре, в которой постоянное добавление новых клеток совпадет с канализацией и продвижением вперед. В молочных железах концевые почки обеспечивают эту многостороннюю функцию, а растущие протоки предопределяются их присутствием. Когда протоки приближаются к краю жировой подушки или оказываются окружены другими протоками, рост ингибируется и концевые почки трансформируются в blunt-tipped (тупые сверху)структуры с небольшим количеством или без делещихся клеток. Обозначение "открытая" архитектура по отношению к железам небеременных мышей указывает на высокую степень регуляции локального роста, т.к. действием системных гормонов нельзя объяснить высоко локализованный поворот в направлении движений и ингибирование, необходимые для образования пространств.

Т.к. протоки являются морфологически дифференцированными, то они обладают существенной пролиферетивной способностью. При действии на них гормоном беременности, прогестероном, и проклактином индуцируется рост вторичных веточек, которые заполняют пространства между протокаим ацинарными структурами, называемыми лобулоальвеолами (lobuloalveoli), молоко-продуцирующими элементами желез, а также дополнительными боковыми веточками. Прекращение вскармливания вызывает поетерю секреторных альвеол в результате апоптоза и возвращение желез более или менее к предбеременному состоянию.

Морфогенез протоков

Финальные двухслойные структуры протоков молочных желез образуются в концевых почках, где сар клетки представлены монослоем стволовых клеток, которые дают контрактильный миоэпителий и лежащую поверх вторую большую популяцию клеток, предназначенную для выстилки просвета (рис. 2).

Рис.2 A. Продольный срез через концевую почку, показывающий слой клеток шапочки (звездочка) с выраженным субкапсулярным пространством, отделяющим ее от подлежащих pre-lumenal тел клеток (маленькая стрека). Фиброзная соединительная ткань (большие стрелки) появляется в концевых почках в точке сужения, где начинается проток. Ув. 280X. B. Бифуркация концевой почки. Видны два фокуса фибротической индукции (связаны пунктирной линией). Фиброзная ткань в расщепе (полая стрелка) распространяется частично и поверх новых концевых почек, по-видимому, направляет рост доли слева под углом. (Сплошная стрелка) фиброзная индукция на флангах.Ув. 250X.

Сар клетки мигрируют в последний компартмент, указывая тем самым, что они м. быть источником клеток предшественников для всей железы.

Е- и Р-кадгерин участвуют в становлении структуры эпителиальных слоев и трубок, концентрируюясь на латеральных мембранах сар клеток и клеток тела, соответственно. Анти-Е-кадгериновые антитела селективно дизорганизовывали просветные клетки, оставляя сар клетки интактныи. Анти-Р-кадгериновые антитела вызывают лишь частичные нарушения слоя сар клеток, указывая тем самым, что структура эта более сложная, чем лежащих над ними клеток. И другие механизмы участвуют в подразделении на компартменты. Несмотря на расположение на базальных мембранах сар клетки обладают слабой апикально-базальной поляностью, на это указывет обнаружение на их внутренней (псевдо-апикальной поверхности макромолекул базальных мемран, гиалуроната и ламинина. Гиалуронат сильный гидрофильный гликозаминогликан м. создавать пространства внутри развивающихся структур. Часто обнаруживаются "суб-капсулярные" пространства, разделяющие развивающиеся слои концевых почек, появление которых м. связать с присутствием гидрофильных молекул.

Рис.3 Иммунолокализация Е- и Р-кадгерина и эффекты cognate блокирования антител на организацию концевых почек. A. P-cadherin окрашивание оболочек клеток шапочки (головки стрелок) и небольшого числа клеток в просвете (стрелка). Ув. 400X. B. E-cadherin окрашивание оболочек клеток просветов (головки стрелок). Отсутствует окраска клеток шапочки (стрелка). Ув. 400X. C. Эффект анти-Р кадгерина на организацию клеток шапочки. Фокальная дизорганизация (стрелка). Ув. 400X. D. Эффект анти-Е кадгерина на организацию клеток просвета. Интактный слой клеток шапочки (стрелка). Ув.300X.

Формирование просвета

Образование просвета в протоках молочных желез явлется скорее внутренним свойством морфогенеза концевых почек. Тем неменее выясняется, что многие, если не сплошные, то полностью забиты люминальными клетками. Получены доказательства, что апоптоз участвует в редукции клеточной массы концевых почек, возможно обеспечивая образование просвета. Высокий уровень апоптоза выявляется в слоях клеток тела непосредственно рядом с просветом и совпадает с местом снижения уровня синтеза ДНК.

Расширение протока и преобразоание концевой почки в проток

Морфогнез и удлиннение протока происходят одновремено. Получены доказательства, что расширение зависит от давления, создаваемого внутри концевой почки. Это и отсутствие филоподиальных выростов из сар клеток в жировую строму характеризует структуру, которая выталкивается, а не тянется вперед. Давление исходит определенно от добавления новых клеток к телу концевой почки.

Преобразование концевой почки в дуктальную структуру одновременно вызывает ее движение вперед. Возможно эти механизмы включают контракцию филоподий миоэпителиальных клеток, которые покрывают фланги концевых почек перед реорентацией продольно вдоль противолежащих протоков, и ремоделирование ВКМ. Значительное ремоделироание ВКМ совпадает со сжатием и утолщением коллагена типа I и фланговых ВКМ покрытий, богатых сульфатированными гликозамионогликанами (SGAG). Индукция этих фиброзных покрытий создает пространство для добавления новых клеток и создает пояс, который должен создавать и направлять давление вперед, обеспечивая тем самым пассивное удлиннение.

ВКМ является сложным морфогеном молочных желез, а коллаген, в частности, важен для тубулогенеза. Эпителиальные клетки молочных желез утопают в коллагеновом геле и образуют узкие трубочки, которые видны и in vivo. С помощью связывания членов семейства интегринов рецепторов ВКМ коллаген м. стимулировать образование актин-цитоскелетных фокусов, которые способны изменять форму клеток молочных желез. β1- интегрин локализован на базальной поверхности эпителия концевых почек, а соответствующие антитела обратимо ингибируют развитие концевых почек in vivo и тубулогенез in vitro.

Бифуркация концевых почек

Точка будущего ветвления обнаруживает себя как расщепление дистальной поверхности концевой почки, которое содержит скопление коллагена типа I и SGAGs. ВКМ в расщепе зеркально отражает индукцию сходных фиброзных тканей с теми, что на флангах концевой почки. Очевидно, что сильно сконцентрированный синтез SGAG и коллагена инициирует расщепление и вызывает активное ветвление.

FGF рецептор с отсутствием киназной активности (Fgfr2-IIIb) строго ингибирует лобулоальвеолярный морфогенез, этот эффект зависит от FGF7. Это указывает на то, что FGF является регулятором, по крайней мере, одного типа ветвления в молочных железах.

В развивающихся легких FGF-7 исходит из мезенхимы и действует как хемоаттрактант, управляющий бифуркацией. Однако нет доказательств, что хемоаттракция играет роль в бифуркации или расширении концевых почек молочных желез. Легочная модельпредсказывает, что сигналы, генерируемые эпителием, должны влиять на экспрессию генов в соседней соединительной ткани. Когда протоки множатся выявляются многочисленные ДНК-синтезирующие клетки перед фронтом концевой почки на расстоянии 250µм. Чего не наблюдается перед нерастущими протоками или в пустой строме. Кроме того большие количества нетрофилов и других клеток белой крови агрегируют вокруг концов концевых почек, указывая на то, что хемоаттрактанты генерируются вблизи.

СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА И МОРФОГЕНЕЗ
Выявлена эндокринная основа роста протоков

Рост протоков

Установлено, что стромальные, а не эпителиальные рецепторы эстрогена стимулируют рост протоков. Рецепторы эстрогенов концентриуются в ядрах стромальных клеток вокруг концевых почек, но не в быстро делящихся сар клетках. паракринная роль эстрогена подтверждена и экспреиментами по тканевой рекомбинации. Нокаут эстрогенных рецепторов (ERKO) ведет у мышей к развитию лишь укороченных рудиментов протоков. Они растут на строме дикого типа. Но строма ERKO не поддерживает рост эпителия дикого типа.

EGF стимулирует рост концевых почек, он м. заменять собой эстроген. EGF-обеспечиваемый паракринный механизм действия эстрогена подтвержден при действии антител против EGF, блокирующи стимуляцию эстрогеном концевых почек. Сильное подавление роста протоков наблюдается при нокауте EGF рецепторов (EGFR) у мышей. Местом действия EGF являются стромальные клетки, которые генерируют вторичные маммотрофные сигналы, которые еще неизвестны. Показано, что EGFR не нужны для лобулоальвеолярного развития.

Основой действие гормона роста также сказывается на стромальных клетках. Гормон роста, а не пролактин, стимулирует синтез IGF-1 в молочных жеоезах. Важная роль IGF-1 в формировании концевых почек и удлинении протоков подтверждена с помощью целенаправленной делеции IGF-1, которая вызывает полную остановку роста протоков, которая м.б. преодолена внеклетчоным IGF-1, но не гормоном роста.

Лобулоальвеолярное развитие

Прогестрон и пролактин необходимы для секреторного развития. Целенаправленное разрушение гена пролактина и его рецептора (PRLR) выявляет место его действия. Редуцируется образование боковых веточек, но сохраняются концевые почки. Если PRLR-нуллевой эпителий трансплантировать на жировые подушки дикого типа, то развитие протоков осуществляется нормально, но при беременности лобулоальвеолярное развитие ингибируется.

Делеции прогестеронового рецептора (PRKO) вызывают редукцию лобулоальвеолярного развития, удлиннение же протоков осуществляется нормально Рецепторы прогесторона обязательны для субнабора стволовых клеток в луменальном компартменте протока, они маркируют, по-видимому, клон секреторных предшественников. При беременности негативные по прогестероновому рецептору клетки используются для лобулоальвеолярного развития и продукции молочного белка (β-казеина). Следовательно, прогестерон обычно действует путем передачи межэпителиальных паракринных сигналов.

Активины и ингибины, члены сверхсемейства TGF-β, участвуют в регуляции как лобулоальвеолярного развития, так и роста протокв. Целенаправленная делеция субъединицы ингибина βB устраняет три из димерных молекул и обусловливает задержку удлиннения протоков и альвеолярный морфогенез, ведущий к неспособности лактации. Передача сигналов от стромы к эпителию продемонстрирована и с помощью гетеролигичной рекомбинации ткани, в которой βB-дефицитный эпителий давал нормальные протоки и лобулоальвеолярное развитие на жировых подушках дикого типа.

Показано, что потеря любого из указанных выше факторов, не компенсируется другими, следовательно, их пути пересекаются и взаимодействуют.

ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ И ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА ПРОТОКОВ

Создание открытой гландулярной архитектуры зависит от активного подавления расширения концевой почки в границах жировой подушки, а также от предупреждения заполнения пространств между протоками с помощью образования боковых веточек.

Рис.4 TGF-β1 flux через образующуюся, латеральную почку с сильным TGF-β1 иммуноокрашиванием, ассоциированным с коллагеновыми воллокнами в перидуктальном ВКМ (большие стрелки). Латеральная почка (box) уже начала pushing (маленькая стрелка) на ВКМ, which lacks immuno-detectable TGF-β1. Резкая потеря окрашивания начинается на латеральном крае почки. Ув. 300X

Члены семейтва TGF-β быстро и необратимо ингибируют рост концевх почек. Экспрессия TGF-β1 во всей системе протоков указывает на его потенциальную роль в формировании паттерна железы. Эктопическая экспрессия активированного TGF-β1 существенно редуцирует образование латеральных веточек, тогда как альвеолярные структуры развиваются нормально. Экспрессия мутантного рецептолра концентрируется не в эпителии, а в перидуктальной строме и характеризуется драматическим увеличением латерального ветвления. Следовательно, TGF-β1 регулирует латеральное ветвление и местом его действия являются стромальные рецепторы, а не эпителий.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует ветвление эпителиальных трубок молочных желез in vitro и уровень мРНК HGF увеличивается вдвое у мутантов по TGF-β рецептору. Следовательно, хроническое ингибирование с помощью TGF-β1 ветвления обусловлено подавлением экспрессии РПА в околопротоковом ВКМ. Ветвление стимулируетс также матрикс-деградирующими ферментами, стромелизином-1 и IGF-1, активность которых не зависит от сигналов TGF-β1.

Роль TGF-β1 выявляется и в секреторном развитии, так, при избыточной экспрессии TGF-β1 в эпителии беременных подавляется лобулоальвеолярное развитие и продукция молока, тогда как ингибирование действия TGF-β в эпителии обусловливает преждевременную секреторную дифференцировку.

TGF-β1 и ВКМ

TGF-β1 локлаизуется в молочных железах в высокой концентрации в фиброзных элементах перидуктального ВКМ. Предполагается, что ВКМ является резервуаром TGF-β1, который функционирует обычно ингибируя латеральное ветвление. Механизм связи TGF-β1 с ВКМ возможно базируется на декорине.

Ингибирование роста концевых почек: роль TGF-β1?

Тот факт, что экзогенный TGF-β1 индуцирует фиброзную сар (шапочку) поверх кончика концевой почки позволяет предполагать. что высокие уровни естественно появившегося TGF-β1 во фронте концевой почки м. индуцировать ВКМ и ингибирование. Однако ингибирование синтеза ДНК и появление матричной шапочки говорят против такого объяснения. Отсутствие прямого ВКМ-опосредованного механизма, терминации концевых почек м.б. связано с увеличенными уровнями диффундирующих факторов, которые м. включать и TGF-β1.

Два типа и ингибиции концевых почек необхоимы для создания открытой архитектуры системы протоков; один действует, когда концевая почка приближается к краю жировой подушки, другой, когда она оказывается влизи других протоков. Испускание ингибирующих сигналов соседними протоками или стромой м. объяснить последний и TGF-β1 м.б. здесь активнм агентом. Трудность возникает из-за того, что интерстициальный TGF-β обычно латентен и связан с α-2-макроглобулином, который также ингибирует его активность.

Регрессия концевых почек по краям жировой подушки также мало удовлетворяет. Можно думать, что соединительнотканная оболочка (фасция) жировой подушки испускает сигналы. Имеющиеся данные указывают, что такие ингибирующие сигналы должны возникать во фронте концевой почки.

Postnatal mammary gland morphogenesis Gary B Silberstein Microsc. Res. & Techn. 2001. V. 52. N 2. P. 155-162