Endocytosis

Питательные вещества endocytosed для роста, а рецепторы для передачи сигналов. Для активной клетки область мембраны равная всей плазматической оболочке эндоцитозируется примено в течение часа и при статичных условиях скорость эндоцитоза должна соответствовать скорости экзоцитоза. С точки зрения энергетики образование эндоцитотического пузырька м. сравнить с образованием мембранной tether — цилиндрической трубки из мембраны, которая м.б. вытянута приложением ортогональных сил к небольшой области мембраннго бислоя (Рис. 1). Оба процесса связаны с отделением части мембраны от цитосклета и сильным искривлением мембраны. Следовательно, энергия необходимая для образования пузырька на единицу площади д.б. родственна с энергией, необходимой для вытягивания tether на единицу площади (Box 1).

(Рис.1.) | The energetics of endocytic vesicle formation are similar to those of tether formation.

Это предсказание подтверждается экспериментально для ситуаций, в которых скорость эндоцитоза подвергается важным изменениям: стимуляция секреции и митоз. У крыс basophilic leukaemia (RBL) клетки обладают повышенной стимулируемой секрецией, которая сопровождается снижением силы для образования tether и увеличением скорости эндоцитоза. Агенты, которые ингибируют секрецию ингибируют также снижение tether force и увеличение скорости эндоцитоза. При митозе имеется заметное увеличение мембранной tether force, которая праллельна со снижением скорости эндоцитоза. Добавление amphiphilic соединений, включая детергены, липиды и растворители, вызывает параллельное снижение tether force и рост величины эндоцитоза, т.е меняется натяжение мембраны (Box 1).

Process extension

Выпячивания, дающие ламеллоподии, зависят от сборки актиновых филамент за счет сложных процессов с вовлечением многих белковых компонент. Мембраны, которые содержат высоко заряженные inositol lipid phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P₂) особенно активны в создании хвостов актиновых филамент in vitro,поэтому было предположено, что PtdIns(4,5)P₂ катализирует сборку актина путем привлечения Cdc42 и Wiskott–Aldrich syndrome protein ( WASP).

Так как выпячивания на ведущем крае с помощью полимеризации актина связаны с движением бислоя от массы цитоплазмы в ламеллоподий и возможно прочь от spectrin–actin цитосклета , то резистентность к образованию выпячивания м.б. сходной с резистентностью к формированию tether. Неудивительно, что доля выпячиваний на ведущем крае 3T3 клеток увеличивается, а tether force снижается. Очевидно, что величина полимеризации актина непосредственно зависит от сопротивления мембран.

Эти Load-зависимые эффекты м. также обеспечивать простой механизм контроля морфологии клетки. Во время митозов клетки округлаются, это м.б. связано с падением величины экзоцитоза в метафазе и последующего увеличения в цитокинезе. В метафазе снижение величины экзоцитоза заметно увеличивает сопротивляемость плазматической мембраны. Это в свою очередь, по-видимому, ингибирует выпячивания мембран, вызывая округление. Когда клетка вступает в цитокинез и начинается секреция, то снижается сопротивляемость обратно до интерфазного уровня, что позволяет клетке снова давать выпячивания и она приобретает более нерегулярную форму.

Membrane resealing

Восстановление плазматических мембран после механического лизиса сохраняет жизнь клетке. С этим процессом коррелирует с движением пузырьков и слиянием мембран. Он нуждается также в секреции, поступлении Ca²⁺. Показано, что восстановление мембран коррелирует со стратическими tether силами. Это открывает возможность, что секреция необходима для снижения тензионного напряжения мембран. В самом деле снижения сопротивляемости плазматической мемьраны с помощью деполимеризации актинового цитоскелета цитохолазином достаточно для восстановления мембраны при этих условиях, не нужны ни секреция, ни поступление Ca²⁺.

Membrane–cytoskeleton adhesion

Бислой плазматических мембран клеток животных обычно конформируется под цитоскелет в многомерных быстро меняющихся морфологиях подобно динамичной в точности сопадающей перчатке. < Этот аспект прекрасно иллюстрируется поведением tethers. Если tethers (0.2–0.3 μm в диаметре) образуются в нейральных ростовых конусах, то они м. деградировать с боков на большом протяжении с большой скоростью (> 2 μms^-1)с низкой силой (7 pN). Так как 7 pN недостаточно, чтобы экстрагировать мембранные белки из двуслоя или разорвать большинство межбелковых мостиков, поэтому цитоскелет не проникает в tether^{22,
23}, любой вытягиваемый tether должен быстро (<100 ms) найти область диаметром в 0.2–0.3-μm на клеточной поверхности, которая свободна от membrane-protein–cytoskeleton сцепления. Более тoго, мембрана повторно связывается с цитоскелетом как только tether отодвигается.

Обычно, клетки имеют небольшие направленные кнаружи вдавления, которые, по-видимому, генерируются контракцией кортикального цитосклета. Когда мебранный бислой отделяется от цитоскелета, то обычно быстро выпячивается кнаружи, образуя полусферическое выпячивание или bleb (Рис. 2). Хотя обширное образование bleb признак гибели клетки, но blebs образуются также иногда вблизи ламеллоподий, борозды деления и в клетках, у которых отсутствует актин связывающий белок, filamin. Мембрана образует bleb, когда бислой не поддерживается адгезией с цитоскелетом в области в 1–2 μm². Если клетка остаются живой, то быстро собираются актиновые филаменты, чтобы соединиться с бислоем снова.

(Рис.2.) | Blebs lack cytoskeleton support.

Molecular basis of adhesion

Быстрая динамика адгезии мембрана-цитоскелет м.б. объяснена наличием многочисленных слабых мостиков между мембранными липидами и цитосклететными белками (Рис. 3). Помимо дискретных межклеточных и клетка-ВКМ (ECM) сайтов связывания имеется относительно немного сайтов прикрепления цитоскелета к мембранным белкам, особенно на non-adherent поверхности клеток в культуре. Для non-adherent частей мембраны наши подсчеты дают значения примерно 1μm между соединениями, макс. плотность контактов 0.2–0.3 μm. напротив имеется множество мест взаимодействий цитоскелета с липидами. Напр., PtdIns(4,5)P₂ присутствует в концентрации 1,000–10,000 молекул на μm² мембраны. Хотя индивидуальные связывающие взаимодействия между PtdIns(4,5)P₂ и цитоскелетными белками слабые (напр., pleckstrin homology (PH) domains имеет K_a's of 10⁴–10⁶ M^-1), высокая плотность взаимодействующих компонентов и их локализация в ldq[ измерениях вдоль поверхности мембраны гарантирует, что эффективная концентрация будет высокой и что бислой и цитоскелет слиты на вид непрерывно.

(Рис.3.) | Lipid-based cytoskeleton–membrane adhesion.

Мембранные липиды взаимодействуют со многими цитосклетными белками , некоторые взаимодействия охарактеризованы n vitro. PtdIns(4,5)P₂, по-видимому, важен для укрепления взаимодействий мембраны с цитосклетом. Blebs образуются сразу же, если PtdIns(4,5)P₂ секвестрируется с помощью высокого уровня химерных кострукций из green fluorescent protein и PH домена phospholipase Cδ или если PtdIns(4,5)P₂ гидролизуется с помощью PtdIns(4,5)P₂ 5-phosphatase. Самые сильные in vitro взаимодействия выявляются между фосфорилированными inositol липидами и катионными белковыми доменами, таким как PH домены, или с липид-связывающими доменами pipmodulins, таких как MARCKS. Многие белки конкурируют за доступ к цитоплазматической поверхности плазматической мембраны (Рис. 4); в мембранах (оболочках) эритроцитов плотность белков на области в 5-nm, соседствующей с поверхностью мембраны, насчитывается более 600 mg ml^-1.

(Рис.4.) | Competition for membrane-binding sites.

Изменения в уровне PtdIns(4,5)P₂ участвуют во многих физиологических изменениях в адгезии между мембраной и цитосклетом. В случае стимулирования секреции в поддерживающих клетках одним из ранних событий является гидролиз PtdIns(4,5)P₂. Снижение концентрации PtdIns(4,5)P₂ коррелирует во времени с быстрым и заметным снижением membrane–cytoskeleton адгезии, которое предшествует секреции. PtdIns(4,5)P₂ играет роль и в подвижности клеток. Многие гормональные стимулы, которые активируют подвижность клеток, активируют также phospholipase C, которая гидролизует PtdIns 4,5)P₂, и это коррелирует со снижением tether force. Многие белки, участвующие в динамике актина (напр., малые GTPases семейства Rac/Rho), модулируются PtdIns(4,5)P₂-связывающими белками и цитоскелетными белками, которые имеют PH домены и или ассоциируют с пузырьками или локализуются вблизи плазматической мембраны.

Physical controls of cellular processes

События секреции на одной стороне клетки м.б. компенсированы увеличением эндоцитоза на др. стороне, а блок секреции в митотзах м. автоматически вызывать снижение уровня эндоциоза. Итак, уровень адгезии мембраны с цитоскелетом м. контролировать общую форму клетки, воздействуя на ее подвижность на соотношение площади поверхности к объему. PtdIns(4,5)P₂, выполняет двойную функцию, стимулируя полимеризацию актина и связывание с белками, присоединенными к цитоскелету, которые имеют катионные домены. Мембранный потенциал (< K⁺ or Ca²⁺) или асимметрия бислоя (поверхностная концентрация < phosphatidyl serine) также м. контролировать или влиять на многочисленные клеточные функции.

Адгезия, по-видимому, является непрерывным свойством мембраны. Так как большинство PtdIns(4,5)P₂ адгезивных взаимодействий происходит на поверхности мембраны, размером с tether, эндоцитотический пузырек или филоподий, то они выглядят как продолжение (continuum) как противопоставление индивидуальным сайтам связывания.

Исходя из молекулярных основ адгезии цитоплазматическая поверхность пдазматической мембраны очень насыщена и неясно как контролируются уровень PtdIns(4,5)P₂ и сродство многочисленных PtdIns(4,5)P₂-связывающих белков. Как синтез и оборот PtdIns(4,5)P₂ связан с сопротивляемостью мембраны?

Cell control by membrane-cytoskeleton adhesion