Histone regulation

Гистоны H2A и H2B образуют стержневую структуру
NUCLEOSOMES (Рис.2a). Они модифицируются с помощью моноубиквитина или короткой убиквитиновой цепочки (Рис.2b). В клетках млекопитающих 10% H2A и 1% of H2B являются ubiquitylated, но у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae , H2B является в большинстве своем убиквитилированным гистоном. Monoubiquitylation играет важную роль у дрожжей, тк. у мутантов с отсутствием сайта ubiquitylation в Р2В не происходит споруляции. Следовательно, monoubiquitylation необходима для мейоза. Эти клетки растут медленнее. Мутаеты с дефектным Rad6
UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (E2), который катализирует ubiquitylation H2A и H2B. Мутанты rad6 дрожжей также не м. спорулировать, а у нокаутных мышей с отсутствие гомолога Rad6 (HR6B) нарушен сперматогенез, сопровождающийся бесплодием самцов.

(Рис.2.) | Monoubiquitylation of histones.

Др. гистоны также модифицирцуются ubiquitinом. Гистон H1 является 'linker' histone, который соединяется с ДНК, расположенной между двумя нуклеосомами (Рис. 2c). Он monoubiquitylated у эмбрионов Drosophila melanogaster. Эта модификация зависит от компонента общей транскрипционной machinery,
TAF250 (субъединицы
TFIID , который обладает ubiquitin conjugation активностью, специфичной для H1 in vitro. Мутации TAF250, которые ингибируют его активность ubiquitylation вызывают дефекты транскрипционной активации у эмбиоов дрозофилы, iуказывая тем самым, что TAF250-зависимая H1 ubiquitylation м. контролировать экспрессию генов. TAF250 ,по-видимому, необычный компонент ubiquitylation machinery. В целом, каскад из трех энзимов участвует в ubiquitylation: E1 активирует ubiquitin ATP-зависимым способом; E2 принимает активированный убиквитин от E1 и с помощью E3 (ubiquitin ligase), переносит убиквитин на специфический субстрат. TAF250 несет домены, которые гомологичны E1s и E2s, и , по-видимому, имеют обе эти активности , слитые в одной полипептидной цепи. Этот необычный тип ubiquitylation активности м. б. единственным путем таргетинга гистонов для monoubiquitylation скорее, чем модификация мульти-убиквитиновых цепей.

Endocytosis

Monoubiquitylation регулирует также активность белков, расположенных на плазматической мембране (оболочке). Многие белки плазматической оболочки интернализуются с помощью эндоцитотического пути. У Saccharomyces cerevisiae большинство таких белков нуждается в ubiquitylation своих цитоплазматических доменов чтобы быть интернализованными. В клетках млекопитающих некоторые ионные каналы и сигнал-трансдуцирующие рецепторы, которые подвергаются регулируемой интернализации, ubiquitylated в ответ на внеклеточные сигналы, а ubiquitylation регулирует их эндоцитотический транспорт. Большинство белков, которые ubiquitylated в плазматической мембране являются мишенями для деградации в
LYSOSOME (за некоторыми исключениями). У дрожжей и в клетках млекопитающих monoubiquitylation достаточно для запуска интернализации в первичные эндоцитотические пузырьки. Для некоторыех дрожжевых аминокислотных permeases, di-ubiquitin цепочки сцепленные через Lys63 далее усиливают базовую скорость интернализации. Информация об интернализации находится в самом убиквитиновом полипептиде, т.к. он м. стимулировать интернализацию, когда он слит in-frame с рецепторами, у которых отсутствуют лизиновые сайты убиквитиляции или др. сигналы интернализации, или с гетерологичными белками, которые обычно не интернализуются (Рис. 3a). Интернализация контролируется с помощью слитой бииквитиновой части скорее, чем пост-трансляционно конъюгированный убиквитин, т.к. слитый убиквитин, у которого отсутствуют все его лизиновые остатки, и, следовательно, он не м. конъюгировать с дальнейшими убиквитиновыми молекулами, также функционирует, способствуя интернализации химерных белков.

(Рис.3.) | Roles of monoubiquitin during internalization of plasma membrane proteins into the endocytic pathway.

Monoubiquitin необходим не только как интрнализационный сигнал для эндоцитотического груза; он м. также контролироваить активность endocytic machinery.
EPS15 белок, который взаимодействует с
CLATHRIN -based эндоцитотической кухней, становится monoubiquitylated после стимуляции клеток эпидермальным фактором роста, лиганд которого усиливает активность эндоцитотической machinery. Ubiquitylation является обратимым процессом благодаря существованию
DE-UBIQUITYLATING ENZYMES . Fat facets является одним из таких de-ubiquitylating энзимов. Даже мутантны Drosophila fat facets не развиваются нормально и имеют слишком много клеток в фасетках. Выявлено взаимодействие Fat facets с epsin, эндоцитотическим белком , который взаимодействует с Eps15, это также указывает на то, что ubiquitylation м. регулировать активность эндоцитотической machinery. Интернализация
GROWTH HORMONE RECEPTOR также нуждается в ubiquitylation machinery, хотя ubiquitylation самих рецепторов не обязательна.

Virus budding

Покрытые оболочкой вирусы отпочковываются из плазматической мембраны инфицированной клетки в противоположном направлении по сравнению с эндоцитозом, и monoubiquitin является существенной частью этого процесса (Рис.4 ).
GAG
POLYPROTEIN , общий всем ретровирусам, который ассоциирует с цитоплазматической стороной плазматической мембраны, необходим и достаточен для выщипывания связанных с мембранами частиц во время отпочковывания. Внутри Gag, имеются небольшие последовательности, наз. late (L) доменом, который существенено для отпочковывания и высвобождения частиц. В большинстве случаев L домен несет богатые пролином последовательности, PPXY и/или P(T/S)AP, и этот домен м. действовать как мотив для взаимодействия с
UBIQUITIN PROTEIN LIGASE (E3) , известной как Nedd4. Gag сам по себе monoubiquitylated и ubiquitylation зависит от его L домена. Ubiquitylation Gag важна для его функции при отпочковывании вируса, т.к. снижение уровня внутриклеточного убиквитина ингибирует отпочковываение. Потребность в убиквитине отпочковывающимся вирусам м.б. всеобщей, т.к. и др.оболочечные вирусы (vesicular stomatitis virus и Ebola) несут последовательности PPXY в матричных белках, которые, по-видимому, функционируют аналогично Gag L домену. По крайней меере, в одном случае очевидно. что богатый пролином L домен в Gag, который обеспечивает ubiquitylation, м.б. замещен последовательностями, которые сходны с tyrosine-based эндоцитотическим сигналов. Эти последовательности, YXXL, обнаруживаемые в L домене equine infectious anemia virus связываются с AP2 (adaptor protein 2) комплексом. Эти наблюдения уазывают на то. что или убиквитин или tyrosine-based internalization сигналы м.б. способны использовать endocytic machinery клетки хозяина для обеспечения отпочковывания вирусов.

(Рис.4.) | Monoubiquitylation of Gag is required for retrovirus budding.

Monoubiquitin versus multi-ubiquitin signals

Mooubiquitylated белки являются стабильными или деградируются лизосомами. Напр., monoubiquitylated гистоны являются стабильными белками, а ubiquitylated, интернализованные белки плпзматической мембрны дрожжей деградируют тоько после транспорта в лизовомо-подобные вакуоли.Мутантны дрожжей, дефектные по регуляторной или протеолитической субъединице протеосом, включая известную ubiquitin-связывающую субъединицу Rpn10, не оказывают влияния на интернализацию или деградацию белков плазматической мембраны. Хотя ингибиторы протеосом и репрессируют отпочковывание ретровирусов, этот эффект обусловлен низким уровнем убиквитина, индуцируемым ингибиторами, а не прямым плиянием протеосом на отпочковывание.

Не смотря на различные мишени для моно- или напротив мульти-убиквитина имеются перекрывающиеся области молекулы убиквитина, которые необходимы для этих функций. Lys48-связанный tetraubiquitin — самая маленькая мульти-убиквитиновая цепь, распознаваемая протеосомами - имеет повторяющиеся гидрофобные участки на своей поверхности, которые состоят из Leu8, Ile44 и Val70 (Рис.5). Такой участок необходим для связывания протеосомами и для последующей деградации субстрата. Неожиданно,
SCANNING ALANINE MUTAGENESIS receptor–ubiquitin химер показал, что тот же участок необходим для эндоцитоза: замена Ile44 сильно уменьшала интернализацию химерного белка, а замена Val70 или Leu8 имеет меньшее, но все еще заметное влияние на интерналтзацию. Более того, др. участок на поверхности убиквитина в окружении Phe4 необходим только для эндоцитоза (Рис.5).Хотя Phe4 экспозирован и в tetraubiquitin цепи, Phe4 мутации не затрагивают связывания протеосом или деградацию.

(Рис.5.) | Three-dimensional structure of ubiquitin.

Как Leu8/Ile44/Val70 участок, важный как для протеосомами обусловленной деградации, так и эндоцитоза, связывается с разными мишенями - 19S субъединицей протеосом и the endocytic machinery? При связывании с протосомой участок Leu8/Ile44/Val70 действует как multivalent-binding поверхность на тетраубиквитине. Очевидно, что он действует иначе на моноубиквитине (см structure of monoubiquitin online), чтобы связывать белки во время эндоцитоза, вообще как часть расширенного белок-связывающего сайта с Phe4 участком.

A reversible regulatory modification

Ubiquitin-like proteins (UBLs) являются семейством белков, отдаленно родственных по аминокислотным последовательностям, но обладающией той же структурой складок. Они также ковалентно конъюгируют с субстратом с помощью изопептидных мостиков на своем С-конце. (Некоторые белки, несущие UBL домен, не конюгирруют с др. белками, но их UBL домен м. направлять их к взаимодействию с проеосомами.) В этом семействе убиквитин, по-видимому, единственный способный к само-конъюгации.

Лучше всего охарактеризован UBLs SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier 1), Rub1 (related to ubiquitin; известный также как Nedd8) и Apg12. Каждый модифицирует один или несколько субстратов. Rub1 модифицирует членов семейства
CULLIN , которые являются субъединицами
SCF UBIQUITIN LIGASES и rubylation — конъюгация белков с Rub1 — необходима для максимальной активности SCF ligase. Apg12 является a UBL, чья конъюгация с Apg5 необходима для аутофагии, формирования и слияния связанных с мембранами пузырьков с лизосомами (см. page 211). Apg8 и его гомолог у млекопитающих,
GATE-16 являются еще одними UBLs, которые необходимы для аутофагии. Apg8 конъюгирует своим С-концевым глицином с phosphatidylethanolamine с помощью энзима, который напоминает E1 и E2, и эта модификация регулирует ассоциацию Apg8 с мембраной.

UBL SUMO-1 конъ.гирует с многими типами субстратов (по крайней мере с 20) (page 202). SUMO-1 конъюгирует с теми же самыми лизинами, которые модифицируются убиквитином, по-видимому, негатисно регулируя мульти-убикситиляцию и предупреждая деградацию.

Monoubiquitin, подобно UBLs, по-видимому, вызывает обратимые модификации, чтобы регулировать функцию белка. Следовательно, характер убиквитиновой модификации является критическим для судьбы белка. Белки м.б. monoubiquitylated по одному или нескольким лизиновым остаткам или м.б. модифицированы multi-ubiquitin цепочками, связанными через Lys48, Lys63 или др. ubiquitin лизины

(Рис.1.)

Специализированная ubiquitylation machinery, такая как необычный ubac (ubiquitin-activating/conjugating)домен, который, по-видимому, действует как сливающие E1–E2 в TAF250, м. катализировать некоторые реакции monoubiquitylation. Некоторые комбинации стандартных ubiquitylation энзимов — E1s, E2s и E3s — по-видимому, участвуют как в monoubiquitylation, так и формировании multi-ubiquitin цепочек. Напр., Rsp5 E3 энзим необходим не только для модифицирования белков плазматической мембраны с помощью monoubiquitin или di-ubiquitin цепочек, которые соединены через Lys63, но катилизирует multi-ubiquitylation РНК полимеразы II. Следовательно, имеются позитивные и негативные регуляторы для сборки убиквитиновых цепочек в клетке (Табл.1). Некоторые типы белков, которые регулируют длину убиквитиновых цепочек, недавно идентифицировны. Некоторые ubiquitylation реакции нуждаеются в присутствии позитивного регулятора, известного как E4, чтобы перейти от monoubiquitin или короткой убиквитиновой цепочки к длинным мульти-убиквитиновым цепям. Напротив, некоторые механизмы негативно регулируют образование мульти-убиквитиновой цепи. Во-первых, субнабор многих de-ubiquitylating энзимов м. приспосабливать убиквитиновые цепи к специфическому субстрату в ответ на присутствующий monoubiquitin сигнал (возможно, что Fat facets действует таким образом). Во-вторых, негативный регулятор образования мульти-убиквитиновой цепи, сходный с Rad23 белком, который, по-видимому, защищает субстрат от протесомной деградации, м. способствовать monoubiquitylation. Негативный регулятор сборки убиквитиновой цепи ограничивает конъюгацию одиночным убиквитином, защищает тем самым субстрат от протеосом.

(Табл.1) | Positive и negative regulators of ubiquitin chain assembly

Mechanisms of regulation

Ubiquitin м. менять конформацию или олигомерное состояние белка. Большинство клеточных убиквитинов транслируется как fusions to ribosomal proteins. Такой ubiquitin действует как
CHAPERONE облегчая складывание вновь синтезированного белка перед его расщеплением, указывая тем самым, что моноубиквитин м. влиять локально на трехмерную структуру субстрата. В активно транскрибируемом хроматине ubiquitylated H2A и H2B многочисленны, а H1 или уменьшен или его интеграция с нуклеосомами изменена. Итак, убиквитин м. влиять на структуру гистонов, контролируя как гистоны взаимодействуют др. с др. или с ДНК, и это м. менять локальную организацию хроматина, делая промоторную ДНК более или менее доступной транскрипционной кухне (machinery). Вместо этого или в дополнение убиквитин м. рекрутировать или подавлять связывание регуляторных белков , которые взаимодействуют с гистонами для регуляции транскрипции.

Возможно, что убиквитин взаимодействует с липидами, чтобы регулировать локализацию белков в субдоменах плазматической мембраны, компетентных к отпочковыванию. или чтобы регулировать образование или отделение отпочковывающихся пузырьков. Ubiquitin-зависимое отпочковывание м. также использовать взаимодействие убиквитина со специфическими monoubiquitin-связывающими белками (Рис. 3b). Взаимодействие между monoubiquitin и определенным белком м.б. специфицировано с помощью локализации ubiquitylated субстрата. В некоторых случаях детерминанты от субстрата (включая и те, что возникают в результате др. пост-трансляционных модификаций, таких как фосфорилирование и ацетилирование) м. вносить свой вклад во возаимодействие. Напр., белки плазматической мембраны и белки мембран-ассоциированного Gag м. формировать мультимеры, которые делают возможным образование уникальной связывающей поверхности, состоящей из нековалентно сцепленных, но тесно ассоциированных убиквитиновых мономеров. Сходным образом, monoubiquitin, соединенный с различными гистонами в нуклеосоме м. взаимодействовать, чтобы сформировать новый сайт связывания. Такая модель могла бы объяснить, как моноубиквитин действует в качестве сигнала в море убиквитинов, которые присутствуют в клетке.

М О Н О У Б И К В И Т И Н И Л Я Ц И Я