Митохондрии являются не только местом оксидативного фосфорилирования, носителями комплексов респираторной цепи на внутренней мембране, но и местом цикла лимонной кислоты (Krebs) в матриксе и учствуют в важных ступенях цикла мочевины, биосинтеза гена и метаболизма жирных кислот. Эти функции нуждаются в эффективном переносе в и из цитозоля. Наиболее многочисленным белком в наружной митохондиальной мембране является porin, который образует большие поры для различных метаболитов. Митохондриальная внутренняя мембрана д. поддерживать электрохимический градиент, следовательно, транспорт метаболитов через эту мембрану четко контролируется, чтобы предупредить утечку ионов. Внутренняя мембрана содержит большое семейтво белков носителей, которые ответственны за специфическую транслокацию метаболитов.

Митохондриальные препротеины преимущественно, хотя и не исключительно, импортируются посттрансляционно. Большинство растворимых белков матрикса и некоторые белки внутренних мембран и межмембранного пространства синтезируются с N-терминальными расширениями в 10–80 аминокислотных остатков, заканчивающихся presequence, которые протеолитически удаляются после импорта. Др. препротеины, однако, синтезируются без отщепляющихся расширений и содержат направляющие сигналы в зрелом белке. Эта группа включает все белки наружной мембраны и некоторые белки межмембранного пространства и большинство белков внутренней мембраны. Хотя эти белки часто довобоно гидрофобны они спосоны транспортироваться через aqueous цитозоль; препротеины, по-видимому. находятся в ином состоянии сворачивания, чем зрелые белки и защищены поэтому от агрегации MOLECULAR CHAPERONES . Оба типа сигнальных последовательностей распознаются рецептрами. которые ассоциированы с транслоказами наружной митохорндриальной мембраны (translocase of the outer mitochondrial membrane, TOM ) (Рис. 1). Препротеины не м.б. транслоцированы через митохондриальные мембраны в сложенной конформации; они д.б., по крайней мере частично, развернуты, чтобы пройти через каналы импорта.

(Рис.1.) | The two main pathways of protein import into mitochondria.

После прохождения через наружную мембрану сквозь general import pore ( GIP ) of TOM, импортируемые препротеинs направляются к одной из двух транслоказ translocases of the inner membrane, или TIM (Рис. 1). Все presequence-несущие препротеины, включая многочисленные матричные белки, направляются к TIM23 комплексу, который образует канал через мембрану. Необходим мембранный потенциал (Δψ) поперек внутренней мембраны для переноса presequence сквозь мембрану. Митохондриальный хитшоковый белок HEAT-SHOCK PROTEIN 70 ( mtHsp70) формирует центральную часть АТФ-зависимого молекулярного мотора, который управляет импортом препротеинов в матрикс. Мitochondrial processing peptidase ( MPP) затем расщепляет presequence, и белок складывается в свою активную форму - процесс, который м. происходить при поддержке helpers складывания, таких как Hsp70, CHAPERONIN Hsp60 или peptidyl-prolyl cis/trans изомераза. Гидрофобные белки внутренней мембраны с внутренними направляющими сигналами , такие как переносчики метаболитов, направляются с помощью т. наз. малых Tim белков ко второй TIM translocase, называемой TIM22 комплексом, который вставляет их во внутреннюю мембрану Δψ-зависимым способом.

Mitochondrial targeting signals

Классическим направляющим в митохондрии сигналом являются N-терминальные presequence, которые функционируют как направляющие в матрикс сигналы. Присоединенные к немитохондриальным белкам presequences м. специфически направлять passenger белок через митохондриальные мембраны в матрикс. Presequences содержат множество положительно заряженных, гидрофобных и гидроксилированных аминокислотных остатков. Характерным свойством presequences является их высокая склонность формировать amphipathic α-спираль, которая представлена одной позитивно заряженной поверхностью и одной гидрофобной поверхностью (Табл. 1). Было предположено, что позитивные заряды на presequences являются критическими для распознавания импорт рецепторами и что amphipathic свойства способствуют проникновению в наружную мембрану. Однако, было установлено, что разные поверхности presequence м. последовательно распознаваться разными рецепторными белками TOM machinery: гидрофобная сторона с помощью Tom20, а позитивно заряженная с помощью Tom22. Установлено, что гидрофобные остатки presequence необходимы для взаимодействия со связывающей бороздой Tom20. более того, суммарный положительный заряд presequences также важен для мембранного потенциала Δψ поперек внутренней мембраны для осуществления его электрофоретического эффекта в отношении presequences.

(Табл.1) | Mitochondrial targeting и sorting elements

Если presequences большинства матричных белков отщепляются после импорта, то немногие матричные белки, напр., chaperonin 10 ( Hsp10), синтезируются с N-теминальными presequence, которые остаются постоянной частью белка. Более того, один матричный белок, DNA helicase Hmi1, имеет presequence-подобный направляющий сигнал на своем С-конце. В противоположность обычной c N- к С-концу транслокации препротеинов. несущих presequence, этот препротеин, по-видимому, транслоцируется в обратной ориентации.

Presequence-подобные сигналы используются также некоторыми препротеинами, прденазначенными для трех др. митохондриальных субкомпартментов — наружной, внутренней мембраны и пространства между ними ( Table 1). В этом случае позитивно заряженные последовательности дополняются более гидрофoбными сортинг-сигналами. которые ведут к специфическому аресту preproteins в наружной или внутренней мембране, соотв.(stop-transfer signal). Эти сортинг-сигналы не просто арестовывают в липидной фазе мембран благодаря их гидрофобной природе , но, по-видимому, специфически распознаются компонентами TOM комплекса или TIM23 комплексом прежде, чем они высвободятся из липидной мембраны. Однако, неясно, какие TOM или TIM компоненты непосредственно отвечают за распознавание сортинг-сигнала. Во-первых, некоторые белки наружных мембран содержат не отщепляющиеся presequence, имеющие длинные гидрофобные участки. Эти препротеинв направлются в митохондрии с помощью presequence и застревают в наружной мембране благодаря гидрофобному участку. Во-вторых, некоторые белки внутренней мембраны несут отщепляющиеся presequence и гидрофобные закрепляющие в мембранах последовательнгости в зрелой части. В третьих, двухсоставные presequence используются для сортироваки некоторых белков во внутреннюю мембрану (напр., cytochrome c₁) или в межмембранное пространство (напр., cytochrome b₂). В этом случае позитивно заряженные направляющие в матрикс последовательности сопровождаются сортинг-последовательностями, родственными сигналам секреторных белков бактерий и эукариот, включая гидрофобные участки, которым предшествуют немногие положительно заряженные остатки. Эти сортинг последовательности отщепляются на наружной поверхности внутренней мембраны с помощью гетеродимерной inner membrane peptidase ( Imp1– Imp2). Наконец некоторые белки внутренней мембраны содержат внутренний направляющий сигнал, который соответствует трансмембранному сегменту, а позитивно заряженный сегмент находится непосредственно за ним. Этот внутренний сигнал , очевидно, формирует hairpin–loop структуру во внутренней мембране. Некоторые из сортинг сигналов м. импортироваться в матрикс и затем перенаправляться во внутреннюю мембрану, напоминая экспорт белков у прокариот ('conservative sorting').

Носители метаболитов внутренней мембраны не содержат отщепляющихся presequence, но имеют от 3 до 6 внутренних направлющих сегментов, распределенных по всей длине препротеина ( Table 1). В противоположность отщепляющимся presequences, эти внутренние сигналы не обязательно содержат заряженные аминокислотные остатки. Каждый направляющий сегмент примерно в десять аминокислот м. функционировать сам и распознается рецепторами митохондриальной поверхности, хотя и с низкой эффективностью. Сигналы, по-видимому, функционируют кооперативно, используется несколько рецепторов для одного препротеина. Др. мембранные белки, такие как компоненты транслоказы внутренней мембраны, также содержат несколько направлющих и сортинг сигналов, включая гидрофобные сегменты и позитивно заряженные петли.

Translocase of the outer membrane

Танслоказная machinery наружной мембрнаы состоит из трех рецепторных белков, Tom20, Tom22 и Tom70, канал формирующего белка Tom40 и трех малых Tom белков ( Tom5, Tom6 и Tom7)

(Box.1) Box 1 | The translocase of the outer mitochondrial membrane

. Tom22, Tom40 и три малых Tom белка образуют стабильный TOM стержневой комплекс в 400 kDa, названный GIP COMPLEX .

Препротеины с presequence сначала распознаются Tom20, а затем Tom22. Гидрофобные препротеины с несколькими внутренними сигналами, такие как белки переносчики, распознаются димерным Tom70 и в меньшей степени также и Tom20. Несколько Tom70 димеров одновременно связываются с одним carrier препротеином, возможно для предупреждения агрегации гидрофобных препротеинов. Цитозольный домен Tom22 не только функционирует как рецептор препротеинов, и также действует как docking point комплекса GIP, с которым м. ассоциировать периферические рецепторы Tom20 и Tom70. Предполагается, что препротеины первоначально связываются с Tom20 или Tom70, а затем передаются Tom22 благодаря прямому контакту между цитозольными домененами рецепторов.

Tom5 необходим для переноса препротеинов от Tom22 к Tom40 каналу. Фактически, Tom5 м. рассматривать как рецептор третьего уровня, действующий после Tom20 и Tom22. Некоторые препротеины, предназначенные для межмембранного пространства, такие как предшественники малых Tim белков, не нуждаются в любом их трех рецепторов с большим цитозольным доменом, но зависят только от Tom5 и Tom40 для своего прохождения сквозь наружную мембрану.

Лишь Tom40 крайне необходим для образования каналов поперек наружной мембраны. Tom40, единственный Tom белок, который существенен для жизнеспособности клетки при всех условиях роста, он присутсвует примерно в 6 копиях на GIP комплекс. Существующая модель предполагает, что одиночный канал образуется двумя Tom40 молекулами и что весь GIP комплекс содержит 2-3 канала. Каждый канал имеет пору диаметром ~22 Å, размер которой достаточен для прохождения двух α-спиральных сегментов. При выходе из канала белки, содержащие presequence, связываются с доменом Tom22 в межмембранном пространстве прежде чем они будут направлены к TIM23 транслоказе внутренней оболочки.

Tom40 сам также имеет специфический сайт для связывания presequences непосредственно в канале. Препротеин, содержащий presequence, т.обр., успешно распознается, по крайней мере, пятью сайтами, пересекая наружную мембрану — Tom20, цитозольный домен Tom22, Tom5, Tom40 и домен Tom22 в межмембранном пространстве (Box.1) Т.как некоторые из этих Tom белков содержат негативно заряженные участки, то предполагается, что положительно заряженные presequences распознаются с помощью ионных сил (acid chain hypothesis). Однако, др. нековалентные силы, включая гидрофобные взаимодействия, также важны для взаимодействий между препротеинами, содержащими presequence и Tom белками, как это продемонстрировано для Tom20 и Tom40. Предполагается, что Tom белки (и некоторые Tim белки) создают цепочку связывающих сайтов, включая различные типы нековалентных взаимодействий, чтобы направлять препротеины, содержащие presequence, в митохондрии (binding chain hypothesis).

Tom6 и Tom7 модулируют динамику TOM machinery частично в антогонистической манере. Tom6 способствует соединению Tom22 с Tom40. Мембранные якорные последовательности Tom22 необходимы для поддержания стабильной ассоциации между индивидуальными Tom40 каналами. У мутнтных дрожжей с отсутствием Tom6 или Tom22, комплекс GIP дестабилизирован и диссоциирован на 100-kDa оновные субъединицы, содержащие по Tom40 димеру. Tom7 поддерживает диссоциацию транслоказы и тем самым делает возможным латеральное высвобожддение препротеинов. Мутантные митохондрии без Tom7 лишь слегка аномальны по транслокации препротоинов, содержащих presequence, через наружную мембрану, но сильнее подавлены в отношении сортировки белков, таких как порин в наружной мембране. Предшественник порина направляется посредством рецепторов Tom20 и Tom22 в Tom40 канал. Tom7, по-видимому, поддерживает открытие транслоказы для высвобождения белка в липидную фазу мембраны.

The inner-membrane presequence translocase

После проведения через наружную мембрнау с помощью цепочки Tom белков, препротеины с presequencesвзаимодействуют с TIM23 комплексом внутренней мембраны (Рис. 2). В отличие от TOM канала, TIM каналы нуждаются в тонкой регуляции открытия и в адаптации к транзиту полипептидной цепи так, чтобы избежать истечениея ионов. В противном случае электрохимический градиент, а значит и способность к окислительному фосфорилированию будут разрушены.

(Рис.2.) | The translocase of the inner mitochondrial membrane for presequence-carrying preproteins.

Транслоказы внутренней и наружной мембранT формируют независимые структурные и функциональне единицы. Если наружная мембрана разрушена, то препротеины м. прямо транслоцироваться через внутреннюю мембрану без помощи TOM machinery. Лишь наличие препротеина в момент транзита одновременно арестовывается в обоих транслоказах two-membrane-spanning способом, поддерживая стабильнвй контакт между TOM и TIM23 комплексами. Идентифицирован суперкомплекс TOM–TIM23–препротеин ~600 kDa. Нельзя исключить, однако. потери контакта междуTOM и TIM23 комплексами in vivo в отсуствие препротеинов.

Стержень TIM23 транслоказы формируется 90-kDa комплексом, состоящим из двух важных белков, Tim23 и Tim17 (Рис. 2). Оба белка содержат интегрированный в мембрану домен с несколькими (возможно 4) трансмембрнными сегментами. Tim23 кроме того обладает N- терминальным доменом в межмембранном пространстве. Этот конец проникает даже в наружную мембрану, связывая обе митохондриальные мембраны; однако, он не контактирует с TOM machinery. Хотя мембранные домены Tim23 и Tim17 гомологичны, они не м. замещать др. др. ; каждый белок необходим для жизнеспособности клетки. Домен Tim23 в межмембранном пространстве, по-видимому, функционирует как связывающий сайт для presequences, а мембранные домены Tim23 и Tim17 очевидно образуют каналы для транслокации препротеинов.

Транслокация белка через внутреннюю мембрану нуждается в двух движущих силах: мембранном потенциале (Δψ) поперек вунутренней мембраны и в АТФ-зависимом моторе для импорта. Транслокация presequence в и через внутреннюю мембрану сильно зависит от наличия Δψ, который является негативным на матричной стороне. Две задачи возложены на Δψ — электрофоретический эффект на положительно заряженные presequences и активация Tim23.

АТФ-зависимый импорт-мотор, состоящий mtHsp70, субъединицы транслоказы Tim44 и co-chaperone Mge1, играет наиболее важную роль в транслокации зрелой части препротеина в матрикс. Все 3 компонента существенны для жизнеспосоности. mtHsp70 связывает сегменты расширений препротеинов, как только они показываются на матричной стороне TIM канала, и усиливается в результате этого связывания и гидролизует АТФ. Tim44 функционирует как член мембранного якоря для ATPase домена mtHsp70 непосредственно в месте выхода импорт-канала, тогда как пептид связывающий домен mtHsp70 взаимодействует с препротеином во время транзита. Mge1 является фактором обмена нуклеотидов, гомологичным GrpE бактерий, и обеспечивает реакционный цикл mtHsp70. Имеются 2 модели действия mtHsp70

Box 2 | Proposed roles of mitochondrial Hsp70 in protein import.

Согласно первой модели, mtHsp70 пассивно отлавливает полипептидную цепь, когда та показывается на матричной стороне и это вносит направленность в Броуновское движение цепи в транслоказе. По другой модели, с Tim44 связанный mtHsp70 подвергается конформационному изменениюundergoes conformational changes и протягивает цепь через транслокон. Установлено. что фактически оба механизма м. кооперировать при импорте белка. Для рыхло сложенных препротеинов ловчий механизм м.б. достаточным, но для препротеинов с плотно сложенными доменами м. потребоваться дополнительное протягивающее действие mtHsp70. Сложенные белковые домены подвергаются спонтанным флюктуациям, которые м. вести к полному или частичному расправлению. Пассивное проведение с помощью mtHsp70 будет достаточным для импорта препротеинов. когда их спонтанное расправление закончено. Конформационное изменение mtHsp70 м. способствовать обузданию малых флюктуаций (partial unfolding) упакованных доменов и предоставлять дополнительную энергию для преодоления барьера активации, необходимого для завершения расправления.

Неожиданно TOM–TIM–preprotein суперкомплекс оказался очень стабильным, но не содержал ни mtHsp70, ни Tim44, указывая тем самым на то, что препротеин м. стабильно удерживаться в мипорт-канале, не будучи отловленным mtHsp70. Канал TIM23, по-видимому, не является пассивной порой для диффузии препротеинов, но активно взаимодействует с и удерживает препротеин. Итак, тянущие силы, генерируемые mtHsp70, очевидно необходимы для преодоления взаимодействий препротеина с порой.

Более того, mtHsp70 очевидно функционирует также в импорте белка, регулируя открытие TIM23 канала (Box 2). В отсутствие mtHsp70, канал закрыт и препротеин не движется ни взад ни в перед. Присутствие mtHsp70 способствует открытию канала возможно с помощью Tim44-независимого влияния mtHsp70 свойства канала. Затем препротеин свободно движется и прямо связывается с mtHsp70, чтобы протянуть и отловить препротеин (Box 2).

Import of hydrophobic carrier proteins

Тогда как TIM23 комплекс преимущественно используется гидрофобными матричными белками, несущими presequence, то внутренние мембранные белки с ограниченным количеством трансмембранных сегментов, такие как переносчики метаболитов, обычно импортируются с помощью второй транслоказы внутренних мембран, TIM22 комплексом (Рис. 3). Фактически, большинство компонентов import machinery разные для двух типов препротеинов, за исключением наружного мембранного GIP комплекса. Путь импорта белков переносчиков следует новому принципу. отличному от того, что используется для препротеинов с presequences. Если presequences направляют таргетинг и тарнслокацию полипептидов как линейных цепочек, то белки переносчики содержат несолько сигналов, разбросанных по всей первичной структуре и, по-видимому, транспортируются в частично сложенной форме.

(Рис.3.) | Import of a hydrophobic carrier protein into the inner mitochondrial membrane.

Цитозольная транспорт-форма препротеина переносчика (рис. 3, ст. I) защищена от агрегации молекулярными хаперонами, такими как цитозольный Hsp70 и mitochondrial import stimulating factor ( MSF). Tom70 функционирует как основной рецептор для этих белков. Множественные направляющие сигналы, которые имеются у переносчиков, рекрутируют несколько Tom70 димеров на один препротеин. Carrier preproteins состоят из трех связанных доменов ~ в 100 аминокислотных остатков, названных модулями. Каждый модуль м. связываться с Tom70 и, с помощью кооперации с другими двумя модулями, по-видимому, индуцировать олигодимеризацию трех Tom70 димеров (Рис. 3, ст. II). Высвобождение препротеина переносчика из Tom70 нуждается в АТФ. Предполагается, что Tom70 не только действует как рецептор, но также обладает хаперон-подобными свойствами (Рис. 3, ст. II), защищая от агрегации во время переноса от цитозольного транспортного комплекса (Рис. 3, ст. I)к import поре (Рис. 3, ст. IIIa).

Препротеины переносчиков не пересекают наружную мембрану в виде линейной цепочки, вместо этого внутренняя петля транслоцируется сначала через Tom40 канал (Рис. 3, ст. IIIa). Эффективное накопление препротеина переносчика в канале нуждается в присутствии более чем одного сигнала. Предполагается, что транслокация их с образованием петли делает возможной кооперацию импорт-сигналов, которые отличны от любого другого при линейном способе транслокации.

После выхода из транслоказы наружной мембраны белки переносчики взаимодействуют с Tim9– Tim10 комплексом, который, по-видимому, эащищает эти гидрофобные белки от агрегации в водном межмембранном пространстве. Tim9 и Tim10 являются гомологичными белками, которые образуют гетеродимерный комплекс, возможно гексамерв межмембранном пространстве. Подобно большинству Tim белков, эти малые Tims существенны для жизнеспособности клеток. Малые Tim белки образуют семейство из 5 членов: Tim8 , Tim9, Tim10, Tim12 и Tim13. Tim8 и Tim13 соединяются также в гетеромерные комплексы в межмембранном пространстве, но они не обязательны для клеточной жизнеспособности. Tim8 и Tim13, по-видимому, участвует в импорте некоторыхспециальных препротеинов; они отлавливают предшественник Tim23 в межмембранном пространстве, и влияют на взаимодействие Tim9–Tim10 комплекса с внутренней мембраной. Первое заболевание человека, обусловленное дефектом machinery импорта митохондриальных белков — deafness dystonia (Mohr–Tranebjaerg) syndrome — вызывается мутацией у человека гена, гомологичного Tim8.

Tim12 является обязательным белком, локализованным на наружной поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Он является частью TIM22 компдекса (~ 300 kDa), который содержит также три интегральных мембранных белка, Tim22, Tim54 и Tim18. Tim12 представляет собой функциональную связь между растворимым TIM комплексом межклеточного пространства и интегрированными в мембраны компонентами TIM22 комплекса (Рис. 3, ст. IIIb). Инсерция препротеинов в TIM22комплекс (Рис. 3, ст. IV) сильно зависит от присутствия мембранного потенциала. Tim22 гомологичен Tim23 и Tim17 транслоказам presequence, следовательно, м. формировать канал. Tim54 экспрессирует большой домен в межмембранное пространство и м. связывать препротеины или др. компоненты транслоказы. Tim18 м. использоваться при сборке и стабилизации TIM22 комплекса. Современная модель инсерции в мембрану белков переносчиков указывает на то, что препротеин формирует несколько петель, возможно по одной на модуль, во время транслокации в TIM22 комплекс (Рис.3.) ст. IV). Наконец, переносчики высвобождаются с помощью неизвестного мехаизма в липидной фазе внутренней мембраны и собираются в функциональные гомодимеры (Рис.3.), ст. V).

Variations on import pathways

Помимо препротеинов, содержащих presequence, и препротеинов переносчиков митохондрии импорируют и многие др. препротеины, используя вариации двух принципиальных путей (Рис. 4а). Белки наружных мембран. также как и некоторые белки, предназначенные для межмембранного пространства или внутренней мембраны , первоначально следуют по presequence пути(Рис.4a.), путь A) , а затем дивергируют в соответ. субкомпартменты, управляемые сортинг-сигналами в препротеинах (Table 1). Специальный механизм сортировки выявлен у дрожжей для NADH-cytochrome b₅ reductase, который заканчивается в двух митохондриальных субкомпартментах, хотя синтезируется лишь один тип препротеина с двухсоставными N-терминальными presequence (положительно заряженными направляющими в матрикс сортинг-последовательностями). Во время инсерции в наружную мембрану примерно треть препротеинов первоначально закрепляется на мембране с помощью гидрофобных сортинг-сегментов и остается нерасщепленной (см. Table 1, first variation). Однако остановка транслокации является неполной и оставшиеся молекулы проходят через наружную мембрану подвергаются протеолитическому процессингу и отсортировываются в межмембранное пространство. Этот путь сравним с тем, что проходит др. препротеины, такие как cytochrome b₂, который содержит двухчастные presequence (см Table 1, third variation).

(Рис.4.) | Variations on mitochondrial import pathways.

На пути импорта носителей (Рис. 4а, путь B), некоторые препротеины могут проходить мимо рецепторов Tom70 и использовать Tom20, хотя и с низкой эффективностью. Tim8–Tim13 комплекс очевидно функционирует параллельно комплексу Tim9–Tim10 при импорте некоторых белков внутренней мембраны. Более того, некоторые препротеины соединяясь с Tim9–Tim10 комплексом, м. поставляться TIM23 комплексу скорее, чем TIM22комплексу. Соединения возможны также на уровне TIM23 комплекса и TIM22 комплекса, напр., при временном контакте с транслоказами.

Дальнейшие вариации путей импорта выявлены при анализе биогенеза белков Tim (Рис.4b.). Во-первых предшественники малых Tim белков следуют одному из смых простых путей, обходя поверхностные рецепторы и используя только GIP комплекс для достижения межмембранного пространства (Рис. 4b, путь C). Пересечение пути presequence и пути переносчиков происходит во время импорта предшественников Tim22 и Tim54. Так, предшественники Tim22 сначала связываются с Tom20 подобно белкам, несущим presequence, затем после прохождения GIP, они переходят на путь импорта переносчиков с помощью TIM22 комплекса(Рис.4b.), путь D). Напротив, предшественники Tim54 распознаются с помощью Tom70 и затем присоединяюдтся к пути для препротеинов, содержащих presequence, посредством TIM23 комплекса. Tim54 постепенно дивергирует с presequence пути и высвобождается во внутренней мембране (Рис. 4b, путь E). Tim54 несет внутренние направляющие сигналы и неотщепляющийся сегмент на N-конце, который обогащен положительно заряженными остатками. Сегмент не функционирует как bona fide presequence, т.к. не образует amphipathic α-спирали, так что не распознается с помощью Tom20. Он содержит направляющие внутренние сигналы для Tim54, который распознается с помощью Tom70. N-концевой сегмент, с др. стороны, необходим для транслокации с помощью TIM23 комплекса, возможно, с помощью электрофоретического эффекта мембранного потенциала на положительно заряженный сегмент.

Некоторые препротеины выступают в импорт-каналы ко-трансляционным способом, когда часть белка все еще синтезируется на рибосомах. Так, препротеин fumarase, белок обнаруживается в митохондриях и цитозоле, несмотря на тот факт, что синтезируется только одиночный препротеин с presequence. Препротеин частично импортируется в митохондрии по ко-трансляционному способу и presequence удаляется с помощью MPP в матриксе. Большинство таких белков нормального зрелого размера после такого процессинга затем высвобождаются в цитозоль, очевидно в результате ретроградного двмжения через транслокационные каналы и лишь незначительная часть целиком импортируется, давая митохондриальную форму.

В заключение, оригинальная модель одного принципиального пути импорта в митохондрии, которая используется различными препротеинами, м.б. радикально изменена. Митохондриальные препротеины не несут консенсусных направляющих поседовательностей, но имеют различные направлющие и сортинг сигналы. которые вероятно наиболее охарактеризованы физикохимически, чем по составу аминокислот. Разные типы импорт-сигналов м.б. найдены во многих комбинациях препротеинов. Предполагается, что митохондриальные транслоказы, рецепторы, каналы и transfer компоненты имеют высокую гибкость для взаимодействия с препротеинами. Вместе с наблюдаемыми динамическими взаимодействиями между компонентами транслоказ это говорит в пользу генерации сети путей импорта (Рис.4.). Типичные препротеины д. распознавать многочисленные уровни ее путей импорта и только если они имеют направляющие характеристики, необходимые для каждого уровня, они будут в итоге оказываться в месте своего назначения. Эта точка зрения о кооперации множественных с низким сродством связывания сайтов (binding chain hypothesis) подтверждается наблюдением, что целый комплекс TOM взаимодействет с препротеином со значительно более высоким сродством, чем отдельные Tom белки.

Perspectives

Имеющиеся данные указывают на то, что ни один из Tom рецепторов не м. импортировать свой собственны препротеин, а нуждается в др. Tom белках для специфического импорта. Это дает безопасную систему, защищенную от неправильного таргетинга индивидуальных рецепторных молекул, которые могли бы вызывать последующий неправильный таргетинг многих рецепторных молекул в др. органеллу. Новые Tom и Tim белки, по-видимому. постоянно интегрируются в пресуществующие комплексы. Возможно, что динамические транслоказные комплексы быстро обмениваются с субкомплексами, в которые м. интегрироваться позднее собранные промежуточные формы. Предполагается. что зрелый GIP комплекс в 400 kDa обменивается с 100-kDa субкомплексами, которые функционируют как места сборки вновь импортируемых TOM субъединиц, включая важнейший препротеин канала Tom40.

Плохо изучен механизм экпорта белков из матрикса во внутреннюю мембрану митохондрий, включая компоненты дыхательной цепи, которые кодируются и синтезируются в матриксе. Белок внутренней митохондриальной мембраны Oxa1 (cytochrome oxidase assembly 1) идентифицирован как компонент export machinery, который направляет белки из матрикса во внутреннюю мембрану. За исключением пептидазы внутренней мембраны, которая родственна бактериальной leader peptidase, Oxa1 является первым митохондриальным транспортным компонентом, гомологичным бактериальному экспорт-компоненту (YidC). Oxa1 м., следовательно, представлять собой machinery для консервативного сходного с прокариотами сортинга некоторых митохондриальных белков, которые кодируются или митохондриальным, или ядерным геномом. Идентифицирован Pnt1, который м.б. добавочным компонентом export machinery для кодируемых в митохондриях белков.

How are the targeting и sorting signals decoded by receptors и downstream import components? The relevance of co-translational translocation in vivo и the roles of cytosolic cofactors for co-translational as well as post-translational translocation are not understood. How can the inner membrane translocase channels be kept impermeable to protons during the translocation of entire polypeptide chains? How is the energy input converted into directional protein translocation at the molecular level? Which components are responsible for protein sorting to the mitochondrial subcompartments? It is conceivable that the mitochondrial inner membrane contains a third import translocase complex and thus, like bacteria и thylakoids (of chloroplasts), might have several translocation и sorting machineries. Finally, we would like to know how the flow of preproteins through the different import pathways is coordinated и regulated.

VERSATILITY OF THE MITOCHONDRIAL PROTEIN IMPORT MACHINERY