Митохондрии высвобождают способствующие гибели факторы из своих межмембранных пространств и продуцируют АТФ. Одним из таких факторов является cytochrome c, который обычно обменивается электоронами с белками комплекса дыхательной цепи. Попав в цитозоль cytochrome c связывается с Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor 1) и в присутствии dATP или ATP рекрутирует и активирует procaspase 9 для образования комплекса, наз. apoptosome. Активированная caspase 9 м. в свою очередь активировать др. каспазы, которые, наконец, раздевают клетку. Если митохондрии повреждены и неспособны продуцировать АТФ рано во время апоптоза, то апоптосомы не могут образоваться, каспаза 9 не активируется и клетки погибают в результате некроза.

Dangerous molecules are safely stored in the intermembrane space of mitochondria. The safety is guaranteed by the physical barrier of the OMM, disruption of which is likely to lead to cell death. At least two mechanisms can make this membrane leaky: activation of Bax-subfamily members and opening of the PTP, although only Bax subfamily members can trigger permeabilization of the OMM without mitochondrial dysfunction. Because apoptosis depends on ATP, activation of Bax or Bax-like proteins independently of the PTP is the best guarantee for death of a cell by apoptosis.

Boxes

Box 1 | The Bcl-2 family
Bcl-2 was discovered at the chromosomal breakpoint of t(14;18)-bearing human B-cell lymphomas. The Bcl-2 family contains many members that can be subdivided into anti- and pro-apoptotic proteins. These proteins have up to four Bcl-2 homology (BH) domains, which correspond to α-helical segments. Anti-apoptotic proteins such as Bcl-2 and Bcl-x_L have four BH domains, whereas the pro-apoptotic members seem to lack BH4.

The pro-apoptotic Bcl-2-family members can be subdivided into two groups: the Bax subfamily (Bax, Bak and Bok), members of which contain BH1, BH2 and BH3; and the 'BH3-only' proteins (such as Bid, Bad and Bim), which have only the BH3 domain. This domain is required for the killing activity of the pro-apoptotic proteins. Many Bcl-2 family members also contain a carboxy-terminal hydrophobic domain, which allows these proteins to be anchored in intracellular membranes.

Links
DATABASE LINKS
Apaf-1 | Smac | AIF | Bcl-2 | Bcl-x_L | Bax | Bak | Bid | Bad | Bim | cyclophilin D | Bok
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES
Apoptosis: molecular mechanisms

Если авторы предыдущей статьи являются сторонниками первой модели пермеабилизации ОММ, то авторы нижестоящей статьи сторонники второй модели РТР, разбухания и прорыва ОММ.
Naoufal Zamzami, Guido Kroemer
The mitochondrion in apoptosis: how Pandora's box opens
Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 67-71 (2001)

Комплекс РТР ( PTPC) - или митохондриальный мегаканал - формируется в месте контакта между IMM и OMM Рис. 1). Его стержневым компонентом является adenine nucleotide translocator (ANT, в IMM) и voltage-dependent anion channel (VDAC, в OMM).

(Рис.1.) | Hypothetical molecular architecture of the permeability transition pore complex and its regulation.

VDAC обычно проницаем для растворимых в-в до 50 kDa, и обеспечивают, следовательно, обмен такими субстратами как NADH, FADH и ATP/ADP между митохондрияими и цитоолем. Напротив, IMM почти непроницаема в результате чего и образуется электрохимический градиент протонов (ΔΨ_m), используемый для оксидативного фосфорилирования. Но проницаемось обеих мембран м. внезапно увеличиться in vitro - напр., после добавления atractyloside (лиганда ANT) - и этот 'permeability transition' связан с PTPC (Box 2)

Box 2 | The mitochondrial permeability transition
Definition. The mitochondrial permeability transition involves a sudden (and initially reversible) increase in permeability of the IMM to solutes up to 1.5 kDa. It is commonly defined by its inhibition by cyclosporin A or derivatives of this compound that bind to mitochondrial cyclophilin (peptidyl-prolyl- cis-trans-isomerase) such as N-methyl-Val-4-cyclosporin A. Cyclosporin A-mediated inhibition of the permeability transition is transient (lasting 60 min).

Regulation. The permeability transition pore complex (PTPC) functions as a sensor for:

Voltage: The PTPC decodes voltage changes into variations of the probability (the 'gating potential') at which pore opening occurs. Pore agonists shift the gating potential to more negative values (physiological = 200 mV, negative inside), favouring pore opening, whereas pore antagonists favour its closure.

Divalent cations: Matrix Ca²⁺ increases the probability of pore opening. Matrix Mg²⁺ or Mn²⁺, and external divalent metal ions including Ca²⁺ all decrease the probability of pore opening.

Matrix pH: The permeability transition pore is closed at neutral or acidic pH owing to reversible protonation of histidine residues and/or inhibition of the interaction between matrix cyclophilin and the ANT. Alkalinization is permissive for pore opening with a maximum effect at a matrix pH of 7.3.

Thiol oxidation: Oxidation (disulphide formation) of a critical mitochondrial dithiol (presumably cysteine 56 of the ANT dimer) increases the probability of pore opening. The redox status of this dithiol is in equilibrium with that of matrix glutathione.

Oxidation/reduction state of pyridine nucleotides (NADH/NAD⁺ and NADPH/NADP⁺). Oxidation of pyridine nucleotides favours permeability transition.

ANT ligands: The endogenous ANT ligand ADP as well as bongkrekate inhibit permeability transition. Atractyloside, another ANT ligand, induces permeability transition.

Metabolites: Glucose and creatine inhibit permeability transition, presumably through their action on hexokinase and creatine kinase. Ubiquinone O (coenzyme Q) also inhibits permeability transition. Long-chain fatty acids, ceramide and ganglioside GD3 favour permeability transition.

Anti- and pro-apoptotic members of the Bcl-2 family.

Metabolic consequences. Full-blown permeability transition causes uncoupling of the respiratory chain with collapse of the electrochemical proton gradient ΔΨ_m and cessation of ATP synthesis, matrix Ca²⁺ outflow, depletion of reduced glutathione, depletion of NADPH, hypergeneration of superoxide anion, and mitochondrial release of intermembrane proteins. Several of the consequences of permeability transition themselves favour opening of the permeability transition pore, implying that permeability transition is a self-amplifying process.

Physiological function. Periodic reversible opening of the permeability transition pore allows for the release of Ca²⁺ from the mitochondrial matrix, thereby participating in Ca²⁺ homeostasis and/or the generation of Ca²⁺ waves (Ca²⁺-induced Ca²⁺-release). A role in neuronal plasticity has been suggested. The ANT/VDAC couple (and its interacting proteins hexokinase and creatine kinase) may also participate in regulating ATP/ADP transport/synthesis. Irreversible permeability transition triggers mitochondrial autophagy (a process by which cells digest parts of their cytoplasm), apoptosis or necrosis.

ПомимоANT и VDAC PTPC содержит периферический benzodiazepine receptor (в OMM), creatine kinase (в межмембранном пространстве), hexokinase II (связанную с VDAC на цитозольной стороне OMM), cyclophilin D (в митохондриальном матриксе ), а также Bax/Bcl-2-like белки ( Рис. 1).

Прямые взаимодействия выявлены для ANT и cyclophilin D, между ANT и VDAC. В результате таких взаимодействий меняется конформация ANT (которая косвенно затрагивается циклоспорином A, и которая влияет на взаимодействие cyclophilin D-ANT), которая м. косвенно влиять на функцию VDAC, или vice versa. Т.о.,> PTPC м. одновременно контролировать проницаемость OMM и IMM.

Альтернативно, инициальная пермеабилизация IMM м. вызывать разбухание митохондриального матрикса (osmosis), и вести к прорыву OMM. Но это не универсальное свойство апоптоза.

Апоптоз коррелирует с такими признаками скачка проницаемости как потеря митохондриального трансмембранного потенциала (ΔΨ_m). Bongkrekate, ANT лиганд, который ингибирует PTPC, предупреждает и апоптоз, индуцируемый различными стимулами, но пермеабилизация м. происъходить и полностью PTPC-независимым способом.

Некоторые вирусные или бактериальные белки, модулирующие апоптоз, также взаимодействуют с PTPC.

Bcl-2 и Bax м. взаимодействовать - прямо или косвенно - с VDAC в OMM. Bcl-2, Bcl-x_L, Bax и Bak взаимодействуют прямо с ANT.

Proteoliposomes, содержащие как ANT так и рекомбинантный Bax обнаруживают высокую проницаемость в ответ на действие atractyloside или Vpr, чем proteoliposomes только с ANT или Bax. Напротив, Bcl-2 предупреждает ANT-обусловленную permeabilization липосом. Аналогичные результаты получены для VDAC-содержащих proteoliposomes. Bax/VDAC липосомы (но не липосомы,содержащие тоько VDAC или Bax) проницаемы для cytochrome c (14.5 kDa), но не для белка в 50 kDa .

Имеются также данные, которые указывают на то, что белки семейства Bcl-2/Bax м. пермеабилизовать мембраны путем неспецифических эффектов, которые не нуждаются во взаимодействиях с др. белками PTPC.

(Рис.2.) | Alternative hypotheses for the modus operandi of Bcl-2/Bax-like proteins.

См. также инф. на Сайте

Наружная митохондриальная мембрана (outer mitochondrial membrane (OMM)) становится проницаемой для апоптогенных факторов, таких как cytochrome c, Smac/DIABLO (тоже активатор каспазы) и AIF (apoptosis-inducing factor); это м. обусловливать расщепление ДНК во время каспаза-независимой гибели клетки. Проницаемость OMM контролируется членами семейства Bcl-2. Анти-апоптические члены Bcl-2 илиBcl-x_L ингибируют высвобождение апоптогенных факторов митохондриями, тогда как про-апоптические члены (напр., Bax и Bak) вызывают их высвобождение (Box 1).

The point of action

Анти-апоптические члены семейства Bcl-2 часто закреплены за мембраны митохондрий, эндоплазматического ретикулема или ядерной оболочки своим С-терминальным доменом. Большинство же про-апоптических членов, ключая Bax и 'BH3-only' белки (где BH3 противостоит Bcl-2 гомологичному домену 3) Bid, Bad и< Bim (Box 1) обычно обнаруживаются в цитозоле или рыхло ассоциированы с мембранами. После сигнала гибели эти белки транслоцируются в OMM, где они и действуют.

В ответ на средовые сигналы пост-трансляционные модификации делают BH3 домены белков BH3-only доступными др. членам семейства Bcl-2 . Напр., расщепляется каспазой 8 и затем соединяется с Bax или Bak, экспозируя тем самым N-концы этих белков. В случае Bax, С-конец отсоединяется от BH3 домена, который обыно маскирует. Эти конформационные изменения сопросождаются инсерцией Bax и/или Bak в OMM, где эти белки гомо-олигомеризуются и формируют каналы (Рис. 1). Анти-апоптические белки, такие как Bcl-2, Bcl-x_L и E1B19K м. взаимодействовать с Bax или Bak, чтобы воспрепятствовать конформационным изменениям или их олигомеризации и инсерции в OMM.

(Рис.1.) | Activation of Bax and Bak by BH3-only proteins.

Bad активируется путем дефосфорилирования, что позволяет ему высвобождаться из 14-3-3 белков, затем он гетеродимеризуется с Bcl-x_L, чтобы блокировать функцию этого anti-apoptotic белка. Сходным образом, активация Bim индуцирует его диссоциацию из цитоскелетного динеинового комплекса, он также, по-видимому, функционирует противодействуя Bcl-2 и Bcl-x_L.

Permeabilization of the OMM

Неясно как cytochrome c и др. белки высвобождаются из митохондриальных межмембрнных пространств. Предложены два объяснения: образование автономных каналовчленами подсемейства Bax; и неспецифический прорыв OMM в разультате разбухания митохондриального матрикса и экспансии внутренних мембран.

Известно, что после инициального и вариабельного lag периода весь cytochrome c высвобождается из всех митохондрий в течение очень короткого времени.

The channel models

Согласно этой модели большие каналы или поры в OMM пропускают растворимые белки из митохондрий. Выявляется структурное сходство между Bcl-x_L и поры-формирующим доменом токсина дифтерии и бактириального colicins. Сходная структура выявлена и у Bax и м.б. предсказана для Bcl-2 и Bak. Несмотря на то, что голология последовательностей ограничена их BH3 доменами, трехмерная структура Bid очень сходна с Bcl-x_L , указывая тем самым, что и др. BH3-only белки также м. иметь такую структуру.

Некоторые члены семейства Bcl-2 , включая Bcl-x_L, Bcl-2, Bax и расщепленный Bid, формируют функциональные ионные каналыв синтетических липидных пузырьках и плоских липидных мембранах. Они multiconductance, voltage- и pH-зависимы, и со слабой избирательностью ионов (за исключением Bcl-2 и Bcl-x_L канальцев, которые предпочитают моновалентные катионы). Имеются лишь косвенные указания, что и в митохондриальных мембранах они дают канальцы. Bax, Bak или Bid добавленные к изолированым митохондриям из печени и клеток HeLa вызывают permeabilization их OMM, причем ультраструктура и гомеостаз объема митохондрий сохраняются. Более того, эти митохондрии сохраняют свой мембранный потенциал (δψ_m), protein-import capacity и потребление кислорода.

Лишь Bax олигомеры — не мономеры — являются про-апоптическими. Нельзя исключить, что после расщепления их N-концов антиапоптические белки также м. олигомеризоваться и становиться про-апоптическими. Показано, что в липосомах Bax тетрамер м. формировать канал с размером поры около 22 Å через которую м. проходить cytochrome c.

Теоретически этот канал недостаточен, чтобы пропускать большие белки, значит дальнейшая олигомеризация или др. белки необходимы, чобы увеличить поры. Напр., pneumolysin, токсин, продуцируемый Streptococcus pneumoniae, олигомеризуется после соединения с холестеролом в клеточных мембранах, образуя кольца из 30–50 субъединиц с размером до 350–450 Å , что позволяет проходить большим белкам. Сходным образом, Bax и Bax-подобные молекулы м. давать автономные мультимерные мега-каналы в OMM, чтобы выводить крупные белки из межмембранных пространств митохондрий. Но таких каналов пока не найдено.

The permeability transition pore

Вторая модель проницаемости OMM предполагает, что они разрываются из-за разбухания митохондриального матрикса и внутренних мембран. Базовая структура permeability transition pore (PTP), формируется комплексом voltage-dependent anion channel (VDAC), adenine nucleotide translocator (ANT) и cyclophilin D, и некоторыми др. белками в месте контакта между наружными и внутренними мембранами митохондрий (see page).

In vitro PTP открываются в условиях оксидативного стресса, высоких Ca²⁺ или низких АТФ концентраций. Это позволяет растворам низкого молекуляного веса (свыше 1.5 kDa) дифундировать через inner mitochondrial membrane (IMM), вызывая набухание митохондрий. Это м. вызвать разрыв OMM. Открытие PTP м.б.важным в патогенезе некроза после ишемии и reperfusion.

Не удалось выявить взаимодействия между компонентами PTP и Bax, Bak, Bcl-2 или Bcl-x_L , хотя вроде бы и выявлены физические и функциональные связи этих белков или с ANT или VDAC.

Bax м. менять физические свойства VDAC, делая VDAC канал проницаемым для цитохрома c; Bcl-2, с др. стороны, через свой BH4 домен м. поддерживать VDAC в закрытой конфигурации.

Однако данные об открытии и увеличении VDAC , по-видимому, противоречат тем, что получены в апоптических клетках. В таких клетках закрытие VDAC ведет к гиперполяризации IMM и последующему повреждению OMM благодаря дефектному обмену АТФ между митохондриями и цитозолем. Bcl-x_L препятствует закрытию этих VDAC и повреждению OMM. Тем не менее нельзя исключить возможность, что VDAC постепенно открываются или каким-то иным способом участвуют в проницаемости OMM.

Открываются ли PTP или закрываются VDAC (except the 'VDAC pore' model) предполагается, что проницаемость OMM вызывается разбуханием матрикса и разрыву ОММ. Однако разрывов в ОММ не выявлено после OMM permeabilization, показано также, что непрерывность OMM во время апоптоза м. б. защищена ингибиторами каспаз.

Sources of conflict

Основное преимущество 'PTP model' и разрыва OMM над 'channel model' в том, что она легче объясняет высвобождение большинства белков из митохондрий. Более того участие PTP подтверждается многочисленными сообщениями о том, что потенциал митохондриальных мембрн ( Δ Ψ_m) collapses перед активацией каспаз и апоптозом.

Однако кооперация Bax или Bcl-2 с PTP пока не доказана. Даже наиболее сильный аргумент в пользу PTP — который базируется на неблагоприятном эффекте cyclosporin A на активность Bax и его защитном действии во многих апоптических ответах - следует принимать с осторожностью. Известно окоо 8 других cyclophilins вне митохондрий, функция которых не определена. Во многих апоптических реакциях высвобождение cytochrome c и др. белков предшествует нарушению Δ Ψ_m и открытию PTP. Главный контр-довод 'PTP model' тот, что она не совместима со способностью митохондрий оставаться функциональными достаточно долго, чтобы активировать каспазы и апоптоз.

Our opinion

Две описанные модели пермеабилизации ОММ (Рис. 2) не являются взаимоисключающими, эти механизмы м.б. разными в разных тканях.

(Рис.2.) | Two models for permeabilization of the outer mitochondrial membrane.

В первой модели пермеабилизация ОММ с помощью подсемейства Bax ведет к активации каспаз или к открытию PTP, в зависимости от компетентности клеток погибать с помощью апоптоза. 'Competence to die by apoptosis' отражает способность данной клетки активировать апоптосомы в ответ на апоптогенные факторы.

После permeabilization OMM, клетки, которые некомпетентны погибать с помощью апоптоза, осуждены на независимый от каспаз процесс, напоминающий некроз. Митохондрии прекращают работать, т.к. деплеция cytochrome c м. нарушать транспорт электронов и продукцию АТФ. Это ведет к гибели с кинетикой, зависящей от способности клеток продуцировать АТФ в результате анаэробного гликолиза.

Вторая модель предполагает, что падение ΔΨ_m предшествует permeabilization OMM ( Рис. 2b). Дисфункция митохондрий в этом случае связана скорее с классическими PTP openers (керамиды, повышенная конц. Ca²⁺и т.д.). Но как происходит дальнейший выбор между апоптозом и некрозом. Напр., обработка нейронов высокими уровнями глютамата вызывает некроз, тогда как низкие уровни активируют апоптоз. В некоторых клетках 'mild death signals' м. влиять лишь на субпопуляцию миохондрий или отвечают за временное открытие (flickering) PTP в некоторых из митохондрий. Выведенные из стоя митохондрии м. продуцировть достаточно АТФ, чтобы активировать каспазы и возможность клеткам запустить "accidental apoptosis". Анти-апоптические члены семейства Bcl-2 м. противодействавать этому типу гибели, препятствуя открытию PTP.

МИТОХОНДРИИ: МЕХАНИЗМЫ ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИИ