N-RAP в 133 кДа актин-связывающий LIM белок обнаружен в скелетных и сердечной мышцах. Его С-терминальный конец содержит nebulin-родственные супер повторы, которые связывают актин и винкулин, тогда как N-терминальный конец содержит LIM доменовые последовательности, которые связывают талин. Между этими двумя последовательностями находятся уникальные последовательности, которые связывают muscle LIM protein (MLP) и актин, хотя актин связывается в 10 раз слабее, чем областью с супер повторами. Первоначально N-Rap обнаружен в сайтах механического куплинга между миофибриллами и клеточной мембраной в соединении мышц с сухожилием и в интеркалированных дисках сердечной мышцы.
N-RAP концентрируется в терминальных концах зрелых клеток и в сайтах межклеточных контактов, кроме того обнаруживается вдоль предшественников миофибрилл в незрелых кардиомиоцитах. Живые кардиомиоциты, экспрессирующие α-актинин, слитый с GFP, обнаруживают тесно расположенные бусинки α-актинина, агрегирующие латерально и формирующие миофибриллы. Образующиеся миофибриллы включают титин, а мышейный миозин постепенно замещается немышечной изоформой. Мышечный миозин м. сущестовать как в преформированных биполярных толстых филаментах, которые ориентированы и инкорпорируются в образующиеся миофибриллы в результате их взаимодействия с титиновыми филаментами. Подобно немышечному миозину IIb, N-RAP присутствует во всех предшественниках миофибрилл, но не обнаруживается в зрелых саркомерах.
Было установлено, что GFP-N-RAP специфически локализуется в предшественниках миофибрилл и в местах межклетоынцх контактов. В противоположность этому GFP-N-RAP-IB и GFP-N-RAP-SR обнаруживаются как в предшественниках миофибрилл, так и во взрослых саркомерах., причем GFP-N-RAP-SR колокализуется с миофиламентами, а GFP-N-RAP-IB с α-актинином и Z-линиями.
A model for initiation of myofibrillogenesis
Самые ранние предшественники миофибрилл возникают вблизи мембран, указывая тем самым на роль мембран-ассоциированных связывающих молекул в этом процессе. Предполагается, что N-RAP играет критическую роль на на первых ступенях миофибриллогенеза: N-RAP связан тесно с мембран-ассоциированными белками талином и винкулином, а также актином; N-RAP обнаруживается в самых ранних премиофибриллах на периферии; N-RAP экспрессируется только в поперечнополосатых мышцах; и каждая область N-RAP м. полностью нарушать формирование миофибрилл. Все это указывает на роль N-RAP как организующего центра в инициальной фазе сборки миофибрилл.
Предполагается, что N-RAP связывается с мембран-ассоциированным комплексом, содержащим интегрины, талин и винкулин (ступень 1). LIM домен N-RAP, по-видимому, отвечает за инициальную интеркаляцию, т.к. он исключительно помещается на периферии клетки и связывает непосредственно талин. Взаимодействие между супер повторами N-RAP и винуклиновым хвостом м.б. важным для соотв. позиционирования компонентов Z-линии и актиновых филамент, которые рекрутируются в комплекс на последующих ступенях.
Затем компонеты Z-линии (напр., MLP) рекрутируются мембран-ассоциированным комплексом путем связывания с N-RAP-IB и винкулином (ступень 2). Это согласуется со связыванием α-актинина с коловной областью винкулина.
Небулиновые повторы м. служить местами полимеризации актина (nucleation) и строгой актин-связывающей активности N-RAP супер повторов параллельно их гомологии с небулином, указывая тем самым, что они имеют сходные эффекты. Предлагаемая модель включает и то, что актиновые филаменты полимеризуются вдоль N-RAP супер повторов и интегрируются с компонентами Z-линии, связанными с N-RAP-IB (ступень 3). По аналогии с небулином, супер повторы обеспечивают направленность актиновых филамент; т.к. ориентация небулина в саркомерах скелетных мышц помещает их С-концы в Z-line-ассоциированным колючим концом актинового филамента, а их N-концы в центр саркомера на pointed конце актинового филамента. Предполагается, что взаимодействие между N-RAP супер повторами и хвостом винкулина служит для ориентации комплекса таким способом, который позволяет соотв. позиционирование полимеризации актиновых филамент вдоль N-RAP супер повторов относительно Z-линии компонетиов, связанных с N-RAP-IB и винкулином.
Наконец , комплекс Z-телец, содержащий N-RAP, с ассоциированными актиновыми филаментами высвобождается от мембранного комплекса (ступень 4), а N-RAP удаляется из комплекса когда Z-тела сливаются латерально, формируя Z-линии (ступень 5). Предполагается, что N-RAP LIM домен направляет N-RAP на удаление из формирующихся миофибрилл. Высвобождение из мембраннгого комплекса м. сопровождаться посттрансляционными мoдификациями N-RAP LIM домена, которые служат как сигнал для удаления N-RAP.
МИОФИБРИЛЛЫ КАРДИОМИОЦИТОВ
Формирование миофибрил происходит в результате прикрепления тонких филамент к аморфному Z материалу, который присутствует в саркомерных бляшках ( plaques), саркоплазматических кондесатах (sarcoplasmic condensations), десмосомах (desmosomes) и в Z линиях. Из этих Z центров миофибриллы расходятся ( radiated) во многих направлениях, ветвясь и анастомозируя в последующем развитии. Этот паттерн развития миофибрилл продолжается в течение всей жизни плода . Поперечная тубулярная система четко обнаруживается в позднем периоде развитя плода. Это происходит в результате инвагинации сарколеммы в миокардиальные клетки и образования субсарколемных кавеол ( caveolae). Митохондрии, хорошо развитый комплекс Гольджи, гликогеновые гранулы и хорошо развитые микрососуды обнаруживаются в течение всего плодного периода . Двуядерные миоциты появляются на 32 неделе беременности и это указывает на то, что гиперплазия миоцитов затухает. Визуолизовали формирование миофибрилл в живых кардиомиоцитах, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими green fluorescent protein (GFP), сцепленный с Z-band белком, α-actinina (Dabiri et al., 1989) . Экспрессия этого флюоресцентного белка позаволяет метить структуры , содержащие α-актинин. GFP-α-actinin слитый белок инкорпорируется в Z-диски, интеркалированные диски , и соединительные блюшки ( attachment plaques), а также в точечные агрегаты , или Z-тельца, которые как предполагается являются предшественниками Z-дисков.Наблюдение за живыми клетками в течение нескольких дней культивирования позволили подтвердить предположение о сборке миофирилл, полученые на фиксированных клетках. Тонкие фибриллы , называемые премиофибриллы, которые образуются de novo на выдвигающихся (spreading) концах кардиомиоцитов, содержат точечные концентрации α-actinin, Z-тельца. Эти Z-bodies растут и выравниваются с Z-bodies соседних фибрил . Со временем соседние фибриллы и Z-bodies выглядят слившимися и формируют зрелые миофибриллы с Z-дисками в цитоплазматических областях, где видны линейные ряды Z-bodies . Эти новые миофибрилы выравнивающиеся с уже имеющимися миофибрилами с их Z-дисками являются фибриллами, которые образутся de novo вблизи клеточных мембран и являются премиофибрилами, предшественниками зрелых миофибрил.
Кардиомиоциты не сливаются. Вместо этого они образуют хорошо развитые межклеточные соеднинеия см Интеркалированные диски
У эмбрионов кур мезодермальные прекардиальные клетки дифференцируются в кардиомиоциты и начинают экспрессировать саркомерный миозин на ст. 7 НН (24 ч развития).Титин появляется на стадии 8 (5 сомитов).
Эксплантанты сердце-формирующей мезодермы взятые на ст.6, после 7 ч культивирования обнаруживали экспрессию N-кадхерина, α- и β-катенина, пан α-актинина и F-актина по краям клеток. Саркомерный α-актинин и саркомерный миозин обнаруживались в эксплантантах после 10 ч культивирования. Саркомерный α-актинин появлялся сначала в виде небольших глыбок вдоль тонких актиновых филамент. Зрелые Z-линии начинали организовываться после 20 ч. культивирования, тогда же начинались сокращения. Предполагается, что zeugmatin и частично титин могут отвечать за слияние Z-телец в Z-линии. Обработка антителами против N-кадхерина вызывала потерю межклеточных контактов, клетки становились сферическими по форме и содержали tangled актиновые волокна. Экспрессия саркомерного α-актинина и саркомерного миозина супрессировалась. Возможно саркомерные белки синтезируются, но не включаются в миофибрилы. След., межклеточные взаимодействия через N-кадхерин необходимы для дифференцировки кардиомиоцитов и организации миофибрил( Imanaka-Yoshida et al., 1998).
α-актинин является белком, связывающим актин, что способствует стабилизации плазматической мембраны и помогает фиксировать органеллы в определнном положении у разных типов клеток . В мышцах это основной компонент в Z-lines организованных миофибрил. Анкирин соединяется с различными элементами цитоскелетной системы, включая миктротубочки , микрофиламенты и промежуточные филаменты и может помогать уякорению этих структур в клеточной мембране . Филамин - хорошо охарактеризованный актин-ассоциированный белок . Кроме того филамин является гель-формирующим белком,который задействован в образовании рыхлой толстой сети актиновых филамент . Эти белки работают вместе в согласии с другими цитоскелетными белками ,чтобы обеспечить сокращения клеток сердечной мышцы у позвоночных.
В уникальной линиии аксолотля (Ambystoma mexicanum) рецессивная мутация гена c обусловливет неполную дифференцировку сердца. Хотя мутантные эмбрионы (c/c) формируют сердце ,однако оно не бьется из-за неспособности образования организованных саркомерных миофибрил . Изучали ( Lemanski et al., 1997) трехмерное распределение α-actinin, ankyrin, и filamin во время миофибриллогенеза в нормальных и мутантных сердцах с ранней стадии начала сердцебиений (37)до выраженных сердцебиений ( stage 42). Было установлено, что контрактильные белки становятсяя все лучше и лучше организованы в нормальном сердце. В мутантом сердце хотя белки присутствуют почти в нормальных количествах, однако они неспособны организовываться в миофибриллы.
сердечной трубке эмбрионов кур осуществляли иммунолокализацию фосфотирозина (P-Tyr) и определяли взаимоотношения между P-Tyr и развивающимися миофибриллами. В межклеточных границах P-Tyr локализовался в адгезивных belt наружного миокардиального слоя клеток (6- to 13-somite stages),в несоединительных (non-junctional) межклеточных контактах (6- to 13-somite stages) и в ранних интеркалированных дисках как наружного, так и внутреннего миокардиального слоев клеток (8- to 13-somite stages). На границах между клетками и ВКМ внутреннего слоя клеток первые стадии образрования миофибрилл напоминали серийно выравненные области P-Tyr , тесно связанные с расположенными по окружности толстыми актиновыми пучками (8- to 9-somite stages). Это P-Tyr иммуноокрашивание уменьшалось, когда толстые актиновые пучки превращались в зрелые исчерченные миофибриллы на стадии 10- to 13-somite . Это указывает на то, что фосфорилирование белковых тирозиновых остатков сначала концентируется в модулируемых межклеточных и клетка-ВКМ адгезивных сайтах развивающихся миоцитов и миофибрилл .
Изучали сборку первых саркомеров у эмбринов кур в сердце, начинающем сокращаться .У эмбринов с 9 сомитами обнаруживается миомезин в виде паттерна поперечной исчерченности, указывающего на то, что миомезин экспрессируется довольно рано в развитии. Присутствие миомезиновой мРНК обнаруживается уже на стадии 7 сомитов . Экспрессия миомезиновой мРНК, кодирующей скелетную изоформу, предшествует транскрипции специфичной для сердца изоформы. Во взрослом сердце однако обнаруживается только сердечная изоформа. Было установлено, что второй домен миомезина,immunoglobulin-подобный домен, специфически связывается с областью М-дисков в кардиомиоцитах эмбрионов кур. (Auerbach et al., 1997).
МИОФИБРИЛЛ ОБНОВЛЕНИЕ во ВЗРОСЛОМ МИОКАРДЕ
Саркомеры мышц являются комплексом трехмерно расположенных контрактильных и регуляторных белков. Поддерживается динамическое равновесие с помощью механизма включения вновь синтезированных контрактильных белков и деградации и удаления старых, возможно поврежденных белков. Период полу-жизни основных котрактильных белков во взрослом сердце крыс варьирует от примерно 3-х дней для тропонина I (TnI) до 5 дней для тропомиозина (Tm) и миозина и свяше 10 дней для саркомерного актина.
Кардиальный TnI и αTm являются ключевыми регуляторными белками тонких филамент а кардиальном сократительном аппарате взрослых. TnI является субъединицей регуляторного комплекса, а Tm связывается с актином и регулирует соединение миозиновых поперечных мостиков с актином в ответ на изменения внутриклеточного [Ca2+ ].
Изучали включение вновь синтезированных кардиальных тропомиозина и тропонина I в миофибриллы полностью дифференцированных контрактильных клеток. Экспрессия меченного TnI обусловливала более существенное его участие в замещении эндогенного TnI, чем замещение меченным Tm эндогенного. Это указывает на то, что скорость замещения миофиламент ограничена скоростью замен белков, связанных с миофиламентами. Замещение Tm происходит преимущественно в точечных концах тонких филамент.
Экспрессия epitope-tagged αTm и cTnI белков связана со скоростью их инкорпорации и сходна с периодом их полу-жизни, определенным in vivo. В обоих случаях экспрессия экзогенных белков не меняла общего количества TnI или Tm, указывая на то, что экспрессия этих эндогенных белков подавляется. Это указывает на способность миофибриллярных белков и контрактильного аппарата адаптироваться к измененному уровню экспрессии микрофиламентных генов. Скорость включения миофиламентами вновь синтезированных белков ограничена скоростью обмена эндогенных миофиламентных белков, уже расположенных в местах миофиламентной решетки. Если места на миофиламентах недоступны, то вновь синтезированный котрактильный белок остается бездейственным или или быстро деградирует.
Другим общим свойством поддержания саркомер является то, что замещение эндогенных миофиламентных белков является униформным по всей клетке. Это указывает на о, что в зрелых взрослых кардиальных миоцитах, где миофиламентная решетка уже сформирована, миофиламенты по всей мышечной клетке замещаются одновременно.
Включение вновь синтезированного Tm начинаетя на свободных или точечных концах тонких филамент и продолжается в направлении Z-линии. Это м.б. связано с неравноценностью звеньев полимера, состоящего из 24 Tm. Однако cTnIFLAG инкорпорируется в саркомеры по всей клетке стохастически вдоль всей длины тонкой филаменты. Предполагается, что обмен субъединицами может происходить, когда тропониновый комплекс остается связанным с актином.
Сайт создан в системе uCoz