Авт. in vitro (в присутствии цитозоля) удаленные мембраны с ядер спермиев собарали в ядерные оболочки из DiIC18-меченных пузырьков яиц Xenopus laevis. Можно различить разные стадии (Рис.). Предшественники пузырьков сначала соединяются с хроматином и затем сливаются в трубчатую сеть на поверхности хроматина. Затем эта сеть становится закрытой ядерной оболочкой, которая позднее увеличивается во время ядерного роста.

Hetzer и др. использовали этот подход для проверки использования p97 - AAA ATPase, которая как было ранее показано участвует в гомотипическом слиянии постмитотического Golgi и переходного endoplasmic reticulum (ER). Антитела к p97 и истощение p97 из цитозоля эффектино блокировали образование ядерной оболочки.

Затем авт. задались вопросом, как p97 действует посредством своего известного acolytes, p47 или Ufd1-Npl4 комплекса. Ослабление сродства всех предполагаемых адапторов p97, но не p97, в цитозоле ингибирует сборку ядерной оболочки, указывая тем самым, что p97 не м. функционировать один. Добавление рекомбинантного p47 к истощенному цитозолю не восстанавливает процесс, но добавление рекомбинантного Ufd1-Npl4 комплекса ведет к формированию изолированных ядерных оболочек, компетентных к ядерному транспорту. Однако, ядра, которые образуются в этих условиях заметно меньше и достигают своих нормальных размеров только после добавления рекомбинантного p47 в assay. Hetzer и др. пришли к выводу, что p97 действует вместе с Ufd1-Npl4 на ранних стадиях, вплоть до закрытия ядерной оболочки, тогдакак он функционирует в комбинации с p47 на поздней стадии, во время роста ядерной оболочки.

Скорее всего взаимодействие p97 с p47 ведет к событиям SNARE-опосредованного слияния, как это происходит во время слияния Golgi или ER, механизм, с помощью которого p97 регулирует слияние посредством комплекса Ufd1-Npl4 неизвестен. Комплекс Ufd1-Npl4 как известно связан с ubiquitin-зависимой деградацией p97 должен дейстовать по-разному в комбинациях с разными адапторными комплексами.

Lothar Schermelleh, Peter M. Carlton, Sebastian Haase, Lin Shao, Lukman Winoto, Peter Kner, Brian Burke, M. Cristina Cardoso, David A. Agard, Mats G. L. Gustafsson, Heinrich Leonhardt, John W. Seda (sedat@msg.ucsf.edu )
Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.
Science 320,no. 5881, 1332–1336 (2008) Article

The image shows a nucleus from a mouse myoblast cell; DNA is shown in red, the nuclear lamina in blue and nuclear pores in green. The upper surface of the nucleus has been clipped in this projection to reveal the DNA staining underneath the lamina. Image courtesy of P. M. Carlton, University of California, San Francisco, USA.

Улучшение разрешения за пределами 200-nm дифракции давно стояло на повестке дня и это было достигнуто в последние годы с разработкой subdiffraction-resolution imaging техники. Группы John Sedat и Heinrich Leonhardt сегодня используют одну из таких техник - three-dimensional structured illumination microscopy (3D-SIM) - для изучения периферии ядра в клетках тканевой культуры млекопитающих.

Работая совместно они получили картину интерфазного хроматина на периферии ядра, используя клетки, которые были окрашены DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Удивительно, они наблюдали тысячи хорошо определяемых пустот DAPI окрашивании, которые не наблюдались в соотв. широкополюсных картинах epifluorescence.

Чтобы понять, соответствуют ли эти пустоты элиминации ДНК из nuclear pore complexes (NPCs), Sedat, Leonhardt и коллеги ко-иммуноокрашивали клетки NPC-специфическими антителами и антителами против lamin B (основного компонента ядерной ламины, которая выстилает ядерную оболочку). Для сравнения они получали картинки выборок с помощью confocal laser scanning microscopy (CLSM). Удивительно, что 3D-SIM картины постоянно выявляли организацию из трех слоёв, которая не обнаруживалась с помощью CLSM, при которой край периферического хроматина выделялся с помощью тонкого слоя ядерной ламины с сигналами ядерных пор на цитоплазматической стороне. Используя антитела против nucleoporin, который локализуется на нуклеоплазматической стороне NPC, сигнал NPC оказался в той же самой плоскости, что и сигнал lamin B. Это еще больше демонстрирует тонкие отличия, которые могут быть обнаружены в трехмерной организации периферии ядра.

Практически каждая DAPI пустота содержит фокус NPC окрашивания, что в дальнейшем было подтверждено большинством. если не всеми, что NPCs не содержат хроматина. Более того, плотность NPC фокусов была выше, подсчитанная с помощью 3D-SIM, чем с помощью CLSM. Измерения ширины NPC находятся в хорошем соответствии с теми. что получены с помощью ЭМ. Наконец, 3D-SIM позволяет видеть инвагинации ядерной оболочки, как биламинарные структуры, которые не возможны при CLSM. Это исследование демонстрирует многообещающие перспективы, которые открываются с помощью вдвое улучшенного разрешения 3D-SIM в латеральном и аксиальном направлениях по сравнению с обычной техникой флюоресцентных картин.