Клеточное ядро содержит различные субструктуры, которые характеризуются отсутствием выделяющих их мембран, но которые можно рассматривать как "компартменты" по нескольким причинам. Во-первых, они содержат определнные субнаборы резидентных белков. Во-вторых, они м.б. идентифицированы морфологически при микроскопии и даже в живых клетках при использовании green Ouorescent protein (GFP)технологии. В-третьих,по крайней мере, некоторые компартменты м.б. биохимически изолированы в виде обогащенной формы. Предполагается, что ядерный матрикс организует ядерную архитектуру.

Лучше всего изученными компартментами ядра являются ядрышки, splicing-factor compartments (SFCs), Cajal body (CB), promyelocytic leukaemia oncoprotein (PML) body и быстро растущее семейство точко-образных телец.

Рис.1. Ядерные компартменты, выявляемые с помощью флюоресцентной микроскопии. (a) SFCs (red), (b) the nucleolus (green), (c) the CB (green) and the nucleolus (red), (d) PML body (red) and CB (green), (e) mouse chromosomes 13 (blue), 14 (red) and 15 (green) in metaphase, (f) mouse chromosomes 13 (blue), 14 (red) and 15 (green) in interphase appear as chromosome territories.

Transcription sites and SFCs

Мечение формирующейся РНК показало, что транскрипция RNA polymerase II (RNA pol II) происходит в тысячях дискретных точек, распределенных по всему ядру. Предполагается, что компоненты RNA pol II ко-локализуются с этими точками. Однако, RNA pol II локализуется также в многочисленных доменах вне мест транскрипции. Эти места могут быть пулами хранения, из которых эти факторы рекрутируются. Некоторые специфические пре-мРНК были локализованы в увеличенных точках или удлинненых треках. Соответствующие активные гены оказывались на конце этих треков. Так как сплайсин часто происходит ко-транскрипционно, то эти места транскрипции могут представлять собой сайты сплайсинга пре-мРНК. Однако большинство факторов сплайсинга пре-мРНК не располагаются в сайтах активной транскрипции, а преимущественно располагаются в определенных доменах, названных speckles или SFCs (Рис. 1a). SFCs соответствуют перихроматиновым фибрилам и кластерам межхроматиновых гранул. Перихроматиновые фибрилы являются нитями варьирующего диаметра с частицами нерегулярных размеров, по-видимому, ормирующимися транскриптами. Кластеры межхроматиновых гранул состоят из плотных гранул 20±25 nm в диаметре, связанных нитями. SFCs не являются первичными сайтами сплайсинга пре-мРНК. Большинство активных генов обнаруживается на периферии SFCs и очень редко внутри компартмента. Функция SFCs заключается, по-видимому, в хранении и сборке компонентов spliceosom. Для экспрессии генов с интронами или вирусной инфекции сплайс-факторы перераспределятся из SFCs в новые сайты транскрипции (Рис. 2d). Так как сплайс-факторы движутся в направлении генов, то скорее всего и пре-мРНК также движется в направлении SFCs. Перемещение сплайс-факторов из SFCs в места транскрипции, как полагают, связано с циклом фосфорилирования и дефосфорилирования(Рис. 2d). Более того, накопление сплайс-факторов в местах транскрипции зависит от С-терминального домена наибольшей из субъединиц. Все механизмы процессинга РНК, по-видимому, связаны с механизмами транскрипции.

The nucleolus

Ядрышко (Рис. 1b) формируется вокруг кластера ьандемно повторяющихся рибосомальных генов(rDNA генов), которые транскрипбируются с помощью RNA pol I. Гены rDNA геловека локализованы (около 180 копий) в 47 kb rDNA повторах на хромосомах 13, 14, 15, 21 и 22. Области rDNA генов представляют собой ядрышко-организующие области и являются основой структурной организации ядрышка, ответственной за таргетинг всех компонентов процессинга и сборки, необходимых для биосинтеза рибосом.

Ядрышко морфологически подразделено на 3 отдельных компонента, которые отражают векторизованный процесс биогенеза рибосом. Фибриллярные центры окружены плотными фибриллярными компонентми (dense fibrillar components (DFCs)), а гранулярные компоненты радиируют из DFCs (Рис. 2a). В клетках HeLa лишь около 120±150 из of a 540 rDNA генов активны. Обычно ядрышко содержит около 30 фибриллярных центров, каждое из которых концентрируется вокруг 4-х генов. Каждый активный ген ассоциирует с 100±120 задействаванными RNApol I молекулами (примерно 15000 RNA pol I молекул на клетку), каждая синтезирует первичный транскрипт со скорростью примерно 2.5 т.п.н. в мин. Каждый транскрипт длиной примерно в 13.3 т.п.н. транскрибируется примерно 5 мин., чтобы считать ген rDNA целиком.

Активные rDNA гены ограничены периферией фибриллярного центра. Отсутствие рДНК в DFCs указывает на то, что эти ядрышковые субдомены являются местами временного накопления как удиняющихся, так и полной длины первичных транскриптов, высвобождающихся с матрицы. Около 10 отдельных событий расщепления пре-рРНК инициируется в DFCs и заканчивается в гранулярных компонентах. Кроме того около 115 метилирований и конверсий 95 uridines в псевдоуридины пре-рРНК происходит быстро на образующихся транскриптах в DFCs [45] (Рис. 2a и 2b). Когда происходят эти модификации, то вновь синтезированная пре-рРНК покидает место своей транскрипции с радиальными потоками

Рис.2. Organization and functions of nuclear compartments (a) The nucleolus is organized from chromatin-containing rDNA genes, which are anchored in the ?brillar centre (FC). Transcriptionally active rDNA genes are located at the periphery of FCs. Nascent pre-rRNA transcripts are entering DFCs, where they undergo a series of processing steps. Later processing and assembly steps occur in the granular component (GC). (b) Three diaerent functional pathways in the nucleolus. Pre-rRNAs are co-transcriptionally pseudouridinylated, 2-O-methylated and cleaved by a series of processing steps mediated by speci?c snoRNAs until they are fully processed, and, with association of ribosomal proteins and 5 S rRNA, assembled into large and small preribosomal subunits. They are then exported to cytoplasm to form a ribosome (black). The nucleolus is also involved in the initial step of the pre-tRNA maturation pathway. The 5?-end of pre-tRNAs are processed by RNase P before they undergo the additional processing steps in the nucleoplasm (blue). Modi?cation of spliceosomal U6 snRNA also occurs in the nucleolus, mediated by speci?c snoRNAs (red). (c) Three possible models for CB functions. snRNA genes are frequently associated with CBs (top right), and the organelle may play a role in their transcriptional activity. The CB plays a role in maturation of snRNPs, which are exported after transcription to the cytoplasm, where they are assembled into snRNP particles and transiently reimported to the CB, from where they pass through the nucleolus and reach the SFCs (top right and bottom). Preassembly of RNA pol I, pol II and pol III transcriptosomes from newly synthesized subunits may occur in CBs before transcriptosomes are involved in transcription of speci?c genes (left). (d) Recruitment of splicing factors from SFCs. A cycle of phosphorylation and de-phosphorylation controls the association of splicing factors with SFCs. Release of factors from the SFC is promoted by phosphorylation. Accumulation of factors at active genes is facilitated by their interaction with the C-terminal domain of RNA pol II.

События процессинга и модификации первичного 47 S prerRNA ранскрипта обеспечивается приблизительно 200 small nuclear ribonucleoprotein particles (snoRNPs), содержащими метаболически стабильные РНК. Идентифицированы два основных класса малых ядрышковых РНК (snoRNAs), box C/D и box H/ACA. Кроме того необходимы еще некоторые snoRNAs (U3, U8, и U22) для расщепления pre-rRNA. О белках, ассоциированных с snoRNAs или энзимах, которые катализируют эти модификации, известно мало. Дрожжевой белок Cbf5p и его гомолог у млекопитающих, крысиный NAP57, являются кандидатами на роль псевдоуридилаз рРНК. Анализ мутации в Nop1p, дрожжевом гомологе fibrillarin, выявил, что этот белок необходим для метилирования пре-рРНК. Fibrillarin идентифицирован как rRNA 2fi-O-methylase [54] (Рис. 2b).

У дрожжей свыше 60 transacting факторов необходимы для эффективной сборки рибосом. Большинство из этих факторов локализованы в ядрышке, но некоторые присутствуют в нуклеоплазме и даже в комплексах ядерных пор. Упорядоченная сборка рибосомальных белков начинается на первичном пре-рРНК транскрипте и приводит к образованию 90 S пре-рибосомных частиц. Эти частицы подвергаются серии преобразований, которые подразделяют их на предшественники pre-60 S большую субъединицу, содержащую 28 S и 5.8 S рНК и на 43 S малую субъединицу, содержащую 20 S рРНК. Обе субъединицы затем экспортируются отдельно в цитоплазму и в дальнейшем модифицируются, образуя злелые субъединицы рибосом (Рис. 2b). Экспорт рибосомальных субъеджиниц является энергия-подтребляющим и рецептор-опосредованным процессом. У дрожжей мутации, затрагивающие функцию small GTPase,Ran, ингибируют экспорт рибосомальных субединиц, как и мутации некоторых nucleoporins. Кроме того дрожжевой нерибосомальный белок Nmd3p мигрирующий между ядром и цитоплазмой, в случае мутации ведет к накоплению в ядре мутантного белка Nmd3p ингибированию биогенеза 60 S субъединицы и ее экспорта. Идентифицирован фактор экспорта Crm1p, как export receptor для субъединицы 60 S, действие которого обеспечивается адапторным белком Nmd3p. Эти данные указывают на то, что экспорт пре-рибосомальных субъединиц обеспечиваеся специфическими рецепторами и некоторыми членами семейства karyopherin.

Сложность ядрышковой структуры проявляется во время митозов, когда ядрышко дезинтегрируется и собирается вновь, когда дочерние клетки переходят к G" фазе. Центральным событием этого процесса является репрессия синтеза RNA pol I, которая начинается в профазе и продолжается до поздней анафазы. Митотическая инактивация транскрипции рДНК находится под контролем cdc2-cyclin B kinase, которая нарушает взаимодействие между selectivity promoter factor 1 и upstream-binding фактором, и тем самым препятствует формированию pre-initiation комплекса. Ингибирование активности cdc2-cyclin B киназы индуцирует возобновление транскрипции рДНК в митотических клетках, однако. вновь синтезированная первичная 47 S pre-rRNA остается unprocessed, указывая тем самым на независимый механизм активации процессинга постмитотической пре-рРНК. Механизмы транскрипции RNA pol I остаются ассоциированными с ядрышко-организующими регионами между разборкой ядрышек в поздней профазе и сборкой их в поздней анафазе. Частично же processed пре-рРНК, в ассоциации с компонентами процессинга концентрируется в перихромосомальных областях или в многочисленных больших агрегатах, называемых nucleolus-derived foci, распределенными по всей клетке. В поздней анафазе транскрипция RNA pol I реактивируется. Одновременно образуются pre-nucleolar bodies (PNBs) из матерински сохранившихся, частично processed пре-рРНК транскриптов в ассоциации с компонентами процессинга, высвобождаемыми из периферийного слоя деконденсирующихся хроматид. Включение компонент процессинга во вновь формирующиеся ядрышки зависит от реактивированной транскрипции внутри него и порядк, в котором ядрышковые компоненты вступают в ядрышки, соответсвует их пложению на пути процессинга пре-рРНК, указывая тем самым на роль само-организации в процессе сборки.

Ядрышко отвечает не только за биогенез рибосом, но и за сборку и взаимодействие между множественными ribonucleoprotein machines,многие из которых участвуют в синтезе белков. Среди них signal-recognition particle (SRP). 3 из 6 SRP белков (SRP19, SRP68 и SRP72) локализованы в ядрышках с SRP РНК а также в цитоплазме. Это указывает на то, что предварительная сборка SRP происходит во время их прохождения через ядрышко. Более того, установлено, что посттранскрипционные модификации spliceosomal U6 small nuclear РНК происходит в ядрышке (Рис. 2b). 2fi-O-ribose метилирование и псевдоуридилирование с помощью трех ядрышковых box C/D small nucleolar РНК уже доказано и подтверждено, что U6 snRNA созревает прежде, чем покинет ядрышко и поступит в нуклеоплазму. U5 snRNA также проходит через ядрышко, где модифицируется.

Ядрышко играет также роль в созревании некоторых тРНК у дрожжей (Рис. 2b). Удаление пре-тРНК 5'-leader выполняется РНК-содержащей endonuclease, RNase P, которая первоначально обнаруживается в ядрышке. С-терминальный домен белка La человека, который, по-видимому, распознает 5'-ppp концы формирующейся РНК, содержит pre-tRNA в unprocessed состоянии в результате блокирования 5'- processing сайта, распознаваемого RNase P. Фосфорилирование белка La у человека в serine-366 снимает этот блок и способствует созреванию тРНК. Тесное купирование синтеза тРНК и рРНК продемонстрировано у дрожжей. Если синтез транскриптов RNA pol III нарушен у temperature-sensitive RNA pol III мутантов, то отсутствует эффект на синтез мРНК генов рибосомальных белков, продуцируемых с помощью RNA pol II ; однако, образование 25 S, 18 S и 5.8 S рРНК, происходящих из 35 S первичного транскрипта, синтезированного RNA pol I, в основном выключено. Т.обр., мутация RNA pol III затрагивает всю долю синтеза РНК. Дрожжевые клетки, следовательно, м. регулировать процессинг пре-рРНК в ответ на активность RNA pol III. Ядрышко также выполняет регуляторные функции.

HIVregulatory белки, Tat и Rev, располагаются в ядрышках, где белок Rev способен рекрутировать белки на Revexport путь. Так как белок Rev связывает HIV-1 мРНК и облегчает транспорт неполностью сплайсированной и несплайсированной РНК в цитоплазму, о предполагается, что ядрышко играет критическую роль в экспорте HIV-1 мРНК. Подтверждается траффик HIV-1 мРНК через ядрышки инфицированных клеток.

Ядрышки участвуют также в регуляции tumour-suppressor protein, p53. Критическим является взаимодействие p53 с мышиным murine double minute clone 2 oncoprotein (MDM2), который регулирует деградацию p53 в цитоплазме благодаря своему таргеттингу с путем ubiquitination. MDM2 является белком-челноком и его активность регулируется p19ARF белком, который блокирует экспорт MDM2 в цитоплазму и секвестрирование MDM2 в ядрышке. MDM2 локализуется в ядрышках, когда ко-экспрессируется с p19ARF. Таким образом, удержание MDM2 в ядрышке препятсвует его экспорту в цитоплазму для деградации p53. В результате импорт p53 в ядро активируется происходит максимальное накопление p53 в ядре.

The Cajal body

Описанные как ``nucleolar accessory bodies'' Santiago Ramon y Cajal эти цитоплазматические тела были названы как coiled bodies в результате их характерного вида как треугольника из скрученных фибриллярных нитей диаметром 40±60 nm. Недавно они в честь открывателя названы Cajal body.

CBs это небольшие сферические структуры, которые обычно присутствуют в 1±5 копии на ядро и имеют размер 0.1-1.0 lm (Рис. 1c). CBs содержат большое число компонентов, включая spliceosomal snRNPs, U3, U7, U8 и U14 snoRNAs, основные транскрипционные факторы TFIIF и TFIIH, фактор, стимулирующий расщепление, и фактор специфичности полиаденилирования , а также ядрышковые компоненты fibrillarin, Nopp140, и белок B23. Функция СВ неизвестна. CBs обычно обнаруживаются в нуклеоплазме, но могут встречаться и в ядрышках, напр., в клетках карциномы груди человека, в коричневых адипоцитах и гепатоцитах спящих сонь. CBs могут проходить через ядрышко, это мобильные структуры, перемещающиеся по всей нуклеоплазме. Во всех случаях они ,по-видимому, способны перемещаться с периферии ядрышек внутрь ядрышка. 2 класса CBs охарактеризованы в живых клетках, большие (CB) и малые (называемые mini-CB).

Челнок между ядром и цитоплазмой фосфопротеин, p80-coilin, идентифицирован как специфический маркер CBs [88]. Образование CBs вне ядрышка м.б. индуцировано одиночной точечной заменой (serine в aspartate в положении 202) во временно экспрессирующемся белке p80-coilin. Кроме того, Nopp140, который взаимодействует с p80-coilin in vitro, присутствет как в CBs так и ядрышке и влияет на обеи структуры,если временно экспрессируется ву нефункциональных мутантов. Более того, обработка клеток HeLa специфическим serine/threonine protein phosphatase ингибитором, okadaic acid, ведет к перераспределнию p80-coilin в ядрышко. Итак, CBs и ядрышко функционально связаны. CBs могут вовелкаться в транспорт и созревание snRNPs и snoRNPs (Рис. 2c). Sleeman and Lamond установили, что GFP-tagged сердцевина Sm белков, ассоциированная с U-snRNA ре-импортируется в ядро, они впервые локализовали CBs прежде чем они пройдут через ядрышко и достигнут своего финального места назначения в SFCs. Подавление экспорта вновь транскрипбированной U snRNA из нуклеоплпзмы в цитоплазму и ре-импорт во вновь собираемые snRNPs в ядре с помощью leptomycin B, вызывает прогрессивное ослабление U snRNPs в CBs. Кроме того, когда p80-coilin immunodepleted в экстрактах яиц Xenopus перед сборкой в пронуклеусы, CBs все еще формируются внутри пронуклеусов, но в них отсутствует coilin и Sm белки. Это подтверждает специфическую роль CBs в пути созревания snRNPs и сборки в RNP комплексы. Меченные U3, U8 и U14 snoRNAs временно накапливались в CBs и лишь позднее в ядрышках. Установлено, что CBs ассоциируют со специфическими хромосомными локусами (Рис. 2c). Они часто обнаруживаются ассоциированными с тандемно повторяющимися генами гистонов на хромосомнах типа ламповых щеток у тритонов и с тандемно повторящимися генами, кодирующими U1, U2, U3, U4, U11, и U12 sn(o)RNAs в интерфазных ядрах млекопитающих. Их ассоциация зависела от транскрипционной активности и числа копий этих генов. Связь CBs с этими хромосомными сайтами обеспечивается взаимодействием с формирующимися транскриптами snRNA. Установлено, что CBs содержат в 45 kDa c-субъединицу proximal element sequencebinding transcription factor (PTF), который специфичен для snRNA генов вместе с TBP и субнабором RNA pol II субъединиц. Это указывает на то, что CBs м. функционировать как центры распределения, которые рекрутируют спцифические факторы транскрипции и процессинга в сайты транскрипции snRNA. Кроме того, CBs м. добавлять RNA 3'- processing факторы к соседним генам из специфических доменов , ассоциированных с CBs, называемых cleavage bodies [102,103]. CBs, по-видимому, также преимущественно ко-локализуются с локусами гистонов. Единственной причиной этой ассоциации м.б. то, что CBs поставлют факторы, которые способствуют экспрессии гистоновых генов. Повышенное количество CBs в поздней G" и S фазе м. отражать повышенный уровень экспрессии гистоновых генов.

Альтернативная, но не эксклюзивная, модель функции СВ предполагает, что CBs являются местом сборки транскрипционной кухни ядра (Рис. 2c). Наблюдение, что факторы, связанные с транскрипцией, capping, сплайсингом, полиаденилированием и расщеплением пре-мРНК, первоначально оказываются в CBs ооцитов, делает возможным, что RNA pol II machinery предварительно собирается в CBs с другими элементами machinery процессинга для формирования транскрипционно компетентных больших мультиединичных комплексов, называемых polymerase II transcriptosomes. Установлено, что gemins, которые играют роль в сборке и регенерации snRNPs, взаимодействуют с С-терминальным доменом RNA pol II через РНК helicase A. Локализация некоторых компонентов pol I и pol III в CBs указывает на то, что CBs могут также функционировать как платформа для сборки pol I и pol III transcriptosomes.

Рис.3. Chromosome territories and gene activation Genes are found both at the periphery as well as within chromosome territories. Inactive genes are frequently associated with heterochromatin. In contrast, transcriptionally competent genes are displaced from heterochromatin, but their chromatin structure may still not be conducive to transcription. Constitutive acetylation of core histones might contribute to maintaining a particular chromatin state. Upon establishment of a particular acetylation pattern, the gene might become transcriptionally active.

PML bodies

PML тельца - небольшие сферические домены, известные под разными именами, включая nuclear domain 10, Kremer bodies, and PML oncogenic domains. PML тельца разбросаны по всей нуклеоплазме, а клетки обычно содержат 10-30 PML bodies на ядро, размерами 0.2-1.0 lm, флюктуирующими по числу и размерам во время клеточного цикла. PML bodies часто обнаруживаются ассоциированными с тельцами Cajal и тельцами расщепления (cleavage), иногда образующих триплеты. Ультраструктурно этот ядерный домен напоминает плотное кольцо, позитивно красящееся anti-PML антителами. Кроме того PML содержат многие компоненты, включая Sp100, retinoblastoma protein Rb, Daxx и Bloom syndrome protein, BLM. PML bodies участвуют в терминальной дифференцировке, регуляции транскрипции, в ядерных хранилищах, котроле роста и апоптозе.

PML bodies при acute promyelocytic leukaemia (APL) разрушены в клетках благодаря образованию слияния белков между PML белком и рецептором ретиноевой кислоты, и как следствие этого реципрокная хромосомная транслокация в t(15 ;17) q(22;21). Разрушение bodies коррелирует с APL и м. указывать на вовлечение PML bodies в дифференцировку промиэлоцитов. Применение ретиноевой кислты вызывает повтоное появление PML bodies и ремиссию канцера. Предполагается, что PML bodies играют роль в регуляции транскрипции. Считается, что PML bodies могут определять высоко локальные концентрации экзогенно внесенных специфических белков и потенциально регулируют их транскрипцию.

Показано, что PML bodies тесно ассоциируют с сайтами вирусной транскрипции и репликации на ранних стадиях инфекции, что некоторые вирусные белки накапливаются в PML bodies и вызывают их разрушение. Следовательно, PML bodies м. выступать как ядерные депо-хранилища и что развертывание и сворачивание различных белковых компонентов должно поддерживать их средне статистический уровень. Накапливаемые белки м. не выполнять своей первичной функции в этих сайтах, а лишь накапливаются для поддержания внутриядерного гомеостатического баланса, который м.б. нарушен гормональным дисбалансом , вирусной инфекцией, действием интерферона или теплового шока. Очевидно, что белковые компоненты в PML bodies поступают и выходят из этого ядерного домена в ответ наизменения их концентрации в ядре. Так было установлено, что CBP (CREB-binding protein, где CREB это cAMP-response element- binding protein) быстро проходит через PML bodies, тогда как сам PML белок и Sp100, еще один важный компонент PML bodies, в основном иммобильны внутри PML body. Очевидно PML и Sp100 являются структурными белками PML bodies, которые закрепляют другие компоненты, такие как CBP, или альтернативно, PML и Sp100 остаются внутри PML body т.к. выполняют специфическую функцию внутри этой структуры.

Miscellaneous nuclear bodies

Ядро содержит также большое количество менее охарактеризованных, в основном малых структур. Два из них OPT (Oct1, PTF транскрипции) домен и perinucleolar compartment (PNC) наиболее интересны.

OPT домены до 1.5 lm в диаметре, их число варьирует от одного до очень небольшого количества. OPT домены собираются во время G" и исчезают в ранней S фазе. Домены транскрипционно активны и ассоциируют преимущественно с хромосомами 6 и 7, указывая тем самым, что их образование м.б. связано с транскрипцией определенных генов в этих хромосомах.

PNC - это уникальный ядерный домен нерегулярной формы, расположенный на периферии ядрышка. Ультраструктурно PNC электрон-плотные структуры, состоящие из множественных нитей, и находящиеся в непосредственном контакте с поверхностью ядрышка. PNC содержит несколько snRNAs, транскрибируемых с помощью RNA pol III, включая RNase MRP, RNase P и RNase Y RNAs, и polypyrimidine-tract-binding белок. Функция PNC неизвестна, но присутствие формирующейся РНК и факторов процессинга РНК указывает на участие в транскрипции и процессинге РНК. Используя polypyrimidinetract- binding protein-GFP слитый белок, наблюдали, что PNC является динамичпеской структурой, которая подвержена малым движениям на периферии ядрышка. Во время митоза PNC диссоциирует в профазе и образуется снова в поздней телофазе, когда постмитотические ядрышки уже собраны. Присутствие PNC тесно коррелирует с онкогенной трансформацией.

Chromosomes and nuclear compartmentalization

Хромосомы не рассматриваются как ядерные компартменты, их топологическая организация в интерфазном ядре все еще неясна. Хромосомы занимают определенные объемы ядра, т. наз. chromosome territories (Рис. 1d). Внутри хромосомной территории активные и неактивные гены располагаются на периферии территории, тогда как некодирующие последовательности чаще всего обнаруживаются внутри (Рис. 3). Наблюдение, что некоторые акивные генные локусы и активные сайты транскрипции кардтируются во внутренних областях указывает на то, что хромосомные территории являются `porous' и что активаторы транскрипции могут достигать внутренних сайтов. Белки размером до 500 kDa могут легко проходить черех все ядро. Пространства между хромосомами становятся видимыми при избыточной экспрессии vimentin, который индуцирует образование vimentin arrays между хромосмными территориями. Избыточная экспрессия non-chromatin-binding белка EAST (enhanced adult sensory threshold) у Drosophila ведет к образованию внехромосомного белкового домена. Итак, хромосомы сложены в трехмерную флексибельную сеть, которая позволяет позиционированным генам и хромосомным доменам выполнять регуляторную функцию в экспрессии генов. Большинство типов клеток экспрессирует относительно небольшую фракцию своего генома. При позиционировании генов в регионы хромосом, которые недоступны факторам, ремоделирующим хроматин, или активаторам транскрипции, субнаборы генов будут молчать, тогда как доступные наборы генов готовы к экспрессии.

Роль ядерной компартментализации в регуляции активности генов подтверждается наблюдением, что во время процессов дифференцировки архитектура хроматина в ядре драматически меняется. Во время дифференцировки нейрональных PC12 клеток, напр., чувствительный к ДНКазе хроматин и пре-мРНК SFCs и Cajal bodies, транслоцируется из внутренних областей на периферию. Позиционирование хромосом внутри ядра может влиять на экспрессию определенных генов, так в клетках самок транскрипционно неактивная Х хромосома всегда обнаруживается на периферии клетки.

Эффекты позиционирования скорее всего действуют на локальном уровне скорее, чем оказывают эффект на всю хромосому (Рис. 3). Позиционирование генов вблизи гетерохроматиновых регионов способствует молчанию генов. Так, в дифференцирующихся В-клетках , транскрипционно репрессированные гены, обычно находятся в ассоциации с гетерохроматином. У дрожжей теломерные последовательности принуждаются к молчанию гетерохроматинизацией на периферии ядра. Следовательно, позиционирование в ядре и специфическое позиционирование генов в гетерохроматине м.б. критическим для для аккуратного выполнения программ экспрессии генов. Позиционирование генов вне гетерохроматина недостаточно для их активирования (Рис. 3). Чтобы быть активированными транскрипционно репрессированный хроматин должен быть ремоделирован. Идентифицированы многочисленные хроматин-ремоделирующие активности, из них наиболее важные acetyltransferases и ATP-dependent remodellers.

NUCLEAR DYNAMICS

Клеточное ядро млекопитающих является высоко динамичной органеллой даже в интерфазе.

Chromatin dynamics

В интерфазном ядре отсуствуют существенные движения хроматина. В ядрах дрожжей выявлены лишь ограниченные Броуновские движения. Это указывает на позиционную стабильность. Однако биохимически выявляется динамическая перестройка хроматина.

Самые нижайшие единицы хроматина это нуклеосомы, состоящие из стержневых гистонов H2A, H2B, H3, и H4, сцепленных с помощью линкерного гистона H1. [4]. Нити связанных нуклеосом спирально закручены в 10 nm волокно, которое в свою очередь сложено в 30 nm волокно. Это волокно сложено в высшего порядка хроматиновые петли. Система, базирующаяся на GFP, делает видимыми в интерфазном ядре волокна хроматина диаметром приблизительно в 100 nm, наглядно демонстрируя существование в интектных клетках структур хроматина высшего порядка. Эти структуры относительно неподвижны. Однако при форсировании избыточной экспрессии VP16 трансактиватора меченные хроматиновые домены расправлялись, скорее всего в результате ремоделирования хроматина. Сходные наблюдения получены и при использоании др., более физиологических систем.

RNA dynamics

Механизмы транспорта молодой мРНК от места своей транскрипции и последующего экспорта из ядра интенсивно изучались. Согласно одной модели вновь синтезированная РНК движется за счет активного направленного процесса к ближайшей ядерной поре. Эта`gene-gating' модель согласуется с наблюдением удлинненых треков мРНК от места транскрипции. Более того у Drosophila некоторые РНК транскрипты векторизованно транспортируются лишь в апикальную часть цитоплазмы. Первоначально наблюдаемые треки РНК идут в случайном направлении, указывая на то, что экспорт РНК не является направленным процессом. Неравное же распределение РНК у Drosophila скорее всего обусловлено цитоплазматическими `retention factors ', скорее, чем векторизованным экспортом. Альтернативой активному процессу экспорта является то, что РНК диффундирует от места транскрипции к ядреным порам. Визуализация мРНК путем гибридазации с олигонуклеотидами показала ненаправленное , не нуждающееся в энергии движение полиаденилированных РНК через ядро. Диффузия является очень эффективным способом транспорта РНК, сравнимым по скорости с диффузией в растворах. Однако окончательно не исключен активный и направленный транспорт РНК.

Protein dynamics

Каждое ядро клеток млекопитающих с типичным диаметром примерно в 10 lm содержит ДНК длиной примерно в 2 м. Очевидно, что ДНК д.б. кондесирована, чтобы уместиться в ядре. Установлено что в живых клетках белки могут

Рис.4. Protein dynamics in the cell nucleus (a) Proteins roam the cell nucleus and scan for potential binding sites. Before ?nding a speci?c, high-a?nity binding site, each protein is likely to interact with many non-speci?c, low-a?nity binding sites. (b) Chromatin-binding proteins, both structural proteins as well as transcriptional activators, only transiently interact with chromatin. The periodic removal of structural proteins allows the access of chromatin-remodelling activities to chromatin. These activities, in turn, have only short residence times on chromatin. (c) Nuclear compartments are in constant Oux. The morphological appearance of a compartment is dependent on the on/oa rates of its components. Splicing factors continuously dissociate and reassociate with SFCs. After dissociation, they search for unspliced RNA to bind to. This establishes a steady-state equilibrium. If no unspliced transcripts are available, the splicing factors spend less time outside of the compartment before they return and the net inOux of proteins is increased. Splicing factors accumulate in the compartment, and it appears morphologically more round.

перемещаться пассивно с помощью диффузионного механизма по всему ядру. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) эксперименты показали, что многие ядреные белки высоко подвижны в ядре(Рис. 4a). Высокая подвижность всеобщее свойство ядерных белков (транскрипионные факторы, pre-mRNA splicing факторы, энзимы процессинга рРНК, энзимы репарации ДНК, 3'-processing факторы и апоптические каспазы). Для большинства белков подвижность не нуждается в энергии (в форме АТФ) и не меняется при снижении температуры. Все это указывает на процесс пассивной диффузии. Белок или протеиновый комплекс примерно в 500 kDa м. пересекать ядро в течение менее 1 мин. Важно, что не нужны ни сигналы, ни рецепторы сигналов для доставки белков к мишеням. Они движутся в поисках мест свзывания высокого сродства (Рис. 4a).

В отсутствие повреждений ДНК энзимы репарации ERCC1/XPF свободно перемещаются в ядре. После индукции повреждения ДНК белок временно иммобилизируется, т.к. связывается с местом повреждения. После завершения работы он снова диссоциирует и становистя мобильным. Сходным образом ведут себя факторы репликации ДНК.

Обычно считается, что связанные с хроматином белки (chromatin-binding proteins) стабильно и статически связаны с хроматином. Это верно для стержневых гистонов, все остальные связанные с хроматином белки и компоненты транскрипционной кухни ассоцируют лишь временно с хроматином (Рис. 4b). Линкерный гистон H1, который располагается вне нуклеосом, но действует как структурный белок хроматина, динамически обменивается между сайтами связывания. Каждая молекула H1 располагается в течение минуты на хроматине и диссоциирует. Сходным образом друга группа структурных хроматин-связанных белков, high-mobility group proteins, ассоциирует лишь временно с хроматином, менее 5 сек. Во время диссоциации H1 открывается доступ и активаторы транскрипции могут достичь хроматина и ремоделировать его (Рис. 4b). Это согласуется с тем, что ремодулирующая активность SNF/SWI может действовать только после удаления гистона H1 с хроматина. Гистоны и белки high-mobility group являются широко распространенными хроматин-связывающими белкми, они не связываются с ДНК сиквенс-специфическим способом. Связываются ли активаторы транскрипции, которые распознают свои специфические чувствительные элементы в промоторах, более тесно с хроматином? FRAP эксперименты со стероидными рецепторами указывают на то, что даже специфические ДНК-связывающие белки лишь временно взаимодействуют со своими мишенями. The glucocorticoid receptor (GR) связывает ДНК в специфическом GR-чувствительном элементе и регулирует транскрипцию путем взаимодействия с компонентами транскрипционого механизма. Photobleaching эксперименты, позволяющие видеть специфические сайты в живых клетках, ясно демонстрируют, что хотя GR молекулы присутствуют в promoterbinding сайтах пока ген-мишень активирован, активирующие GR molecules постоянно и быстро замещаются, оставаясь лишь в течение нескольких сек. на GR-response элементе, подтверждаая `hit-and-run' способ связывания. Идентичные результаты получены с другим стероидным рецептором , эстрогеновым рецептором. Разные лиганды существенно меняли поведение динамического связывания рецепторов.

Compartment dynamics

Компартменты в ядре м. наблюдаться длительно несмотря на отсуствтвие мембранных границ. Они являются интерными структурами, однако внутренняя динамика компартментов обнаруживает быстрые постоянные обмены белков между компартментами и нуклеоплазмой (Рис. 4c). Эти обмены происходят во всех компартментах, включая nucleolus, SFCs, CB, PNC и хит-шоковые гранулы. ТОк белков через эти компартменты заметный. Из-за высокого тока белков компартменты м. рассматриваться как отражения статического равновесия. Морфология каждого компартмента предопределяется его residents ' on-and-off rates (Рис. 4c). Эти скорости, в свою очередь, предопределяются функциональным статусом резидентных белков, как внутри, так и вне компартмента. То что это довольно хрупкое равновесие иллюстрируется SFC. В обычной растущей клетке эти компартменты имеют нерегулярную форму и диаметр около 1 lm, а факторы сплайсинга пре-мРНК постоянно диссоциируют из них в поисках мишеней. Если количество доступных транскриптов снижено ингибированием транскрипции, то сплайсинг-факторы проводят меньше времени вне компартмента, в результате он увеличивается (Рис. 4c).

A possible role for self-organization in nuclear architecture

Итак, стабильные конфигурации могут генерироваться в ядре путем взаимодействия высоко динамичных компонентов (Рис. 5). Нет прямых указаний на роль само-организации в закладке и поддержании ядерной архитектуры, но многочисленные наблюдения согласуются с этой гипотезой. описанная выше реакция SFCs на доступность pre-mRNAs, иллюстрирует самоорганизующие свойства SFC. Компоненты Cajal bodies, PML bodies и gems демонстрируют само-ассоциативные свойства, согласующиеся с их само-организацией. Морфологическая интеграция

Рис.5.Stable configurations can be generated from dynamic interactions Proteins are highly mobile within the nucleus. Compartments appear to contain a stable composition of proteins, but each component of the compartment is continuously and rapidly exchanged. Sites on chromatin appear to be stably occupied by proteins, but each binding protein is continuously and rapidly exchanged. Protein complexes appear to be made up of a stable components, but each component may be periodically exchanged.

ядра существенно зависит от его транскрипционной активности. После ингиирования транскрипции ядрышко распадается и компоненты ядрышка ассоциируют друг с другом, указывая, что нормальная организация ядрышка покоится на преимущественном взаимодействии его белков с рРНК. Напротив, введение же рДНК минигенов вызывает образование мини-ядрышек в нуклеоплазме, это указывает на то, что транскрипция рДНК существенна для сборки ядрышка. В конце митозов, когда транскрипция рДНК еще не возобновилась, компоненты ядрышка накапливаются в востанавливающемся ядре в PNBs. После возобновления транскрипции компоненты ядрышка накапливаются в сайтах транскрипции рДНК. Порядок накопления отражает порядок их вовлечения в процессинг рРНК, указывая тем самым, что их ` targeting' непосредственно зависит от их функции. FRAP эксперименты демонстрируют, что во время М фазы ядрышковые белки быстро обмениваются между PNBs и нуклеоплазмой. Сходная ситуация в SFCs, ядрышковые факторы постоянно диссоциируют из PNBs в поисе соотв. сайтов вязывания.

Роль само-организации в детерминации архитектуры ядра и функции не ограничена компонентами ядрышка, она используется при формировании сайтов транскрипции и репликации. Факторы репликации гомогенно распределены по ядру, но формируют отдельные фокусы во время S-фазы из-за их связи с местами репликации. Факторы диссоциируют из фокусов, когда репликация в определенной области заканчивается. Факторы диффундируют в поисках нового места репликации, с которым они соединяются и образуют новый фокус. Аналогично транскрипционные факторы диссоццируют из мест транскрипции и диффундируют в ядре и ассоциируют с новым местом транскрипции.

Functional architecture in the cell nucleus

Nuclear couple

NUCLEAR COMPARTMENTS AND THEIR FUNCTIONS