Протеолитически активные сайты протеасом находятся в цилиндрической энзиматической камере - 20S сердцевине — которая имеет 19S rрегуляторный комплекс на своем конце (Рис.1). Протеосома распознает большинство своих субстратов с помощью MULTI-UBIQUITIN TAG (см. page 169), хотя имеются исключения (см page 188). Один из 19S регуляторов функционирует, распознавая multi-ubiquitin сигнал.

(Рис.1.) | Proteasome composition.

Этот комплекс из одной 20S и двух 19S единиц формирует 26S proteasome. 19S регулятор имеет два субъединичных компонента, 'base' и 'lid'. Base, которая состоит из 6 ATPases из TRIPLE-A FAMILY плюс двух non-ATPase субъединиц, связанных с 20S каталитической сердцевиной. ATPases обладают CHAPERONE -подобной активностью и, как полагают, помогают расправлять субстрат и направляют его в 20S сердцевину, тем самым контролируя доступность субстрата потеазам внутри. 8 различных non-ATPase субхединиц 19S регулятора образуют крышку, функция которой неясна.

20S частица представлена 4 сложенными кольцами, каждое из которых содержит 7 эволюционно родственных, но неидентичных субъединиц. Они распадаются на 2 категории αи β, на базе сходства последовательностей. α-subunits (α1–α7), которые формируют 'gates'через которые субстрат вступает и продукты высвобождает. Два внутренних кольца содержат β-субъединицы (β1–β7), 3 из которых β1, β2 β5 — harbour 6 активных сайтов (по две копии каждая; см. Рис.1). Каталитически активные остатки являются одиночными треонинами, расположенными на amino концах трех β-subunits, и характеризуют протеосомы как членов семейства AMINO-TERMINAL NUCLEOPHILE (NTN) HYDROLASES . Треонинам активного сайта β-субъединиц предшествуют pro-sequences с разными последовательностями и длиной. Во время сборки 20S протесом эти pro-sequences удаляются с помощью двухступенчатого механизма: сначала соседние активные сайты расщепляются внутри pro-sequences,затем аутокатализ, генерирующий active-site threonine функционального 20S комплекса. Каждая из трех β-субъединиц имеет различные предпочтения для расщепления после кислых, щелочных >или гидрофобных остатков, соотв.

Antigenic-peptide quality

Гены MHC class I крайне полиморфны с несколькими сотнями аллелей. Белковый продукт каждого аллеля связывается с уникальным набором пептидов с длиной в среднем 8–10 аминокислот. Финальная генерация пептидов, нагружаемых на белки MHC class I , многосупенчата (Рис.2), animated online), каждая ступень вносит вклад в селективность и эффективность иммунного ответа.

(Рис.2.) | Antigen processing и presentation.

Пептиды, связываемые белком MHC class I , появляются благодаря взаимодействию боковых цепочек пептидов с карманами в пептид-связывающей борозде MHC белка. Специфичность такого взаимодействия обеспечивается ANCHOR RESIDUES . Один из них всегда локализован на С-терминальном конце пептида, фиксируя пептид на краю MHC-пептид-связывающей борозды. Другой или два якорных остатка обычно расположены вблизи N-конца пептида. Чтобы пептид м. присоединиться позиции якорных остатков должны быть заняты специфическими остатками, определяемыми MHC class I HAPLOTYPE . Тот факт, что С-терминальная якорная позиция обогащена специфическими гидрофобными или основными остатками, и большинство пептидов длинов 8-10 остатков, указывает на то, что существует протеолитическая кухня с определенной предиспозицией для продукции таких пептидов.

Протеосомы удовлетворяют этим потребностям и являются основной машиной генерации антигенных пептидов , но в некоторых специфических случаях другие протеазы (такие как tripeptidyl peptidase II, furin и thimet oligopeptidase)также м. вносить свой вклад в пептидный пул для MHC class I. Однако, благодаря своей избирательной расщепляющей специфичности, эти протеазы м. генерировать только ограниченный набор пептидов, которые пригодны для связывания их MHC, и, следовательно не м. б. важными для продукции антигенных пептидов.

'Hide и seek' with substrates

Доступность пептидов, которые связываются молекулами MHC class I с высоким сродством, является критической для возникновения клеточной иммуногенности. Превалирует мнение, что клеточные белки, которые направляются на деградацию, как часть нормального клеточного белкового обмена, являются основным источником антигенных пептидов. Однако, большинство из этих пептидов происходит из белков , которые компартментализованы и/или метаболически стабильны. Как протеосомы получают доступ к таким белкам?

Известно, что свыше 40% вновь синтезируемых белков деградирует в минуту синтеза. На самом деле, большая пропорция полипептидов м. никогда не достигать своей нативной структуры из-за ошибок в трансляции или дефектов в складывании посттрансляционых белков. В последнее время было установлено, что эти 'non-functional proteins', известные также как defective ribosomal products (DRiPs), быстро ubiquitylated и деградируются протеасомами. DRiPs должны, следовательно, представлять собой важный источник пептидов для MHC class I (Рис.3).

(Рис.3.) | The DRiP model.

Механизм процессинга, связанный с трансляцией, гарантирует, что клеточная иммунная система имет доступ к своим субстратам, прежде чем они достигнут своего финального места предназначения внутри или снаружи клетки и два наблюдения подтверждают это. Первое это то, что активность TRANSPORTER ASSOCIATED WITH ANTIGEN PROCESSING ( TAP) — который транспортирует антигенные пептиды из цитоплазмы в ER — зависит от непрерывного белкового синтеза, указывая тем самым, что для MHC class I пептиды возникают преимущественно из вновь синтезированных белков. Второе это то, что протеосомы обнаруживаются в тесной ассоциации с полирибосомами, это делает гипотезу координированного трансляционного процессинга белков и образования пептидов привлекательной.

Immunoproteasome formation

Одной из характеристик пути презентации антигенов MHC class I (Рис.2) является то, что некоторые его компоненты индуцируются с помощью CYTOKINE interferon-γ (IFN-γ ). Сюда входят MHC class I тяжелая цепь, TAP белки, некоторые из 20S протеосомных субъединиц и протеосомный активатор PA28 — белковый комплекс, который м. влиять на поведение протеосом путем замены одного из двух 19S регуляторных комплексов. <вшм>Три из 20S протеосомных β-субъединиц — все с протеолитической активностью — являются IFN-γ i>индуцибельными: β1i (LMP2), β5i (LMP7) и β2i (MECL-1). Вместе они обозначаются как immunosubunits, и их включение в сердцевину 20S требует их сборки de novo. Как результат новые 20S комплексы образуются, в которых конституитивные протеазы , β1 (δ), β2 (ζ) и β5 (MB1), замещаются тремя иммуносубъединицами (Рис.4).

(Рис.4.) | Formation of the immunoproteasome.

Сборка и созревание 20S сердцевины очень упорядоченное многоступенчатое событие. Ему ассистируют хапероновые белки (Рис.4), включая hsc70 и proteasome maturation protein (POMP), который формирует часть высокого молекулярнго веса 'proteasome precursor complex'. Этот процесс, по-видимому, эволюционно законсервирован , т.к. дрожжи имеют хаперон, Ump1 , который м. рассматривать как функциональный гомолог POMPпозвоночных.

Включение иммуносубъединиц является COOPERATIVE : β2i инкорпорируется только, если присутствует β1i, тогда как β1i инкорпорация не зависит от β2i (Рис.4). Субъединица β5i, по-видимому, влияет и поддерживает кинетику формирования иммунопротеосом. Эта кооперативность указывает на то, что иммуносубъедлиницы включаются вместе, гарантируя, что сформируется определенная популяция протеосмных комплексов с измененными свойствами расщепления. Однако, ситуация возможно сложнее:IFN-γ не только индуцирует образование чистых иммунопротеосом, но и 20S комплексов, в которых иммуносубъединицы и конституитивные субъединицы сосуществуют. Цитокиновая индукция, следовательно, увеличивает функциональное разнообразие протеосомного пула в клетке, позволяя ему продуцировать широкий спектр пептидов для предоставления иммунной системе.

Manipulating peptide quality

КакIFN-γ влияют на качество пептидов, сгенерированных с известных вирусных EPITOPES . Напр., когда клетки HeLa инфицированы vaccinia virus, экспрессирующим основной антиген hepatitis B virus (HBV), то они презентируют один эпитоп только после стимуляции с помощью IFN-γ. Анализ 20S протеосом, усваивающих эптоп, содержащий синтетические пептиды, показал, что только иммунопротеосомы высвобождают этот эпитоп эффективно.

Предполагается, что инкорпорация иммуносубъединиц м.б. результатом незначительных структурных изменений всего 20S комплекса и это в свою очередь влияет его свойства процессинга. Напр., в случае эпитопа HBV хотя совместное присутствие всех трех иммуноединиц является обязательным для генерации эпитопа, инактивированная β5i субъединица (в которой> Thr1 мутирован в Ala — T1A) также поддерживает генерацию эпитопа. Это указывает на то, что инкорпорация β5i влияет на структурную архитектуру 20S протеосом и потому влияет на cleavage-site preferences β1i и β2i активных сайтов. Инактивированная β1i субъединица, несущая T1A мутацию ведет себя сходным образом. Идея, что иммуносубъединицы меняют структуры протеосом, подтверждается также измененными хроматографическими свойствами иммунопротеосом, обусловленными изменениями их поверхностных зарядов.

Изучение иммунопротеосом путем индукции их с помощью> IFN-γне идеально, т.к. этот цитокин стимулирует экспрессию многих генов, которые влияют на презентацию антигенов. Эффект иммунопротеосом на продукцию 14 MHC class I эпитопов — в основном вирусныхl — проанализирован (Табл.1). данные нелегко интерпретировать: высвобождение некоторых эпитопов существенно улучшается с помощью — или абсолютно зависит от — присутствия иммунопротеосом, но генерация других не затрагивается вовсе, а для двух эпитопов возможно даже негативное влияние со стороны иммуносубъединиц

(Табл.1) | Effects of immunoproteasomes и PA28 on MHC class I antigen processing

Как это объяснить? В некоторых случаях легкие отличия в расщепляющей активности, обусловленные присутствием иммуносубъединиц, м.б. ответственны. С другой стороны, иммуносубъединицы м. индуцировать слабые конформационные изменения 20S протеосом с существенными последствиями для генерации определенных эпитопов.

Предполагается, что иммуносубъединицы м. изменять субстрат, оказывающийся внутри протеосомы, меняя расщепляющиеся последовательности субстрата. Другая возможность, что слабые структурные изменения м. нарушать свойства субстрат связывающей борозды, которая идет от активных сайтов иммуносубъединиц вдоль поверхности полости в направлении просвета barrel. Комбинируясь со слега измененными свойствами активного сайта, эти эффекты м. изменять восприимчивость субстрата к протеолизу >или использование сайта расщепления, причем изменяются как качественно, так и количественно пептидные продукты (Рис.5.).

(Рис.5.) | How immunoproteasomes affect peptide quality.

Эта модель не исключает возможности, что генерация определенных эпитопов будет оставаться неизменной, т.к. связывающее сродство и способ связывания с субстрат-связывающим сайтом будут зависеть от аминокислотных последовательностей processing intermediate и особенно от последовательностей в и вокруг MHC class I epitope.

The proteasome activator PA28

Другим IFN-γ-индуцибельным компонентом протеосомной системы, который влияет на презентацию антигена является proteasome activator PA28, известный также как 11S регулятор. Это комлпекс в 180–200 kDa состоящий из двух IFN-γ-индуцируемых субъединиц — PA28α и PA28β — которыe очевидно образуют комплекс α₃β₄. PA28 присоединяется АТФ-независимым способом к наружным α-кольцам 20S протеосом. Тот факт, что обе субъединицы контролируются IFN-γ указывает на то, что их in vivo функция связана с процессингом протеосомных антигенов. Клеточные системы, которые экспрессируют PA28 независимо от IFN-γ показывают, что PA28 улучшают презентацию некоторых вирусных антигенов в отсутствие увеличенного общего обмена белков или обмена вирусного белкового субстрата. Более того, это улучшение презентации пептидов независит от присутствия иммуносубъединиц в 20S протеосомах, исключая возможность того, что PA28 м. выполнять свою функцию в результате увеличения формирования иммунопротеосом.

Но подобно иммуносубъединицам PA28 одинаково не влияет на презентацию всех MHC class I эпитопов (Table 1). Ранее предполагалось, что PA28 каким-то образом облегчает события двойного расщепления, но это обнаружено только для избранных субстратов. Установлено, что связывание PA28 с 20S сердцевиной увеличивает сродство субстрата без изменения максимальной активности ферментного комплекса и что PA28 активирует протеосомы путем усиления или потребления субстрата или высвобождения пептидных продуктов. В гетеромерных 19S–20S–PA28 протеосомных комплексах, которые формируются после IFN-γ стимуляции, 19S регулятор является лимитирующим скорость компонентом по отношению к связыванию и транспорту субстрата, указывающим на то, что PA28 облегчает высвобождение продукта.

Controlling the gates

С rystal structure of the Saccharomyces cerevisiae 20S proteasome выявляет, что ее ворота закрыты в отсутствие регуляторных частиц (Рис.6). Причиной этого является то, что N-терминальные 'хвосты>' α->субъединиц проецируются в ворота и блокируют вход к каталитической полости. X-ray structure analysis of mutant proteasomes, содержащих укороченную α3 субъединицу из-за отсутствия первых 10 остатков, показывает, что α3 N-концы являются критическими для запирания ворот,т.к. они взаимодействуют с N-окончаниями и всех др. α-субъединиц. Фактически, мутирующий Asp9 в Ala дает в результате активированные 20S протеосомы, это указывает на то. что одиночный aspartyl остаток является критическим для поддержания закрытой конформации.

(Рис.6.) | The proteasome gating mechanism.

In vitro, это латентное или инактивированное состояние м.б. ревертиовано низкими конц. sodium dodecyl sulphate, lipids или тепловым воздействием, указывая тем самым, что эти агенты м. открывать ворота. Но что открывает ворота in vivo? Присоединение или 19S регулятора или PA28 к двум наружным α-кольцам обусловливает сильную протеолитическую активацию латентной 20S протеосомы.В случае19S регулятора, пропускной механизм скорее всего зависит от АТФ, т.к. тепловой шок блокирует 20S протеосомы в их латентном состоянии и нарушает полную активацию 26S протеосом с помощью АТФ. Как ворота открываются? X-ray structure of PA28 bound to the 20S proteasome показала, что присоединение PA28 ведет к тому, что N-терминальные хвосты α-субъединиц перемещаются вверх в полую сердцевину PA28, тем самым полностью открываются ворота (Рис.6.). Индуцирует ли 19S регулятор сходные конформационные изменения?

Effect of gating on peptide quality

In vivo, скорость-ограничивающая ступень в деградации белка с помощью 26S протеосом зависит не от ширины ворот, а от субстрата, связываемого 19S регулятором, а также от его внедрения (channelling) в сердцевину 20S. Итак, если присоединение PA28 открывет ворота до их максимльной величины без изменения оборота клеточных белков, то как на них влияет качество пептидов?

Так как продукт, покидающий протеосому, не является активным, но появлется за счет диффузии, то величина ворот м.б. определена по скорости диффузии. В ситуации, при которой ворота открыты неполностью, время задержки процессинга intermediate в каталитической камере будет увеличиваться и выход больших пептидных продуктов будет приостановлен. В этом случае генерация, накопление и высвобождение малых пептидных фрагментов будет облегчено (Рис.6.). Другими словами, время процессинга инградиентов предопределяет качество продукта. Это подтверждено на дрожжах.

Индуцируемый пропускной способностью ворот контроль размеров важен для презентации антигенов, т.к. относительно большой процент антигенных пептидов в виде предшественников пептидов из 10-12 остатков (вместо 8-10 для MHC class I молекул) будет нуждаться в Т-терминальной подгонке (trimming) прежде, чем они будут связаны с MHC class I белков. Продукция этих пептидов предшественников важна, т.к. некоторые участвующие в процессинге пептиды имеют остатки вблизи своих N-концов (Pro, напр.), которые нарушают их TAP-опосредуемый транспорт в endoplasmic reticulum (ER). Создавая продукты с N-терминальными расширениями протеосомы позволяют этим эпитопам проходить беспрепятственно в ER, где они м.б. подогнаны под оптимальный размер, чтобы связаться молекулами MHC class I. Энзимы, отвечающие за эту подгонку, являются amino exopeptidases, большинство из них находится ER. В некоторых редких случях возможна цитозольная подгонка.

Peptide processing

Одним из свойств протеосом млекопитающих является их способность генерировать С-терминальные якорные остатки MHC class I пептидов с высокой точностью. Однако, эффективность генерации эпитопов зависит также от последовательностей, окружающих P1 остаток (Рис.7). Изучение количества эпитопов овальбумина и мышиного cytomegalovirus эпитопа (pp89) показало, что их генерация строго зависит от их фланкирующих последовательностей. Малые аминокислоты, такие как глицин или аланин в положении P1' поддерживают расщепление после С-терминального якорного остатка, а естественно возникшие мутации в положении P1' нарушают генерацию некоторых эпитопов.

(Рис.7.) | How antigenic peptides achieve optimal binding to MHC class I proteins.

Помимо остатков, фланкирующих эпитопы, остатки внутри эпитопа в положении P4 - P7 также предопределют эффективнолсть С-терминального расщепления. Остатки Pro внутри эпитопа также, по-видимому, участвуют в предопределении мест расщепления на С-конце. Более того, остатки вокруг второго якоря вблизи N-конца эпитопа строго влияют на эффективность корректного расщепления на С-конце и, до некоторой степени, на N-конце.

Разработаны 2 группы компьютерных программ, предсказывающих места протеосомного расщепления в белке с высокой точностью. Третья программа комбинирует кинетические свойства 20S протеосом с протеосомным cleavage-site usage. Эти программы пригодны для использования. Комбинируя одну из этих программ в той, что детерминирует эпитопы на базе гаплотип-специфических якорных остатков, оказалось возможным скринировать целую протеому CHLAMYDIA TRACHOMATIS для идентификации неизвестного HLA-B27-restricted эпитопа без биохимического анализа.

Viral interference with proteasomes

Т.к. протеосомы являются главным источником антигенных пептидов, то неудивительно, что вирусы м. взаимодействовать протеолитической активностью протеосом. Однако, т.к. функциональные протеосомы витальны для клеточного выживания и, следовательно, для размножения вирусов, то вирусные белки модулируют активность протеосом скорее, чем полностью ее блокируют.

Биохимические доказательства прямого взаимодействия с протеосомными субъединицами получены для human T-cell leukaemia virus type 1 (HTLV-1) Tax белка, HBV pX белка, HIV Nef и Tat, и type 5 adenovirus (Ad5) E1A. Однако, информация о функциональных последствиях такого взаимодействия все еще ограничена (Табл.2).

(Табл.2) | Viral interference with the proteasome system

Установлено, что Ad5 >инфекция м. затрагивать как протеосомную активность, так и презентацию антигенов на клеточной поверхности путем повышения уровня эндогенного белка, наз. PI31 (31 kDa proteasome inhibitor). Она задерживает образование иммунопротеосом и влияет на презентацию зависимого от иммунопротеосом эпитопа E1B.

ПРОЦЕСИНГ АНТИГЕНОВ ПРОТЕОСОМАМИ

ANTIGEN PROCESSING BY THE PROTEASOME

Links

Proteasome components