WMZ: Z191701361450 WMR: R209318204033 |
| ||
---|---|---|
Functional proteomics: large-scale analysis of protein kinase activityDavid S Lawrence Genome Biology. 2001 2(2): reviews1007.1-1007.3) http://genomebiology.com/2001/2/2/reviews/1007 | ||
Использование 'gene chips', позволяет осуществить экспрессию тысяч генов из индивидуальных клеточных линий или целой ткани в одном эксперименте. Хотя технология генных чипов очень мощная, очевидно, что она имеет ограничения. Уровни мРНК часто не коррелируют с уровнями экспрессии белков.
(Рис.1.)
| Protein chips for protein kinasesНедавно, Snyder и др. из Yale Университета разработали белковые чипы для проверки субстратной специфичности почти всех протеин киназ, кодируемых дрожжевым геномом. На мультидисциплинарную природу этой попытки, которая захватывает диапазон от фабрикации протеинового чипа до высоко производительного киназного подхода, указывает ранг объединившихся авторов; проэкт осуществлялся Departments of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Electrical Engineering, Applied Physics, Cellular and Molecular Physiology, и Molecular Biophysics and Biochemistry.
Группа из Yale осуществила избыточную продукцию 119 из 122 протеин киназ, кодируемых геномом дрожжей как glutathione S-transferase (GST) fusion proteins, используя 96-well plate format. GST половинка инкорпорировалась, чтобы сделать возможной очистку избыточно продуцируемых протеин киназ из эндогеных клеточных составляющих. Три отсутствующие протеин киназы кодируются очень большими генами (почти в 9 kb длиной): белки высокого молекулярного веса трудно экспрессировать. Др. трудность состояла в том, что избыточно экспрессируемые протеин киназы д.б. в своей актиной форме. Напр., клон дрожжевых клеток избыточно экспрессирующий GST-Hog1P, киназу, участвующиую в регуляции осмоса, предварительно обрабатывали высокими конц. солей непосредственно перед лизисом, чтобы гарантировать образование активированных энзимов. Т.к. большинство др. протеин киназ участвуют в еще неизученных биохимических путях, то возможно, что они также нуждаются в предварительной обработке точным набором условий для полной активации энзима. Учитывая эти потенциальные трудности и неопределенности, к удивлению почти все протеин киназы, кодируемые геномом дрожжей успешно экспрессировались и выделялись и большинство из них обнаруживало различимую протеин-киназную активность.
Субстратная специфичность 119 GST-protein-kinase fusions изучалась параллельно с использованием протеиновых чипов, которые были сфабрикованы с micro-machined слепков, которые отлиты силиконовым эластомером и годны для восстановления (Рис. 1). Каждый микроисточник (microwell) из 10 × 14 массивов имеет 1.4 mm в диаметре, 300 μm в глубину и м. нести примерно 300 nl. Однажды восстановленный (cured) elastomer прикрепляется к стекляному слайду, источники микромассивов были предварительно обработаны поперечно связывающим агентом на силиконовй основе, потенциальные субстраты протеин киназ должны быть ковалентно присоединенными к силиконовому эластомеру пространственно раздельным способом.
Субстратное предпочтение 119 GST-protein-kinase fusion proteins изучали используя 17 различных субстратов, которые, следовательно, нуждались в 17 отдельных чипах. Напр., телячий гистон H1, общий субстрат для пртеин киназ, был ковалентно добавлен ко всем микроисточникам каждого чипа. Индивидуальные 119 GST-protein kinases были затем добавлены пространственно раздельным способом к индивидуальным источникам чипа, вместе с 33Pγ-АТФ, и инкубированы в течение 30 мин при 30°C (Рис. 1). Чип отмывался и phosphoimager высокого разрешения использовался для количественной оценки радиоактивного 33P , включенного в субстрат гистон Н1, ассоцированный с каждым микроисточником силиконового эластомера. Кроме гистон Н1 содержащего чипа,др. протеиновые чипы заполняли потенциальным протеин киназным субстратом, таким как казеин, самими киназами (которые могли аутофосфорилироваться), различными фосфобелками, a Tyr-Glu кополимером и т.д. Все белковые чипы содержали GST в качестве негативного контроля, так что сигналы фосфорилирования каждого источника были нормализованы относительно контроля GST.
Elucidating kinase substrates and pathwaysГруппа Yale получила ряд интересных данных. Наиболее выдающимся наблюдением было то, что 112 из 119 исследованных протеин киназ обнаруживали определенную избирательность (в 5 раз более высокую по сравнению с фоном) по крайней мере для одного субстрата. Субстратная специфичность далее очищалась путем нормализации активности протеин киназ для всех субстратов. Даже при таком ограниченном наборе параметров, 32 из протеин киназ обнаружили избирательность более чем вдвое высокую для индивидуальных субстратов. И в самом деле, большинство индивидуальных субстратов селективно фосфорилировалось с помощью специфической протеин киназы и/или наборов протеин киназ. Напр., Ax12p, трансмембранный секреторный белок, который локализуется в кончике образующейся почки, преимущественно фосфорилируется всеми 119 исследованными протеин киназами.Одна из этих киназ, Ste20p, является членом семейства p21-activated kinase (PAK) и ее инактивация негативно сказывается на активности почкования. Наблюдаение, что Ax12p служит столь строгим субстратом для in vitro Ste20p, м. б. первым проблеском, указывающим на сигнальный путь, отвечающий за возникновение почки и рост у почкующихся дрожжей. Массивный параллельный биологический скрининг буть то message, белок, или функциональный уровенть, м. позволить глобально на изучаемые биологические системы. но и м. также открыть необычное поведение и/или функицю для специфических генов и их белковых продуктов, которые трдудны для идентификации обычным способом.
Limitations and prospectsПолучаемые таким образом результаты не обязательно д.б. приложимы к системе in vivo. Адапторные белки, субклеточная организация, посттрансляционные модификации, и др. факторы м. вносить вклад в субстратную специфичность. Несмотря на это предстережение, время задать вопрос: м. ли эта технология использоваться для выявления протеин киназных каскадов? Необходимо исслеовать способность каждой протеин киназы фосфорилировать все одну за другой 121 протеин киназу из генома дрожжей (нужно всего 122 чипов). Полученные субстратные предпочтения м.б. затем использованы для сбора вместе кусочков мозаики в возможный путь сигнальной трансдукции. Более того, т.к. геном Saccharomyces cerevisiae содержит более 6,000 открытых рамок считывания, то можно даже представить себе создание библиотеки чипов. содержащей все кодируемые дрожжевым геномом белки (конечно предполагая. что технология будет автоматизирована).
Идентификация всех нативных субстратов для всех членов семейства протеин киназ дрожжей позволит создать сигнальной трансдукции 'road map' клетки, но это только первая ступень. Безусловно, это будет использоваться, чтобы определить какие различные средовые стимулы меняют proteome-wide энзиматическую активность. Столь же важно, особенно в линиях клеток человека, определить способность достигать относительных различий в глобальной энзиматической активности между ражличными типами клеток (напр., трансформированных и не трансформированных вирусами). Соответственно сформулированные белковые чипы м. позволить исследовать этот вопрос, используя лизаты разных линий клеток и/или клеточных линий, которые подверглись воздействию набора разных стимулов.
|