Homologous Recombination
ГОМОЛОГИЧНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ
Homologous recombination: from model organisms to human disease Mauro Modesti, Roland Kanaar Genome Biology 2001 2(5): reviews1014.1-1014.5 http://genomebiology.com/2001/2/5/reviews/1014
Обмен информационными последовательностями между двумя гомологичными молекулами ДНК называют гомологичной рекомбинацией, вносящей существенный вклад в репарацию повреждений ДНК. Кроме того, аккуратная репликация генома интимно связана с гомологичной рекомбинацией, поскольку несовершенство ДНК матрицы часто ведет к аресту и разрыву репликационной вилки. Возникающая в результате промежуточная ДНК обрабатывается с помощью факторов гомологической рекомбинации так, что воссоздается снова функциональная репликационная вилка. Наконец, гомологичная рекомбинация вносит вклад в создание генетического разнообразия и точность передачи через зародышевую линию генетической информации во время мейоза. Растет лист геном-дестабилизирующих генетических болезней человека и синдромов с повышенной чувствительностью к опухолям, связанным с нарушениями гомологичной рекомбинации (Рис.1.) \| Schematic representation of the critical steps of homologous recombination (Табл.1) Rad51 и its accessory proteins in different organisms	Гомологичная рекомбинация восстанавливает непрерывность разорванной молекулы ДНК , используя интактную и гомологичную молекулы ДНК (обычно сестринские хроматиды) в качестве матрицы (Рис. 1). Для копирования информации с матрицы концы ДНК в месте разрыва сначала подвергаются процессингу в однонитчатые ДНК хвосты с 3' расширениями, скорее всего в результате комбинированного действия хеликаз и/или нуклеаз. Эти хвосты являются субстратом, на котором мономеры Rad51 recombinase полимеризуются, чтобы сформировать нуклеопротеиновую филаменту. Эта филамента выполняет центральную функцию в гомологичной рекомбинации: поиск гомологичной матричной ДНК и образование соединения гетеродуплексной молекулы между поврежденной ДНК и непроврежденной матрицы. Кромеэтой Rad51, эта ступень нуждается в координированном действии ряда др. белков гомологичной рекомбинации, включая RP-A белок, который связывает однонитчатую ДНК, Rad52, которая м. соединять концы ДНК и отжигает (anneal) комплементарную однонитчтую молекулу ДНК, и ряд паралогов Rad51 (Табл. 1). Соединение гетеродуплексной молекулы составляет субстрат для синтеза ДНК и это нуждается, по крайней мере в одной ДНК полимеразе и ее добавочных факторах для восстановления потерянной информации. Непрерывность нити восстанавливается с помощью ДНК лигазы. Миграция точки разветвления crossed ДНК нитей (известной как 'Holliday junctions') позволяет формировать генуинную гетеродуплексную ДНК, состоящую из одной нити от каждой из родительской ДНК молекулы. Наконец, рекомбинантные молекулы разделяются в интактную дуплексную ДНК и этот процесс называется разрешением ( 'resolution' )(Рис. 1). Genome projects reveal species differences in the complement of recombination proteins Хотя ясно, что ключевым игроком в гомологичной рекомбинации является Rad51 рекомбиназа, законсервированная от бактериофага до человека, недавний проект секвенирования всего генома дал более полное понимание консервации Rad51-акцессорных белков. Разные организмы, по-видимому, обладают разными наборами акцессорных белков. В частности, различия в консервации Rad52 и Rad51 паралогов значительны (Табл. 1). Законсервированная у дрожжей и человека Rad52 по-видимому, отсутствует у Drosophila и Caenorhabditis elegans. Более того, геном C. elegans не содержит генов кандидатов на роль паралогов Rad51. Дрожжевой Saccharomyces cerevisiae Rad52 белок и гетеродимерный комплекс Rad51 паралогов, Rad55 и Rad57, участвует в преодолении ингибирующего эффекта, который RP-A оказывает на обмен ДНК-нити, катализируемый с помощью Rad51. RP-A необходим для эффективного обмена нитей ДНК и он, как полагают, действует путем удаления вторичных структур из однонитчатой ДНК, чтобы способствовать эффективному образованию Rad51 нуклеопротеиновой филаменты. RP-A является более липким белком, соединяющимся с однонитчатой ДНК по сравнению с Rad51. Благодаря этому свойству RP-A м. вызывать ингибрование обмена ДНК-нити, но это ингибирование м.б. осбаблено с помощью Rad52 или гетеродимера Rad55-Rad57. Белок Rad52 человека также стимулирует формирование соединения гетеродуплексной ДНК, генерируемое Rad51 человека. Роль Rad51 паралогов у млекопитающих в этой реакции все еще неясна, и из-за биохимических характеристик Rad51 паралоги млекопитающих все еще в периоде становления. Интересно, что дефекты рекомбинации, выявляемые у RAD52-disruption мутантов более тяжелые в дрожжевых клетках, чем в клетках млекопитающих. Напротив, в то время как рекоминационный фенотип у дрожжевых Rad55/Rad57 мутантов слабый , мышинные клетки без Rad51-паралогов нежизнеспособны. Вообще основной вклад в помощь Rad51 при гомологичной рекомбинации сдвигается отRad52у дрожжей в направлениe Rad51 паралогов у млекопитающих. У C. elegans отсутствуют эти Rad51-акцессорные бклки. C. elegans Rad51 белок м иметь поэтому радикально иные биохимические свойства, но его высокая степень консервации (59% идентично Rad51 человека) делает это маловероятным. Возможно, C. elegans содержит Rad51-акцессорные белки, которые не имеют гомолгии с последовательностями Rad52 или Rad51 паралогов. Напр., загрузка Escherichia coli Rad51-гомолога RecA на однонитчатую ДНК м. б. простимулирована или RecBCD или RecOR, в соответствии с определенным RecA-зависимым subpathway рекомбинации. По последовательностям эти белки не имеют сходства др с др или с Rad52 или с Rad51 паралогами. Regulation of homologous recombination in mammalian cells В то время как основаная кухня (machinery) гомологичной рекомбинации законсервирована у дрожжей и человека , однако ясно, что дополнительные важные для гомологиной рекомбинации белки, такие как BRCA1 и BRCA2, присутствуют только в клетках млекопитающих. Мутации зародышевой линии BRCA1 и BRCA2 генов впервые идентифицированы из-за их предпочтения носителей рака груди. Продемонстрированы ассоциации между обоими BRCA белками и Rad51 у человека, которые указывают на связь между гомологичной рекомбинацией и BRCA белками. Вовлечение BRCA белков в гомологиную рекомбинацию подтвержено в ряде лабораторий. Участие Brca1 мыши в гомолгичной рекомбинации доказано, генный таргетинг эмбриональных стволовых клеток Brca1-дефицитных мышей снижается более чем в 20 раз по сравнению с Brca1-содержащими клетками. Генный таргетинг сильно редуцирован и в Brca2-дефицитных клетках, но только в 10 раз. Но клетки были одинково дефицитны по репарации двойных разрываов сайт-специфической хромосомной ДНК. В общем, Brca1 и Brca2 вносят дифференциальный вклад в разные суб-пути гомологичной рекомбинации. На организационную или регуляторную роль BRCA2 в гомологичной рекомбинации указывает формирование соединений промежуточных молекул после процессинга разорванных концов ДНК и двунитчатой матричной ДНК, которая обеспечивается Rad51, и является ядром большинства гомологичных рекомбинаций (Рис. 1), и таким образом м.б. критической мишенью для регуляции. Зная, что BRCA2 м. физически взаимодействовать с Rad51 и используя его, было показано, что взаимодействие с BRCA2 контролирует связывание ДНК с помощью Rad51. Не связавшись с BRCA2, Rad51 не способен к само-ассоциации и к сборке нуклеопротеиновых филамент на однонитчатом равширении разорванной молекулы ДНК. Учитывая. что сборка этих филамент является абсолютно необходимой для реакции инвазии нити, которая катализируется с помощью Rad51 (см. средние ступени на Рис. 1), то полученные результаты подчеркивают, что BRCA2 является прекрасным кандидатом на роль ключевого реглятора гомологичной рекомбинации. Предполагается. что BRCA2 секвестрирует Rad51 в неактивную форму, которая м.б. перемещена в место повреждения ДНК и активироваться в ответ на получение соотв. сигнала. Согласуется с этим предположением локально повышенная концентрация Rad51 в месте повреждения ДНК в BRCA2-содержащих клетках, которая менее выражена в BRCA2-дефицитных клетках. Снижение гомологичной рекомбинации обнаружено у BRCA-дефицитных клеток, a увеличение недавно связали с чувствительностью к опухолям. Получены мыши, дефицитные по гену Bloom syndrome. Этот ген кодирует ДНК хеликазу, BLM, из E. coli RecQ семейства, который принимает участие во многих аспектах ДНК метаболизма. Улетки от пациентов с синдромом Bloom имеют повышенную гомологичную рекомбинацию и пациенты с предрасположенностью. к раку. Было установлено, что BLM-дефицитные мыши также склонные опухолям. Используя полиморфные микросаттелитные маркеры, было установлено, что в основе предрасположенности к опухолям лежит потеря гетерозиготности в результате повышенной гомологичной рекомбинации. Resolution of recombination intermediates После образования соединения молекул и ДНК синтеза, структуры разветвленной ДНК, называемые Holliday junctions могут формироваться как поздние промежуточные структуры в гомологиной рекомбинации (Рис. 1). Holliday junctions м. скользить, или 'branch-migrate', вдоль соединенной ДНК. Миграция разветвлений увеличивает область гетеродуплексной ДНК между идентичными рекомбинационными партнерами и м., следовательно, обеспечивать механизм для предотвращения рекомбинации между повторяющимися последовательностями, которые разбросаны по всему геному. Миграции разветвлений м. способствовать специализированная хеликаза, такак как бактериальный RuvAB белок. Завершение рекомбинации нуждается в разрешении от Holliday junctions, чтобы отделить партнеров по рекомбинации. Один из хорошо изученных способов разрешения Holliday junctions нуждается в действии энзима resolvase, такой как бактериальный белок RuvC, который взаимодействует с RuvAB белками, чтобы сформировать 'resolvasome'. Попытки идентифицировать у дрожжей и человека гомологов белков RuvABC не привели к успеху идентификации resolvasome у млекопитающих. Белки с активностью, аналогичной RuvC resolvase недавно были описаны у млекоптающих, однако, о функциональной консервации этого способа разрешения в клетках млекопитающих пока говорить рано. Недавно повторно выделена Holliday-junction-resolvase активность из тестисов телят, но пока удалось только co-purify активность ATФ-зависимую branch-migration, аналогичную активности RuvAB. Эти resolvasome млекопитающих активны не только на синтетических oligonucleotide-based субстратах, но и на genuine промежуточных структурах обмена нитей. В дополнение, миграция разветвления и активность разрешения оперируют сочетанно, точно также как в RuvABC resolvasome. Осталось идентифицировать участвующие в этой активности белки. Гены BLM и Werner-syndrome, оба из который кодируют хеликазу, которая м. катализировать миграцию разветвлений in vitro, являются потенциальными кандидатами, но они были исключены, т.к. экстракты из линий клеток от пациентов Bloom или Werner syndrome все еще способны осуществлять миграцию разветвлений и resolution.

Гомологичная рекомбинация восстанавливает непрерывность разорванной молекулы ДНК , используя интактную и гомологичную молекулы ДНК (обычно сестринские хроматиды) в качестве матрицы (Рис. 1). Для копирования информации с матрицы концы ДНК в месте разрыва сначала подвергаются процессингу в однонитчатые ДНК хвосты с 3' расширениями, скорее всего в результате комбинированного действия хеликаз и/или нуклеаз. Эти хвосты являются субстратом, на котором мономеры Rad51 recombinase полимеризуются, чтобы сформировать нуклеопротеиновую филаменту. Эта филамента выполняет центральную функцию в гомологичной рекомбинации: поиск гомологичной матричной ДНК и образование соединения гетеродуплексной молекулы между поврежденной ДНК и непроврежденной матрицы. Кромеэтой Rad51, эта ступень нуждается в координированном действии ряда др. белков гомологичной рекомбинации, включая RP-A белок, который связывает однонитчатую ДНК, Rad52, которая м. соединять концы ДНК и отжигает (anneal) комплементарную однонитчтую молекулу ДНК, и ряд паралогов Rad51 (Табл. 1). Соединение гетеродуплексной молекулы составляет субстрат для синтеза ДНК и это нуждается, по крайней мере в одной ДНК полимеразе и ее добавочных факторах для восстановления потерянной информации. Непрерывность нити восстанавливается с помощью ДНК лигазы. Миграция точки разветвления crossed ДНК нитей (известной как 'Holliday junctions') позволяет формировать генуинную гетеродуплексную ДНК, состоящую из одной нити от каждой из родительской ДНК молекулы. Наконец, рекомбинантные молекулы разделяются в интактную дуплексную ДНК и этот процесс называется разрешением ( 'resolution' )(Рис. 1).

Genome projects reveal species differences in the complement of recombination proteins

Хотя ясно, что ключевым игроком в гомологичной рекомбинации является Rad51 рекомбиназа, законсервированная от бактериофага до человека, недавний проект секвенирования всего генома дал более полное понимание консервации Rad51-акцессорных белков. Разные организмы, по-видимому, обладают разными наборами акцессорных белков. В частности, различия в консервации Rad52 и Rad51 паралогов значительны (Табл. 1). Законсервированная у дрожжей и человека Rad52 по-видимому, отсутствует у Drosophila и Caenorhabditis elegans. Более того, геном C. elegans не содержит генов кандидатов на роль паралогов Rad51.

Дрожжевой Saccharomyces cerevisiae Rad52 белок и гетеродимерный комплекс Rad51 паралогов, Rad55 и Rad57, участвует в преодолении ингибирующего эффекта, который RP-A оказывает на обмен ДНК-нити, катализируемый с помощью Rad51. RP-A необходим для эффективного обмена нитей ДНК и он, как полагают, действует путем удаления вторичных структур из однонитчатой ДНК, чтобы способствовать эффективному образованию Rad51 нуклеопротеиновой филаменты. RP-A является более липким белком, соединяющимся с однонитчатой ДНК по сравнению с Rad51. Благодаря этому свойству RP-A м. вызывать ингибрование обмена ДНК-нити, но это ингибирование м.б. осбаблено с помощью Rad52 или гетеродимера Rad55-Rad57. Белок Rad52 человека также стимулирует формирование соединения гетеродуплексной ДНК, генерируемое Rad51 человека. Роль Rad51 паралогов у млекопитающих в этой реакции все еще неясна, и из-за биохимических характеристик Rad51 паралоги млекопитающих все еще в периоде становления.

Интересно, что дефекты рекомбинации, выявляемые у RAD52-disruption мутантов более тяжелые в дрожжевых клетках, чем в клетках млекопитающих. Напротив, в то время как рекоминационный фенотип у дрожжевых Rad55/Rad57 мутантов слабый , мышинные клетки без Rad51-паралогов нежизнеспособны. Вообще основной вклад в помощь Rad51 при гомологичной рекомбинации сдвигается отRad52у дрожжей в направлениe Rad51 паралогов у млекопитающих. У C. elegans отсутствуют эти Rad51-акцессорные бклки. C. elegans Rad51 белок м иметь поэтому радикально иные биохимические свойства, но его высокая степень консервации (59% идентично Rad51 человека) делает это маловероятным. Возможно, C. elegans содержит Rad51-акцессорные белки, которые не имеют гомолгии с последовательностями Rad52 или Rad51 паралогов. Напр., загрузка Escherichia coli Rad51-гомолога RecA на однонитчатую ДНК м. б. простимулирована или RecBCD или RecOR, в соответствии с определенным RecA-зависимым subpathway рекомбинации. По последовательностям эти белки не имеют сходства др с др или с Rad52 или с Rad51 паралогами.

Regulation of homologous recombination in mammalian cells

В то время как основаная кухня (machinery) гомологичной рекомбинации законсервирована у дрожжей и человека , однако ясно, что дополнительные важные для гомологиной рекомбинации белки, такие как BRCA1 и BRCA2, присутствуют только в клетках млекопитающих. Мутации зародышевой линии BRCA1 и BRCA2 генов впервые идентифицированы из-за их предпочтения носителей рака груди. Продемонстрированы ассоциации между обоими BRCA белками и Rad51 у человека, которые указывают на связь между гомологичной рекомбинацией и BRCA белками. Вовлечение BRCA белков в гомологиную рекомбинацию подтвержено в ряде лабораторий.

Участие Brca1 мыши в гомолгичной рекомбинации доказано, генный таргетинг эмбриональных стволовых клеток Brca1-дефицитных мышей снижается более чем в 20 раз по сравнению с Brca1-содержащими клетками. Генный таргетинг сильно редуцирован и в Brca2-дефицитных клетках, но только в 10 раз. Но клетки были одинково дефицитны по репарации двойных разрываов сайт-специфической хромосомной ДНК. В общем, Brca1 и Brca2 вносят дифференциальный вклад в разные суб-пути гомологичной рекомбинации.

На организационную или регуляторную роль BRCA2 в гомологичной рекомбинации указывает формирование соединений промежуточных молекул после процессинга разорванных концов ДНК и двунитчатой матричной ДНК, которая обеспечивается Rad51, и является ядром большинства гомологичных рекомбинаций (Рис. 1), и таким образом м.б. критической мишенью для регуляции. Зная, что BRCA2 м. физически взаимодействовать с Rad51 и используя его, было показано, что взаимодействие с BRCA2 контролирует связывание ДНК с помощью Rad51. Не связавшись с BRCA2, Rad51 не способен к само-ассоциации и к сборке нуклеопротеиновых филамент на однонитчатом равширении разорванной молекулы ДНК. Учитывая. что сборка этих филамент является абсолютно необходимой для реакции инвазии нити, которая катализируется с помощью Rad51 (см. средние ступени на Рис. 1), то полученные результаты подчеркивают, что BRCA2 является прекрасным кандидатом на роль ключевого реглятора гомологичной рекомбинации. Предполагается. что BRCA2 секвестрирует Rad51 в неактивную форму, которая м.б. перемещена в место повреждения ДНК и активироваться в ответ на получение соотв. сигнала. Согласуется с этим предположением локально повышенная концентрация Rad51 в месте повреждения ДНК в BRCA2-содержащих клетках, которая менее выражена в BRCA2-дефицитных клетках.

Снижение гомологичной рекомбинации обнаружено у BRCA-дефицитных клеток, a увеличение недавно связали с чувствительностью к опухолям. Получены мыши, дефицитные по гену Bloom syndrome. Этот ген кодирует ДНК хеликазу, BLM, из E. coli RecQ семейства, который принимает участие во многих аспектах ДНК метаболизма. Улетки от пациентов с синдромом Bloom имеют повышенную гомологичную рекомбинацию и пациенты с предрасположенностью. к раку. Было установлено, что BLM-дефицитные мыши также склонные опухолям. Используя полиморфные микросаттелитные маркеры, было установлено, что в основе предрасположенности к опухолям лежит потеря гетерозиготности в результате повышенной гомологичной рекомбинации.

Resolution of recombination intermediates

После образования соединения молекул и ДНК синтеза, структуры разветвленной ДНК, называемые Holliday junctions могут формироваться как поздние промежуточные структуры в гомологиной рекомбинации (Рис. 1). Holliday junctions м. скользить, или 'branch-migrate', вдоль соединенной ДНК. Миграция разветвлений увеличивает область гетеродуплексной ДНК между идентичными рекомбинационными партнерами и м., следовательно, обеспечивать механизм для предотвращения рекомбинации между повторяющимися последовательностями, которые разбросаны по всему геному. Миграции разветвлений м. способствовать специализированная хеликаза, такак как бактериальный RuvAB белок. Завершение рекомбинации нуждается в разрешении от Holliday junctions, чтобы отделить партнеров по рекомбинации. Один из хорошо изученных способов разрешения Holliday junctions нуждается в действии энзима resolvase, такой как бактериальный белок RuvC, который взаимодействует с RuvAB белками, чтобы сформировать 'resolvasome'. Попытки идентифицировать у дрожжей и человека гомологов белков RuvABC не привели к успеху идентификации resolvasome у млекопитающих. Белки с активностью, аналогичной RuvC resolvase недавно были описаны у млекоптающих, однако, о функциональной консервации этого способа разрешения в клетках млекопитающих пока говорить рано.

Недавно повторно выделена Holliday-junction-resolvase активность из тестисов телят, но пока удалось только co-purify активность ATФ-зависимую branch-migration, аналогичную активности RuvAB. Эти resolvasome млекопитающих активны не только на синтетических oligonucleotide-based субстратах, но и на genuine промежуточных структурах обмена нитей. В дополнение, миграция разветвления и активность разрешения оперируют сочетанно, точно также как в RuvABC resolvasome. Осталось идентифицировать участвующие в этой активности белки. Гены BLM и Werner-syndrome, оба из который кодируют хеликазу, которая м. катализировать миграцию разветвлений in vitro, являются потенциальными кандидатами, но они были исключены, т.к. экстракты из линий клеток от пациентов Bloom или Werner syndrome все еще способны осуществлять миграцию разветвлений и resolution.

Homologous recombination: from model organisms to human disease

Genome projects reveal species differences in the complement of recombination proteins

Regulation of homologous recombination in mammalian cells

Resolution of recombination intermediates