| |
||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
|
Комплекс Mre11 - содержащий , и - способствует репарации двунитчатых разрывов ДНК (DSBs). Одним из путей репарации является гомологичная рекомбинация - процесс, который внутренне связан с репликацией ДНК.
Клонирован и очищен Xenopus Mre11 гомолог. Показано, что фосфорилдируется в ответ на появление DSBs и что эта модификация стимулирует 3'-5' экзонуклеазную активность комплекса X-Mre11 (функция которого неизвестна).
Установлено, что фосфорилированный X-Mre11 находится в ядерной фракции во время репликацииin, следовательно, активный X-Mre11 м. ассоциировать с хроматином во время нормального синтеза ДНК. Установлено, что DSBs возникают во время репликации и что они накапливаются, если отсутствует Mre11. Это указывает на то, что DSBs возникают во время нормальной репликации и что комплекс X-Mre11 участвует в их репарации.
Фосфорилирование Nbs1 компонента комплекса Mre11 необходимо для активации S-phase checkpoint, которая останавливает репликацию в ответ на повреждение ДНК. Однако, клетки, содержащие аберрантный Nbs1, в котором отсутствует N-конец не могут активировать S-phase checkpoint, даже если Nbs1 фосфорилирован.
Следовательно, amino-терминальная область Nbs1 существенна для активации checkpoint, дальнейший анализ показал, что она взаимодействует с транскрипционным фактором . Внутри 400 пар оснований Epstein-Barr virus latent origin of replication (oriP) имеются два E2F-связывающие сайта. Подтверждено, что не только E2F-Nbs1 связываются вблизи oriP, но и что связывание увеличивается в клетках, проходящих S фазу. Наконец, было показано, что комплекс Mre11 ко-локализуется с фокусами ДНК репликации, содержащими репликационный белок - the proliferating cell nuclear antigen - в течение всей S фазы. Эти результатфы подтверждают идею, что комплекс Mre11 влияет на ход S фазы, действуя не только на происхождение репликации (через взаимодействие с E2F1), но и на репликационную вилку.
|
|
Для репарации разрывов ДНК необходим phosphorylated cyclic alcohol называемый inositol hexakisphosphate (InsP6).
Все вертится вокруг каталитической субъединицы ДНК-зависимой (DNA-PKcs), которая помогает репарировать двунитчатые разрывы ДНК, используя путь негомологичного соединения концов (non-homologous end-joining (NHEJ)). DNA-PKcs первой направляется к каждому из разорванных концов с помощью комплекса и белков (рис). DNA-PKcs затем привлекает комплекс и , в результате разорванные концы соединяются.
In vitro показано, что хотя все эти игроки - Ku70, Ku80, DNA-PKcs, XRCC4 и DNA ligase IV - и необходимы для NHEJ, однако их недостаточно. Hanakahi et al. идентифицировали фракцию, которую назвали stimulatory factor A (SFA).
Установлено, что SFA не является ни белком, ни нуклеиновой кислотой. Было установлено, что это InsP6, который, как предполагается конвертирует DNA-PKcs из неактивной в активную форму.
Интересно, что DNA-PKcs, как и некоторые др. ДНК-репарирующие белки, такие как ataxia telangiectasia mutated (ATM) и ATR, содержат мотивы, характерные для phosphatidylinositol-3-OH kinases (PI(3)K). Т.к. ни один из этих белков не обладает lipid kinase активностью, тогда зачем им такие мотивы ? Hanakahi et al. предположили, что такие белки м. происходить от общего родоначальника с протеин и липид киназной функциями и что мутации в PI(3)K домена заставили эти белки потерять свою липид киназную активность при этом они сохранили способность связывать headgroups, содержащие inositol polyphosphates. Получены некоторые указания на то, что InsP 6 связан с аллостерической активацией сайта на DNA-PKcs.
Предполагается, что InsP6 действует как антиоксидант и источник для хранения фосфатов в семенах растений. В клетках млекопитающих он участвует в регуляции роста, воспалении и в передаче сигналов по нервам и возможно вовлечен в экспорт мРНК из ядра. Несмотря на это, связь с репарацией ДНК явилась сурпризом.
|
|
Downs et al. связали сфорилирование Ser-Gln-Glu (SQE) мотива в стержневой части гистона дрожжей с повреждениями в хроматине, запускающими репарацию ДНК.
Мотив SQE фосфорилируется in vitro членами семейства phosphatidylinositol-3-OH kinase-related kinase (PIKK). Сюда входят человеческая и , и их гомологи у Saccharomyces cerevisiae и все они являются центральными у эукариот в ответе на повреждения ДНК.
Т.к. С-конец гистона H2A содержит SQE мотив, то Downs et al. задались вопросом, будет ли фосфорилирование этих последовательностей влиять на передачу сигналов и повреждениях ДНК. Они установили, что отсутствие мотива SQE делает гистон гиперчувствительным к химич. в-вам, индуцирующим повреждения ДНК, таким как methyl methane-sulphonate (MMS). Когда в мотиве S, Q и E были мутированы отдельно, то фенотип коррелировал с относительной важностью каждого остатка в определении оптимального PIKK-распознающего мотива.
Линии с мутациями в MEC1 гене не м. фосфорилировать мотив SQE у H2A в присутствии MMS, указывая тем самым, что H2A м.б. непосредственной мишенью для Mec1p. Более того, Хотя фосфорилирование мотива SQE не оказывает эффекта на Mec1p-зависимую транскрипционную или cell-cycle реакцию на повреждение ДНК, оно, по-видимому, необходимо для Mec1p-зависимой репарации разрывов двойной нити ДНК.
Учитывая, что H2A является гистоновым белком, лишь один путь облегчения репарации, изменение структуры хроматина вокруг разорванных концов ДНК, путь, делающий легким доступ репарационной кухне к повреждению. Downs et al. нашли, что у мутантных линий мышей, мимикрирующих эффект фосфорилирования SQE, области между нуклеосомами были более чувствительными к перивариванию с помощью micrococcal nuclease - следовательно, компакция хроматина снижалась.
Сайты на С-конце H2A у части нуклеосом, в которые ДНК входит и выходит, идеально походят к влиянию высшего порядка структур хроматина. Как же фосфорилирование С-конца H2A ведет к такому эффекту?
|