Ядерные транскрипционные факторы, очевидно, играют важную роль в компетентности и детерминации судьбы клеток(Furakawa et al., 1997; Chen et al., 1997; Yan and Wang, 1998; Morrow et al., 1999; Kanekar et al., 1997; Perron et al., 1999; Liu et al., 2000). Среди cell-extrinsic факторов, Drosophila Hedgehog(Hh) и его гомологи у позвоночных Sonic Hedgehog (Shh), являются критическими сигнальными молекулами. Активные формы белков семейства Hh (Hh-N) опосредуют свою сигнальную активность через гетеромерный рецепторный комплекс, который включает трансмембранный Smoothened белок и рецептор Patched 1 (Ptc1) (reviewed by Hammerschmidt et al., 1997; Goodrich and Scott, 1998; McMahon, 2000). Мутации Shh вызывают cyclopia у мышей и человека (Chiang et al., 1996; Belloni et al., 1996; Roessler et al., 1996; Ming et al., 1998). Установлено, что сигналы Shh испускаются тканью вентральной средней линии координированно с другими факторами, чтобы детерминировать дорсовентральный паттерн сетчатки и влиять на компартментализацию оптического бокала (Macdonald et al., 1995; Ekker et al., 1995; Schulte et al., 1999; Hallonet et al., 1999; Koshiba-Takeuchi et al., 2000; Zhang and Yang, 2001). Экзогенный Shh-N белок способствует пролиферации клеток предшественников сетчатки у грызунов, а также дифференцировке позднее возникающих типов клеток, включая и фоторецепторы in vitro (Jensen and Wallace, 1997; Levine et al., 1997). Редукция экспрессии у рыбок данио shh и tiggywinkle hedgehog (twhh) вызывает задержку дифференцировки фоторецепторов (Stenkamp et al., 2000). Кроме того, Shh, продуцируемый аксонами ганглиолярных клеток сетчатки, стимулирует пролиферацию астроцитов в зрительном нерве крыс (Wallace and Raff, 1999). Секретируемый Hh белок играет фундаментальную роль в развитии компаундных глаз Drosophila. С началом нейрогенеза Hh секретируется на заднем крае глазного имагинального диска и необходим для инициации нейральной дифференцировки (Dominguez and Hafen, 1997; Pignoni and Zipursky, 1997), которая осуществляется в направлении сзади наперед в виде морфогенетического шва (morphogenetic furrow (MF)) (Tomlinson and Ready,1987; Wolff and Ready, 1993). Затем Hh сигналы секретируются дифференцирующимися фоторецепторными клеткам и управляют прогрессом MF по рекрутированию дополнительных клеток кпереди от шва MF , чтобы сделать их компетентными для нейрогенеза (Heberlein and Moses, 1995; Treisman and Heberlein, 1998; Greenwood and Struhl, 1999). Кроме того, Hh, продуцируемый дифференцированными R8 фоторецепторами, контролирует сборку омматидий, регулируя пронейральный ген atonal, bHLH транскрипционный фактор и детерминант R8 клеток (Jarman et al., 1994, White and Jarman, 2000). Показано, что низкие уровни сигналов Hh, появляющиеся на расстоянии от передних Hh продуцирующих клеток, индуцируют экспрессию atonal; тoгда как высокие уровни сигнала Hh вблизи вновь дифференцированных единиц супрессируют экспрессию atonal между образующимися пронейральными кластерами и, таким образом, контролируют положение и количество будущих R8 клеток (Dominguez, 1999). Развитиеe retinal ganglion cells (RGC) у позвоночных напоминает развитие Drosophila R8 фоторецепторных клеток.

Подобно R8 клеткам, которые являются клетками основательницами для каждого омматидия, RGCs являются первыми нейронами, дифференцирующимися в нейральном эпителии сетчатки позвоночных (Young, 1985; Spence and Robson, 1989; Altshuler et al., 1991; Prada et al., 1992; Snow and Robson, 1994). RGCs начинают дифференцироваться на вентрикулярной поверхности эпителия сетчатки сразу после их митотического терминального деления (Waid and McLoon, 1995), и их клеточные тела занимают внутренний слой сетчатки, а их аксоны распространяются через зрительный нерв в направлении головного мозга. Дифференцировка RGCs в сетчатке позвоночных начинается в соединении оптического бокала и оптической ножки и распространяется в виде фронта волны в направлении периферии сетчатки (Hu and Easter, 1999; McCabe et al., 1999; Masai et al., 2000). Однако не выявлено синхронизации клеточных циклов во главе RGC фронта волны, сходной с таковой в MF, RGCs появляются в фронте нейрогенной волны в виде неслучайно организованных порядков (McCabe et al., 1999). Кроме того, гомологи позвоночных для пронейрального bHLH транскрипционного фактора atonal экспрессируются в предшественниках сетчатки и позднее в дифференцирующихся RGCs (Jasoni et al., 1994; Kanekar et al., 1997; Brown et al., 1998). Молекулярные механизмы, которые контролируют инициацию дифференцировки RGC и продвигают вперед прогрессию волны RGC в сетчатке позвоночных, начинают выявляться. Мутанты данио Nodal сигнального пути, у которых отсутствует аксиальная мезодерма и, следовательно, клетки оптической ножки, неспособны инициировать экспрессию у позвоночныхatonal гомолог ath5 в нейральной сетчатке (Masai et al., 2000), это указывает на вовлечение сигналов средней линии в инициацию дифференцировки RGC. Известно, что FGF способствует ретинальному нейрогенному пути (Guillemot and Cepko, 1992; McFarlane et al., 1998), блокирование активации рецептора FGF у эмбрионов кур взаимодействует с движением фронта волны дифференцировки RGC (McCabe et al., 1999).

Показано, чтоShh и twhh экспрессируются в дифференцированных RGCs данио(Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000), как и в сетчатке мыши (Jensen and Wallace, 1997). Более того, Shh необходим и достаточен для индукции своей собственной экспрессии в только что возникших RGCs; shh мутации, как и блокирование передачи сигналов Hedgehog задерживает распространение фронта волны RGC у данио (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000).

Имеющиеся данные указывают на то, что спецификация RGC судьбы из недифференцированного ретинального нейрального эпителия вовлекает механизмы, опосредованные межклеточными контактами и секретируемыми молекулами. Транасмембранный рецептор Notch и его лиганд Delta участвуют в спецификации судьбы клеток из пролиферирующих предшественников (Dorsky et al., 1995; Dorsky et al., 1997; Austin et al., 1995; Henrique et al., 1997; Ahmad et al., 1997; Bao and Cepko, 1997). Изучение ретинальных культур показывает, что сетчатка на поздних стадиях нейрогенеза содержит секретируемые факторы, которые ингибируют способность предшественников дифференцироваться в ганглиолярные клетки и что эти ингибирующие активности продуцируются преимущественно самими ганглиолярными клетками (Waid and McLoon, 1998). Мы проверяли гипотезу, что Shh молекулы , продуцируемые дифференцированными RGCs, играют в сетчатке роль негативной регуляции продукции RGC.

Было показано, что во время нейрогенной фазы развития сетчатки кур Shh сигналы, исходящие из дифференцированных RGCs действуют паракринным образом, влияя на недетерминированные клетки ранних предшествнников. Увеличение Shh сигналов ведет к снижению продукции RGCs, тогда как редукция Shh сигналов вызывает усиление генеза RGC. Shh сигналы модулируют продукцию ганглиолярных клеток в течение обычного периода генеза RGC без существенного влияния на пролиферацию и гибель клеток in vitro. Более того, эффекты передачи сигналов Shh на спецификацию судьбы RGC обнаруживаются во время или вскоре после последнего митотического цикла клеток предшественников. Это подтверждает гипотезу авторов, что Shh, секретируемый RGCs, ведет себя как негативный регулятор продукции ганглиолярных клеток позади раннего фронта нейрогенной волны. Спецификация различных типов ретинальных клеток в сетчатке позвоночных частично зависит от изменений

Fig. Предполагаемая двойная роль Shh во время раннего нейрогенеза сетчатки. Схама представляет раннюю сетчатку после начала дифференцировки RGC. Shh секретируется дифференцированными RGCs (красные), расположенными на внутренней сетчатке. Впереди фронта волны дифференцировки RGC нативные клетки предшественники сетчатки (серые) подвергаются воздействию низкого уровня сигналов Shh, потому что они далеко от клеток, экспрессирующих Shh. Низкие уровни сигнала Shh м.б. необходимы для индукции нативных клеток предшественников в компетентные для дифференцировки и некоторые очевидно становятся Shh-продуцирующими RGCs. Позади фронта волны дифференцировки RGC клетки предшественники (темно зеленые) разполагаются в ventricular zone (VZ) и скорее всего приобретают состояние компетентности быть специфицированными в RGCs и м. содержатть активированые MAPK. Высокие уровни Shh экспрессируются позади фронта волны RGC что обусловлено накоплением дифференцированных RGCs. Shh сигналы негативно влияют на спецификацию судьбы RGC клеток-предшестенников во время или вскоре после M фазы (желтые) митотичекого цикла и/или влияния дальнейшей дифференцировки nascent RGCs (оранжевые) , мигрирующих по направлению к слою ганглиолярных клеток (GC). Эта модель согласуется в данными Neumann and Nuesslein-Volhard, (2000).

негативного регулятора продукции RGC в сетчтке. Shh-N м.б одним из ингибрующих секретируемых факторов, который участвует в feedback контроле генеза RGC в сетчатке. У кур постмитотические ганглиолярные клетки главный источник эндогенной Shh мРНК на иницальных стадиях нейрогенеза сетчатки. RGCs экспрессируют Shh на значительно более низком уровне, чем Shh-продуцирующие клетки, расположенные в вентральной части переднего мозга. Однако этот амбивалентный уровень Shh в ранней сетчатке, по-видимому, достаточен для передачи сигнала клеткам предшественникам в соседней пролиферативной зоне, как показано с помощью комплементарной экспрессии Ptc1, накапливающейся позади фронта волны дифференцировки.

В сетчатке мышей на соотв. ст. развития наблюдается сходные паттерн экспрессии Shh и Ptc (Jensen and Wallace, 1997), а в сетчатке рыбок данио экспрессируются и shh и twhh в ганглиолярных клетках (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000).

Паттерны экспрессии Shh и Ptc1 также указывают на то, что Shh сигналы, секретируемые ганглиолярными клетками, м. диффундировать и влиять на популяцию клеток предшественников паракринным способом. Однако, дифференцированые RGCs сами не чувствительны к своему эндогенному или эктопическому Shh во время раннего нейрогенеза. Неясно как дифференцированные RGCs активируют транскрипцию гена Shh и одновременно усиливают независимость от Shh сигналов. Shh обладает митогенной активностью на некоторые типы клеток и тканей (reviewed in Goodrich and Scott, 1998; Wechsler-Reya and Scott, 1999; Dahmane and Ruiz i Altaba, 1999). Белок Shh-N усиливает пролиферацию клеток предшественников и избыточную продукцию всех поздно появившихся типов клеток (Jensen and Wallace, 1997; Levine et al., 1997). Более того, Shh сигналы, секретируемые аксонами ганглиолярных клеток способствуют пролиферации астроцитов в зрительном нерве in vivo (Wallace and Raff, 1999). Таким образом, Shh молекулы, продуцируемые сетчаткой м. выступать как митогены, способствуя пролиферации поздних нейрональных и глиальных предшественников (Zhang and Yang, 2001). Получены данные, не подтверждающие эту идею, секретируемый Shh не действует как эффективный митоген и не влияет на апоптоз во время дифференцировки RGC in vitro, а вместо этого влияет на спецификацию клеток предшественников. В нормальной сетчатке презумптивные ганглиолярные клетки предшественники, заканчивая митоз на вентрикулярной поверхности сразу же вытягивают нейрофиламенты-содержащий ведущий отросток и мигрируют в направлении внутренней сетчатки (Waid and McLoon, 1995). Быстрая фенотипическая дифференцировка ганглиолярных клеток указывает на то, что их судьба м.б. детерминирована во время последнего митотического цикла, во время G2 и/или M фазы и во время последующей дифференцировки и созревания вновь специфицированных ганглиолярных клеток. Первой обнаружимой ступенью, на которой обнаруживается влияние сигналов Shh является переход от митоза к дочерним клеткам, экспрессирующим маркеры ганглиолярных клеток. Снижение продукции ганглиолярных клеток, вызываемое избыточной экспрессией Shh, м.б. комбинированным эффектом нарушения спецификации судьбы и дифференцировки клеток. У Drosophila компаундные глаза нуждаются в градированных сигналах Hh молекул, секретируемых дифференцирующимися фоторецепторными клетками, оказывающимися позади MF. Низкие уровни Hh индуцируют decapentaplegic (Dpp) внутри и впереди MF, которые действуют на дальних расстояниях от Hh-секретирующих клеток, способствуя вступлению нативных клеток диска в ‘pre-proneural’ состояние, характеризующееся экспрессией bHLH генов, включая hairy и Extramacrochaetae (Emc) (Greenwood and Struhl, 1999; Brown et al., 1995). Пре-пронейральное состояние ограничивается узкой зоной впереди MF и необходимо для клеток предшественников, чтобы инициировать нейрональную дифференцировку. Передача сигналов Hh также необходима для перехода от пре-пронейронального состояния в ‘proneural’ сочтояние, характеризующееся экспрессией bHLH гена atonal (Greenwood and Struhl, 1999; Dominguez, 1999). Экспрессия atonal, который является детерминантом основательниц R8 клеток (Jarman et al., 1994; White and Jarman, 2000), сложная. Клетки, которые удалены на 5-7 рядов омматидий от клеток, экспрессирующих Hh, экспрессируют atonal в виде непрерывной полоски. Однако, те, которые ближе к дифференцирующимся кластерам омматидий, экспрессируют все меньше atonal, градиентно распределяясь между субнаборами клеток (proneural clusters), и, очевидно, ограничиваясь лишь R8 клетками (Dominguez, 1999). Это указывает на то, что Shh контролирует генез ганглиолярных клеток сетчатки, низкие уровни Hh индуцируют atona, тогда как высокие уровни Hh супрессируют atonal (Dominguez, 1999). Более того, показано, что эффект Hh на atonal экспрессию м.б. опосредован неидентифицированным вторичным сигналом, который активирует Raf-MAPK путь (Greenwood and Struhl, 1999). Существование эволюционно законсервированного регуляторного механизма, управляющего Drosophila R8 фоторецепторными клетками и у позвоночных продукцией RGC клеток подтвержается (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000). Во время развития сетчатки рыбок данио существует позитивная регуляторная петля для Shh во фронте волны дифференцировки, где Shh необходим и достаточен для индукции самого себя и обеспечения дальнейшей экспансии территории RGC. Кроме того индуктивный эффект Shh появляется только в узкой зоне клеток, соседствующих с прогрессирующим фронтом волны, это указывает на существование pre-proneural зоны, сходной с таковой в глазах мух (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000).

Наши результаты подтверждают гипотезу, что локальные сигналы Shh играют регуляторную роль в выделении ганглиолярных клеток из пула предшественников. Эта функция негативной обратной связи сигналов Shh позади фронта волны дифференцировки не противоречит роли Shh в обеспечении нейрогенеза во фронте волны (Neumann and Nuesslein-Volhard, 2000).

Согласно нашей модели клетки предшественники отвечают на разные пороги сигналов Shh в сетчатке позвоночных (Fig.). Впереди фронта инициальной нейрогенной волны присутствуют низкие уровни Shh, которые могут индуцировать экспрессию пронейральных генов, таких как atonal среди нативных клеток предшественников, превращая их в компетентные адоптировать судьбу RGC. Позади фронта волны высокие уровни Shh могут супрессироовать экспрессию пронейральных генов селективно среди компетентных клеток предшественников и таким образом негативно регулировать продукцию ганглиолярных клеток. У Drosophila процесс латеральной ингибиции использует путь Notch и также оперирует, вычленяя одиночные R8 клетки среди пронейральных кластеров (Baker et al., 1996). Возможно, что комбинированное действие латеральной ингибиции с помощью Notch и регуляции с помощью градированых сигналов Hh вносит вклад в точную организацию расположения омматидий (Dominguez, 1999; Greenwood and Struhl, 1999). Во время развития сетчатки позводночных сигналы, опосредуемые Notch рецепторами также играют важную роль в котроле числа и плотности RGCs в сетчатке позвоночных (Dorsky et al., 1995; Austin et al., 1995; Henrique et al., 1997).

Pea3 Expression Is Regulated by FGF Signaling In Developing Retina

K.L.McCabe (klm@caltech.edu), C McGurie, T.A.Reh

Dev. Dyn. - 2006.- V.235, No 2 - P. 327-335

Full Text

Анализировали экспресиию Pea3, члена класса Pea3 Ets-доменовых транскрипционных факторов, в развивающемся глазу эмбрионов кур. Было установлено, что Pea3 экспрессируется в развивающейся сетчатке, а его транскрипция регулируется с помощью активации FGF рецепторов. Кроме того, передача сигналов FGF активирует Cath5, ген, необходимый для дифференцировки ганглиолярных клеток сетчатки. Эти результаты указывают на то, что передача сигналов FGF посредством МАРК позитивно регулирует транскрипционные факторы, которые в свою очередь контролируют дифференцировкe ганглиолярных клеток сетчатки.

Regulation of retinal ganglion cell production by Sonic hedgehog

Xiang-Mei Zhang and Xian-Jie Yang