(Box.1)

Co-crystallization with the 30S subunit has shown that several antibiotics bind directly to the 16S rРНК at positions close to the mРНК- и tРНК-binding sites, where there is substantial movement during decoding и translocation. Antibiotic binding is predicted to reduce the subunit flexibility that is crucial for the structural rearrangements that normally occur during translation. Gentamycin и streptomycin, which affect translational accuracy, would stabilize the 16S rРНК structure around the decoding site in the ribosome ambiguity (ram) conformation that favours binding of non-cognate aminoacyl-tРНКs, leading to misincorporation. Spectinomycin, a rigid molecule with a fused ring system, would inhibit EF-G-mediated translocation by binding close to the pivot point of the head и sterically blocking its movement. Antibiotic-resistant mutations in r-protein S5 might reduce the stability of the head-body interaction, so that mobility is maintained even in the presence of the antibiotic.

Paromomycin binds to a loop that is involved in the induced-fit recognition of cognate tРНКs (Box.1). By favouring the structure normally provoked by the correct codon-anticodon interaction, paromomycin binding lowers the activation energy, reducing the stringency of recognition. Hygromycin B binds close to paromomycin и sequesters the tРНК in the A site, perhaps by preventing the conformational changes that are required during translocation.

Tetracycline directly inhibits binding of aminoacyl-tРНКs to the A site by binding to an overlapping site on the ribosome, leading to the release of aminoacyl-tРНК after GTP hydrolysis by EF-Tu. It might also reduce fidelity by favouring the ram conformation by binding at other sites. Tetracycline resistance often involves chemical modification of the drug и, with the atomic definition of its binding pocket, the chemical modifications known to abolish antibiotic properties of tetracycline interfere strongly with its interactions with the A site. In addition, the bacterial specificity of the drug could be explained by the poor conservation of its binding pocket in eukaryotic rРНК.

Even where co-crystallization data are not available, chemical crosslinking data и resistance mutations can now be more clearly interpreted. This has been seen for evernimicin, an oligosaccharide antibiotic that interacts with the large ribosomal subunit at a site distinct from the peptidyl-transferase centre, и also for linezolid, which binds at the peptidyl-transferase site.

In addition to movement of the ribosome itself, the translation factors и GTPase, EF-Tu и EF-G undergo substantial conformational changes. The structures of EF-Tu bound with two otherwise unrelated antibiotics indicate that both act by inhibiting the structural changes required for cycling between the GTP- и GDP-bound conformations.

(Box 3.)
 |  Key steps in eukaryotic ribosome synthesis

Links

Ribosome watching

Многочисленные исследования рибосом бактерий E. coli привели к идентификации многих функционально важных сайтов. Интерпретация новых структурных данных с вписалась в этот анализ, выявлена высокая степень сходства структурных и биохимических данных.  В частности, идея, что rРНКs м.б. главным функциональным элементом рибосом подтверждена находкой, что сайт формирования пептидных связей  полностью окружен РНК. Это говорит о том, что peptidyl-transferase активность рибосом базируется на катализе с помощью РНК. Такие РНК энзимаы названы ribozymes — хотя распространена фраза, "the ribosome is a ribozyme".

Общая форма каждой субъединицы в основном предопределяется  структурой rРНКs, которая кроме того составляет большую часть их массы. Кластер рибосомальных белков расположен по бокам, обращенным к сольвенту, и по периферии interface между двумя субъединицами.   Interface субъединиц сам по себе  — множество сайтов с функциональным значением для транслфции  — выглядит в основном лишенным белков. Первичная функция рибосомальных белков, пох-видимому, заключается в стабилизации высоко компактных rРНК структур. Для выполнения этого белки интимно переплетаются с РНКs, формируя обширные взаимодействия, которые часто стабилизируют межспиральные контакты между  доменами  РНК, особенно в случае более ригидных 50Sсубъединиц. Большинство r-proteins имеет длинные, узкие basic расширения, которые извиваясь змеей проникают через rРНКs и достигают глубины   сердцевины субъединицы РНК. Это делает возможной более плотную упаковку РНК, которая наблюдается вокруг активного центра рибосом.  Т.к. эти расширения  плохо структуированы в отсутствие rРНК, поэтому они в целом не являются решающими в структурных исследованиях  индивидуальных компонент и их участие  в  придании формы рибосомам переоценивалось. В принципе структура RNP, выявляемая в рибосомах, скорее может помочь в понимании др. РНК–белок комплексов.

Movement of the subunits drives translocation

Бактериальная 30S субъединица состоит из трех относительно flexible глобулярных доменов, организованных в Y-образную форму вокруг тонкой шейки. Эти большие морфологические области состоят в основном из индивидуальных доменов структуры РНК: 5' домен 16S rРНК формирует 'тело'; центральная область rРНК образует 'platform'; и 3' область образует 'головку' (Box.1). Активные сайты малой субъединицы, где кодоны mРНК распознаются и связывается  transfer РНКs (tРНКs), в общем образуются из элементов различных структурных доменов.

Физические движения этих доменов, в купе с ротацией малой субъединицы относительно более ригидной большой субъединицы, как полагают, играют ключевую роль в трансляции.  Предполагается, что храповой механизм управляет движением мРНК и ассоциированного  пептидил-тРНК комплекса через транслирующую рибосому в процессе, названого транслокацией (Box 1). Движение 30S субъединицы в свою очередь управляется путем связывания  трансляционных факторов, особенно EF-G, а структурные изменения в этих факторах поддерживаются энергией от гидролиза ГТФ.

Важность flexibility в малых субъединицах лежит в основе действия некоторых клинически важных антибиотиков.  Они стабилизируют индивидуальные структурные домены в локальных конформациях, которые ингибируют их движение, нарушая тем самым баланс между конформацинными состояниями 16S rРНК , когда она вступает в цикл трансляции (Box 2).

РНК at the core: the peptidyl-transferase site

Большая субъединица выглядит в отличе от малой как  компактный монолитный блок примерно 25 nm в диаметре с довольно равномерным распределением массы. Лицевая сторона большой субъединицы, которая находится в контакте с малой субъединицей, не имеет выраженных структурных характеристик, за исключением  большого каньона, фланкировнного РНК гребнем. Этот гребень образуется одиночным доменом РНК (домен V  23S rРНК) и обнаруживает меньшую flexibility во время трансляционного цикла, чем  малая субъединица РНК. Каньон достаточно велик, чтобы воспринять 3'-aminoacyl acceptor стебли от трех молекул tРНК (локлаизованных в  A, P и E сайтах; (Box.1), и он содержит активный сайт для образования пептидных связей. Структура 50S субъединицы, ассоциированой с аналогом, мимикрирующим субстраты для  A и P сайтов, указывает на то, что функциональные группы, вовлеченные в реакцию peptidyl-transfer (Рис. 1) плотно упакованы в виде РНК кармана внутри домена  V  23S rРНК. Эта структура формируется нуклеотидами, которые более чем на 95% законсервированы во всех трех царствах живых существ. Домен стабилизируется с помощью длинных расширений четырех r-proteins,  которые однако слишком далеко, чтобы участвавать непосредственно в катализе.  Следовательно, peptidyl-transfer реакция катализируется  с помощью РНК.

Рис.1.  |  Peptide bond formation.

На основании структуры 50S субъединицы в комплексе с аналогом, который мимикрирует субстрат для A и P сайтов, адениновый остаток (A2451 in E. coli) локализован ~0.3 nm от пептида, связь с которым должна быть сформирована, это имеет ключевую роль для катализа. A2451 повсюду функционирует как общее основание вместе с N3 удаленным протоном из ?-amino группы aminoacyl-tРНК, способствуя его атаке на peptidyl-tРНК, и затем возвращая протон назад, чтобы стабилизировать покинутую им группу после переноса peptidyl. Это - ACID-BASE CATALYSIS .

Чтобы работать при физиологической  pH, A2451 нуждается в очень высоком pK_a (который м.б. определен по ACID-DISSOCIATION CONSTANT , т.к. N3 обычно protonated только при очень кислой pH. Предполагаемый механизм был charge-relay механизмом, связанным с взаимодействием  между A2451 и G2447, и между G2447 и фосфатом из A2450, который целиком спрятан в структуре rРНК. Эти взаимодействия м. б. результатом стабилизации редкой, TAUTOMERIC формы G2447 и A2451 и последующего увеличения негативно заряженной плотности N3 из A2451. Такая система напоминает charge-relay механизм. установленный для сериновой протеазы (напр., chymotrypsin). Эта модель подтверждается химическими тестами, показавшими, что pK_a A2451 на самом деле сильно изменено в интактной  рибосоме. Более обстоятельное подтверждение получено в in vitro селекции ribozyme с peptidyl-transferase активностью, которая содержит все каталитические остатки, участвующие в charge-relay системе.

Мутации G2447, которые как ожидалось будут ингибировать charge-relay механизм, на самом деле вызвали резистентность к антибиотику linezolid in vivo, это м. указывать на то, что рибосомы функциональны, а мутации ни A2451, ни G2447 не блокируют peptidyl-transferase активность in vitro. Эти результаты, по-видимому, показывают, что charge-relay система не нужна для peptidyl-transferase активности, однако она, тем не менее, м. участвовать in vivo. Аккуратность относительного позиционирования реагирующих групп с помощью 23S rРНК м.б. достаточной, чтобы перенос peptidyl происходил одновременно — тогда она оказалась бы ненужной для РНК-опосредованного химического катализа. Проблема  с интерпретацией в том, что peptidyl-transferase активностьне является лимитирующей скорость трансляции; она м.б. даже существенно снижена и окажет лишь незначительный эффект на рост и измеряемую скорость трансляции.

Синтезируемый полипептид удаляется из рибосомы через выходной туннель примерно в 10-nm длиной и 1–2-nm шириной. Он идет от центра каньона, где находится центр пептидил-трансферазы, через заднюю часть большой субъединицы. Туннель м. содержать до  50 аминокислот и обнаруживает заметные сужения и изгибы, которые  м. ограничивать складывание полипептида до того, как он достигнет сольвента и свяжется  с хапероновыми белками. Складываение внутри туннеля д.б. ограничено образованием ?-спирали. Самый узкий сегмент образуется неглобулярными  расширениями r-proteins L4 и L22. Они образуют проход в  1.2-nm, который м чувствовать синтезируемую цепочку, как она формируется  и  передавать сигнал на поверхность частицы через свой глобулярный домен.

Making ribosomes

Синтез рибосом обнаруживает высокую степень эволюционого консерватизма. У всех организмов зрелые rРНКs генерируются  в результате пост-транкрипционого процессинга из POLYCISTRONIC предшественника rРНК (pre-rРНК). И организация pre-rРНКs (Рис. 2) и пути процессинга pre-rРНК (Рис. 3) хорошо законсервированы. Колючевыми ступеньками синтеза рибосом являются: транскрипция pre-rРНК; ковалентная модификация областей зрелой rРНК из pre-rРНК; процессинг pre-rРНК в зрелую rРНКs; и сборкаe rРНКs с рибосомными белками. IУ эукариот, добавочная ступень включает импорт r-proteins из цитоплазмы в ядро и экспорт рибосомальных субъединиц из ядрышка через нуклеоплазму  и комплекс ядерных пор в цитоплазму (Box 3)

(Box.3) Box 3 | Key steps in eukaryotic ribosome synthesis

Рис. 2.  |  Conserved organization of the pre-rРНК.

Рис.3.  |  Conserved features of pre-rРНК processing in bacteria и eukaryotes.

Компактная природа структуры РНК, видимая в рибосомальных субъединицах, представляет проблему для биосинтетической machinery. Чтобы обеспечить доступ  к процессингу, модификации и сборке факторы должны появляться в сторогой временной последовательности во время синтеза рибосом. Финальное складывание rРНК д.б. задержано вплоть до последнего этапа пути, поддерживая ключевые области pre-РНКsв относительно рыхлом состоянии. После этих ступеней rРНК д.б. сложена по новому в зреулю структуру.  ATPase активность E. coli РНК HELICASE, DbpA специфически стимулируется путем связывания с фрагментом peptidyl-transferase центра, указывая тем самым на возможную роль в формировании каталитического стержня 50S субъединцы. Синтез E. coli 30S вызывает большую структурную изомеризацию, которая контролирует образование центрального  pseudoknot, дистанционного взаимодействия, которое является стержневым свойством 16S rРНК складывания. Это взаимодействие соединяет три основных домена зрелой малой субъединицы -  головку, платформу и тело.  В pre-rРНК,  5' область 16S rРНК является основой для спаривания с фланкирующей последовательностью в EXTERNAL TRANSCRIBED SPACER (ETS) области, предупреждая тем самым образование pseudoknot и поддерживая открытой структуру  в  16S rРНК.

У эукариот преждевременное образование  центрольного pseudoknot м.б. предупреждено за счет связывания 5' конца 18S rРНК с U3 SMALL NUCLEOLAR РНК (snoРНК) скорее, чем с  pre-rРНК spacer. РНК helicase, ассоциированная с U3 snoРНК м. участвовать в этой активнвости. Поразительно, в синтез дрожжевых рибосом вовлечено не менее 17 предполагаемых РНК helicases, указывая тем самым на необходимость экстенсивной структурной реорганизации.

Функциональные бактериальные рибосомы м. собираться in vitro из rРНКs и белков, однако, необходимы специфические условия.  Установлена последовательность добавления r-proteins и существенная кооперативность в связывании r-белков, со сборкой nucleated, с помощью небольшого числа первичных rРНК-связывающих белков. Для 50S субъединицы получены четкие доказательства структурной перестройки, которая нуждается в инкубации при повышенной температуре. Путь сборки не выяснен до конца структурным анализом, но в одном случае  связывания S15 белок как установлено реорганизует и стабилизирует сложную структуру в rРНК, которая необходима для последующего связывания двух др. r-белков. Очень возможно, что многие др. такие циклы структурной перестройки и стабилизации сопровождающиеся  связыванием специфических белков, происходят во время сборки рибосом.

Помимо процессинга rРНКs у всех организмов подвергается экстенсивным ковалентным модификациям нуклеотидов в месте, которое образует кластер  вблизи активного стержня рибосомы. Эти модификации возможно имеют целью плотную упаковку rРНКs поседством TERTIARY INTERACTIONS .

Некоторые активности процесснга pre-rРНК еще нужно идентифицировать, в частности у дрожжей S. cerevisiae (обозначено ? на Рис.3). Возможно, все нуклеазы, указанные на (Рис.3.), у E. coli и yeast, обеспечивают процессинг и др. РНКs  помимо pre-rРНКs.

Shifeng Xue & Maria Barna Specialized ribosomes: a new frontier in gene regulation and organismal biology Nature Reviews Molecular Cell Biology 13, 355-369 (June 2012) | doi:10.1038/nrm3359

Исторически рибосомы рассматриваются как комплекс рибозимов с конституитивной скорее, чем прирожденной регуляторной способностью в трансляции мРНК. Однако появляющиеся исследования выявили, что активность рибосом может регулироваться. Гетерогенность в составе рибосом, возникающая в результате дифференциальной экспрессии и посттрансляционных модификаций рибосомальных белков, разнообразие рибосомальных РНК (rRNA) и активность ассоциированных с рибосомами факторов может генерировать 'специализированные рибосомы', которые оказывают существенное влияние на то, как геномная матрица транслируется в функциональные белки. Более того, конституитивные компоненты рибосом могут также обеспечивать более специализированные активности за счет эффективных их взаимодействий со специфическими мРНК регуляторными элементами, такими как internal ribosome entry sites (IRESs) или upstream open reading frames (uORFs). Обсуждается гипотеза, что внутренне присущая регуляция с помощью рибосом действует избирательно, чтобы транслировать субнаборы мРНК, обладающих уникальными цис-регуляторными элементами, внося тем самым дополнительный уровень регуляции генной экспрессии и жизни организма.