Gene Silencing

Молчание генов

ORIGINAL RESEARCH PAPERS Kirchmaier, A. & Rine, J. DNA replication-independent silencing in S. cerevisiae. Science 291, 646-650 (2001) | Article | PubMed | ISI |
Li, Y.-C., Cheng, T.-H. & Gartenberg, M. R. Establishment of transcriptional silencing in the absence of DNA replication. Science 291, 650-653 (2001) | Article | PubMed| ISI |
FURTHER READING Smith, J. S. & Boeke, J. D. Is S phase important for transcriptional silencing? Science 291, 608-609 (2001) | Article | PubMed | ISI |
WEB SITE Chromatin structure and function page


Между ранней S фазой и G2/M происходит сдвиг клеточного цикла, который позволяет сделать экспрессию генов молчащей. В ответ на это событие хроматин воспринимает измененную форму - гетерохроматина - которая предупреждает транскрипционную кухню (machinery) от нахождения своих генов-мишеней. Репликация ДНК подстегивает это переключение.
Анализировали у почкующихся дрожжей HMRa локус типа спаривания, который молчит во время образования гетерохроматина. Silencing нуждается в связывании некоторых белков с цис-действующими элементами, называемыми сайленсерами (silencers). Среди этих белков находится и origin-recognition complex (ORC), который участвует в инициации репликации ДНК (однако эта функция отделима от его роли в silencing). ORC затем рекрутирует Sir (silent information regulator) белок Sir1, а он, в свою очередь, облегчает включение дальнейших Sir белков в гетерохроматин.
Сравнивали образование гетерохроматина на хромосомном HMRa на нереплицирующейся, экстрахромосомной кольцевой ДНК (которая вырезается с помощью сайт-специфисеской рекомбинации)и не м. реплицироваться из-за отсутствия ORC-связывающего сайта. Для выяснения необходимости ORC в silencing, авт. сконструировали или Gal4 (Kirchmaier and Rine) или LexA (Li and colleagues) DNA-связывающие сайты во внехромосомном кольце. Для экспрессии Gal4-Sir1 или LexA-Sir1 слитых белков предоставляли все инградиенты, необходимые для silencing.
Выявлены незначительные отличия в silencing двух HMRa локусов, следовательно, репликация не нужна для инициации этого процесса. Подтверждено, что прохождение через S фазу обязательно для silencing.
Но если не репликация, то что вызывает переключение? Предполагается, что активность silencing компонентов - и вообще Sir белков - контролируется cell-cycle-зависимым образом, возможно, регулируя синтез кофакторов или ингибиторов деградации.
Gene silencing: double-stranded RNA mediated mRNA degradation and gene inactivation
Wei T, Luo X.Y, Sanmuels V.
Cell Res. V.11. N 3.P. 181-186. 2001


РНК участвует в двух типах homology-dependet gene silencing (HDGS): 1)Посттранскрипционном молчанием генов (PTGS), связанным с целенаправленной деградацией гомологичныхРНК в цитоплазме; 2) РНК-управляемым метилированием ДНК (RdDM), которое м.б. индуцировано с помощью РНК, получаемой с гомологичных ДНК последовательностей на уровне генома. Механизмы этих разных способов HDGS и характеристика участвующих РНК активно исследуются. Двунитчатая РНК (днРНК) играет двойную роль в молчании генов у растений, инициируя ступень РНК-деградации как в PNGS, так и в RdSM.

Модель dsRNA-обусловленного генного молчания. Показаны ступени, с вовлечением dsRNA, и ступени, которые затрагиваются вирусными супрессорами потстранскрипционного генного молчания и у разных PTGS мутантов. Транскрипционное генное молчание м.б. запущено непосредственно с помощью транскрипции последовательностей инвертированных посторов в ядре и с помощью метилирования гомологичных промоторных областей в геноме. dsRNA и др. аберрантные РНК формируются в ядре и вступают на путь PTGS. Индуцированное вирусом молчание генов обеспечивается вирусным RdRP, а индуцированное трансгенами молчание обеспечивается клеточной RdRP, что ведет к PTGS в цитоплазме. dsRNA из обоих этих источников м.б. отловлена с помощью предполагаемой dsRNA специфической рибонуклеазы, которая генерирует РНК в 21-25 нуклеотидов. PTGS м.б. индуцирован локально и затем распространипться с помощью мобильных сайленсинг сигналов. РС-Pro супрессирует молчание генов путем активирования эндогенного клеточного супрессора PTGS, rgs-CaM. PVX p25 супрессор PTGS предупреждает гнакопление мобильных сайленсинг сигналов путем взаимодействия с клеточной RdRP ветвью пути.

Gene silencing mechanism mediated by dsRNA
Исследованияи на растениях было установлено, что молчание сопровождается накоплением малых РНК (21-25 нуклеотидов) как в смысловой, так и антисмысловой ориентации, которые гомологичны молчащему локусу, возникающих в результате сиквенс-специфической деградации РНК. Молчание м. запускаться локально и затем распространяться по организму растения с помощью мобильных silencing сигналов. Согласно модели сайленсинга происходит следующее: 1) синтез и амплификация днРНК; 2) расправление днРНК; и 3)нахождение мРНК после связывания с рибосомами. Клеточная РНК-управляемая РНК полимараза (RdRP) играет центральную роль в пострансляционном сайленсинге генов. Ее возможная функция - синтез cRNA с абератных РНК матриц, ведущий к образованию днРНК.
HC-Pro (helper component proteinase) супрессия постранскрипционного молчания не взаимодействует ни с продукцией, ни с движением сайленсинг сигнала, а предупреждает растения от реакции на этот сигнал, т.е. действует на ступень, предшествующую накоплению малых РНК. Идентифицирован calmodulin-родственный белок (rgs-CaM), который взаимодействует с HС-Pro. Этот rgsCaM белок супрессирует молчание генов и м.б. промежуточной субстанцией в супрессии посттранскрипционного молчания с помощью РС-Pro. Так как калмодулин и родственнные ему белки действуют связывая кальций и тем активируя белки-мишени, то РС-Pro супрессия возможно осуществляется за счет активации rgs-CaM и неизвестного белка-мишени. Белок PVX p25? повидимому, супрессирует посттранскрипционное молчание с помощью нахождения мобильного сайленсинг сигнала. Малые смысловые и антисмысловые РНК, связанные с молчанием, возникают в результате расщепления днРНК, а специфическая рибонуклеаза обеспечивает нахождение гомологичных мишеней РНК. Малые РНК накапливаются при молчании генов, индуцированных вирусом и трансгеном. Это указывает на конвергенцию этих двух процессов молчания до образования сиквенс-специфической рибонуклеазы.
Methylation and posttranscriptional gene silencing
Метилирование или кодирующих или транскрипбируемых областей трансгенов обнаруживается во многих случаях PTGS у растений. Возникновение и поддержание PTGS, по-видимому, нуждается в эпигенетических модификациях ДНК. Механизм RdDM неизвестен, но предполагается, что он связан с РНК-ДНК взаимодействием, базирующемся на помологии последовательностей. Минимальный размер мишени ДНК для RdDM 30 п.н., что позволяет предположить, что продукты дегардации РНК в 21-25 нуклеотидов днДНК ответственны за направление метилирования. Малые РНК м., по-видмому, вести ДНК метил трансферазу к немодифицированным гомологичным ДНК последовательностям.
RNA-directed DNA methylation (RdDM) представляет собой альтернативный способ индукции сиквенс специфического метилирования, наблюдаемого как при посттранскрипционном, так и транскрипционном молчении генов. RdDM вызывает плотное метилирование большинства симметричных и несимметричных цитозинов внутри области гомологии между индуцирующей РНК и мишенью ДНК. Метилирование последовательностей дупликаций, ассоциирванное с HDGS (homology-dependet gene silencing), связано с ДНК-ДНК спариванием и ДНК мишенями в 30 п.н., котоые м.б. модифицированы.
Cellular protein involved in posttranscriprional gene silencing
Хотя потребность в RdRP очевидна, природа субстрата для этого энзима неясна. RdRP, как полагают, использует предсуществующую lyHYR или аберантную смысловую РНК как матрицы для для синтеза антисмысловых РНК. Аберантная РНК - неправльно сплайсирована или закончена.

Post-transcriptional Gene Silencing By Double-stranded RNA
Scott M. Hammond, Amy A. Caudy & Gregory J. Hannon
Nature Reviews Genetics 2, 110 -119 (2001)



Рис.1.

How does RNAi work?

Приложение.3.

Delivering double-stranded RNA

Приложение.4.

What does RNA interference do for me?


RNA interference (RNAi) - это процесс, с помощью которого двунитчатая РНК специфически делает молчащей (silences) экспрессию гомологичных генов благодаря деградации их cognate мРНК. Сайленсинг (Silencing), следовательно, пост-транскрипционный феномен.
Генетическое молчание, которое наступает с помощью процесса RNAi, высоко специфично и базируется на последовательностях двунитчатой РНК.
Пост-транскрипционное молчение генов у растений и грибов механистически сходно с процессом RNAi у животных.
Деструкция мРНК обеспечивается мультикомпонентными нуклеазами, называемыми RNA-induced silencing complex, или RISC.
Внесенные двунитчатые РНК подвергаются процессингу на короткие РНК в 22 нуклеотида, которые инкорпорируются RISC. Здесь они действуют как РНК-наводчики ('guide RNAs'), сообщая нуклеазам специфические особенности мишеней.
Ряд молекул, которые участвуют в процессе RNAi, идентифицирован во многих модельных системах.
Предполагается, что биологической ролью RNAi является резистентность к вирусам, превращение транспозонов в молчащие и регуляция экспрессии эндогенных генов, в частнрости во время развития.
RNAi становится ценным экспреиментальным инструментом для исследования функции генов у Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster и растений.
Когда механизм RNAi будет более понятен он может стать мощным технологическим средством для изучения широкого круга систем, включая и организмы млекопитающих и культивируемые клетки.

The Complexity of Gene Silencing
Jim Kling
The Scientist 16[4]:31, Feb. 18, 2002


Researchers demonstrate the physical association between histone deacetylases and methyl-CpG binding proteins
Jim Kling interviewed University of Edinburgh geneticist Adrian Bird and Paul A. Wade, assistant professor in the department of pathology and laboratory medicine at Emory University School of Medicine in Atlanta.


1. E. Russo, "Hot papers in acetylation," and "Hot papers in deacetylation," The Scientist, 13[5]:13, March 1, 1999.

2. B.A. Maher, "Researchers focus on histone code," The Scientist, 15[18]:15, Sept. 17, 2001.

3.Y. Zhang et al., "Analysis of the NuRD subunits reveals a histone deacetylase core complex and a connection with DNA methylation," Genes & Development, 13:1924-35, 1999. (Cited in 117 papers).

4.S.K. Bhattacharya et al., "A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA," Nature, 397:579-83, 1999.

5. B. Hendrich et al., "Closely related proteins MBD2 and MBD3 play distinctive but interacting roles in mouse development," Genes & Development, 15:710-23, March 15, 2001.


SILENCE OF THE GENES - MECHANISMS OF LONG-TERM REPRESSION

Laura Lande-Diner, Howard Cedar

Nature Reviews Genetics 6, 648-654 (2005);

A large fraction of genes in the mammalian genome is repressed in every cell throughout development. Here, we propose that this long-term silencing is carried out by distinct molecular mechanisms that operate in a global manner and, once established, can be maintained autonomously through DNA replication. Both individually and in combination these mechanisms bring about repression, mainly by lowering gene accessibility through closed chromatin structures.


Рис.1.  |  Several repression mechanisms.


Box 1  |  Sequence-dependent repression


Box 2  |  DNA methylation


Box 3  |  Replication timing

Ацетилирование гистонов и метилирование ДНК два важные химические изменения, участвующие в хореографии транскрипционной регулировки. Известно, что они работают сочетанно, чтобы включать и выключать гены и регулировать их экспрессию. Удалось показать физическую ассоциацию между гистоновыми deacetylases и methyl-CpG связывающими белками.
Гистоны, это белки, которые формируют цилиндрические tuna-can-like структуры, которые действуют как остовы, вокруг которых закручивается ДНК. Гистоновые deacetylases удаляют acetyl группы с гистоновых белков. Возникающие в результате химические изменения индуцируют структурные перестройки, которые м. запускать или репрессировать транскрипцию генов. Тем временем, метилирование ДНК ведет к молчанию гена. Тот факт, что эти две функции завернуты в одном и том же комплекск указывает на интригующий механизм того, как гены становятся молчащими.
Две группы исследователей Adrian Bird и Paul A. Wade начав исследования с разных концов пришли к одному заключению: связывание с метилированной ДНК непосредственно сцеплено с гистоновой деацетилазой, которая реструктуирует хроматин и сдерживает транскрипцию.

Leaving the Islands


Одним из интереснейших свойств генома человека являются его "CpG islands," которые являются длинными участками, содержащими большое количество cytosine-guanine динуклеотидов. Было известно, что некоторые участки CpG островков, часто вблизи промоторов, неметелировны. Bird с сотр. начали поиск HeLa клеток по белкам, способным связываться преимущественно с метилированной ДНК. "Most of the genome is heavily methylated, [so] how do some regions escape?" задался вопросом Bird. "I hypothesized that there may be a protein that bound to non-methylated DNA to protect if from methylating enzymes. To our surprise, when we looked, nothing bound to the nonmethylated DNA, but something did bind strongly to the methylated DNA that we had in the experiment as a negative control.... So we forgot about what it takes to make a CpG island and focused on proteins that bound to methylated DNA instead."
Группа Bird's выделила связывающую метилированную ДНК активность и установила комплекс, названный ими MeCP, (теперь называется MeCP1). MeCP1 обусловливает репрессию транскрипции репортерного гена, но очистка и идентификация его компонентов оказалась затрудненной частично из-за большого размера. Согласно Bird: "We thought we could do it by DNA affinity, but every time we did that ...the act of binding to the DNA seemed to destroy the complex."
Спустя декаду удалось очистить комплекс (группе Wade's), и были получены доказательства, что гистоновая deacetylases играет роль в хроматиновых комплексах, которые в свою очередь влияют на транскрипцию генов.

Focus on Mt. Everest


"We had some emerging data from studies of methylated DNA, and [the] finding was that micro-injected DNA templates that were methylated were profoundly repressed, and that repression required time for chromatin assembly," hfccrfpsdftn Wade, член группы Wolffe's в то время. "This repression was sensitive to [a histone deacetylase inhibitor]." Началась работа по выделению histone deacetylatases из экстрактов яиц Xenopus laevis (African frog).
Одна из histone deacetylase встречается чаще, чем др. "We went for the biggest peak". Активность гистоновой деацетилазы была сцеплена с комплексом из 6 субъединиц и самая мальенкая из них была MBD3, белок которой, как известно, связыватся с метилированной ДНК. Обнаружение связи активности связывания метилированной ДНК с активностью гистоновой деацетилазы (которая также связана с этим комплексом), которая вызывает изменения в транскрипции, открывает "attractive mechanism for explaining why DNA that is modified by methylation is so profoundly repressed," сказал Wade. Было предположено, что MBD3 связывает метилированную ДНК, принося с собой гистоновую деацетилазу, которая реструктуирует хроматин, приводя к супрессии транскрипции.

All in the Family
Ntv временем группа Bird's продолжала попытки очистить MeCP1, был выделен родственный белок, MeCP2, который обладает сходными свойствами. С ео последовательностяим в руках Bird с сотр. начали поиск последовательностей в известных базах данных для сравнения. Они нашли семейство белков, которое имеет сходные последовательности с ДНК-связывающим доменом MeCP2's, которое оказалось частью той же самой группы белков, котору наблюдал Wade, MBDs. Один член семейства, MBD2, как было известно, связывается с метилированной ДНК in vitro и in vivo. Все еще будучи нацеленым на MeCP1 комплекс, группа Bird's использовала anti-MBD2 антитела, чтобы показать, что MBD2 присутствует внутри него.
Вскоре стало ясно, что anti-MBD2 антитела удаляют из клеточных экстрактов их MeCP1 активность. "We knew the antibody was specific and it just took away all the activity. As far as I was concerned, that [action] was quite strong evidence that MBD2 was in this complex," говорит Bird. Затем группа стала исследовать активность гистоновой деацетилазы и нашла, что 27% deacetylase потенциала в клеточных экстрактах устраняется с MBD2 и ее антителами, указывая, что ответственный энзим сцеплен с MBD2. Позднее эта связь была подтверждена с помощью антител против одной из deacetylases, также захватывающих MeCP1 комплекс и MBD2. "It was a bit of a breakthrough in helping to understand how DNA methylation (relates to) co-repressor complexes that change chromatin structure," сообщил Bird.
В это же время Danny Reinberg of the Molecular Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center in New York City, работал над др. HeLa-derived комплексом, называемым NuRD (nucleosome remodeling) комплексом. "But he didn't have a DNA binding factor," отмечает Bird, который предоставил группе Reinberg's доступ к MBD2. Команда Reinberg's установила, что их комплекс содержит MBD2.
Ита, был сделан вывод, что MBD2 является demethylase, но ни Bird's, ни Wade's группы не смогли воспроизвести эти результаты. "That's a fairly unusual thing, for research groups to go out on a limb and say they can't do something," говорит Bird.
Группа Bird's предприняла исследования с нокаутом мышиного гомолога MBD2, который давал животных с нормальным фенотипом за исключением того, что они бросали свое потомство. "We now want to bridge the gap between DNA methylation and maternal behavior," заявляет Bird.
Wade думает сходным образом. "A large number of us are thinking about function.... There is a little evidence that some subunits of the complex are important for patterning or development in Caenorhabditis elegans; how it gets recruited, what it does to the local chromatin architecture is unknown. These are [questions] that will keep many of us busy, I would predict, for at least a decade."
Сайт создан в системе uCoz