Пост-транскрипционные модификации белков являются важным средством для изменения их функции, активности или локализации после их синтеза. Модификации с помощью ubiquitin представлют собой уникальный случай, т.к. модификаторы сами по себе являются малыми пептидами. Убиквитин обычно присоединятся к лизиновой стороне цепи белка мишени, давая 'branched', ISOPEPTIDE -сцепленный конъюгат убиквитин–белок (см page 169). Ubiquitylation или ubiquitination необходима для маркирования блеков для деградации с помощью 26S PROTEASOME (см page 179). Убиквитин-подобные белки распадаются на два отдельных класса. 'Ubiquitin-like modifiers' (UBLs) функционируют как модификаторы аналогично убиквитину. Напр., SUMO (small ubiquitin-related modifier), Rub1 (называемый также Nedd8), Apg8 и Apg12 (см. page 211). Белки второго класса, включают parkin, RAD23 и DSK2, являются 'ubiquitin-domain proteins' (UDPs). Эти белки обладают доменами, которые родственны своими последовательностями убиквитину, но неродственны др. др. Они не конъюгируют с др. белками.

UBL белок SUMO (называемый также sentrin) присутствует у всех эукариот и высоко законсервирован от дрожжей до человека. Если у беспозвоночных имеется лишь один ген SUMO, который был назван SMT3, то три члена семейства SUMO описаны у позвоночных: SUMO-1 и близкие ему гомологи SUMO-2 и SUMO-3. SUMO-1, известный также как PIC-1, sentrin или GMP1. SUMO-1 человека, полипептид из 101 аминокислты, обладает 50% идентичностью последовательностей с SUMO-2/SUMO-3 и с дрожжевым Saccharomyces cerevisiae Smt3 белком (Рис. 1). Хотя идентичных последовательностей между SUMO-1 и ubiquitin всего лишь около 18%, структура обоих при NMR обнаруживает общие трехмерные образования, которые характеризуются плотно упакованными глобулярными складками с β-sheets, обернутыми вокруг одной α-спирали. SUMO имеет короткое N-терминальное расширение, которое отсутствует у убиквитина. Функция этого расширения неизвестна, а последовательности разные для определенных членов SUMO (Рис. 1). Было установлено, что ковалентные модификации белков субстратов представляют собой новые пост-транскрипционнные модификации.

(Рис.1.) | Sequence alignment of SUMO family members и ubiquitin

Pathway of SUMO conjugation

Путь sumoylation механистически аналогичен ubiquitylation, но SUMO conjugation необходима для др. набора энзимов (Рис. 2). Убиквитин синтезируется как неактивный предшественник, который подвергается процессингу с помощью специфической протеазы (наз. ubiquitin carboxy-terminal hydrolase), которая делает С-концевой двойной глициновый мотив доступным для конъюгации. Ubiquitin сначала активируется с помощью ubiquitin-activating enzyme E1 и затем переносится на реактивный цистеиновый остаток одного из нескольких E2s (ubiquitin-conjugating enzyme или UBC). В большинстве случаев, по крайней мере, еще один фактор, наз. E3 или ubiquitin–protein ligase, необходим для образования изопептидного мостика между убиквитином и белком мишенью. E3s, по-видимому. отвечает за специфичность субстрата. Обычно несколько молекул убиквитина конъюгируют с субстратом в форме т.наз. 'multi-ubiquitin' цепи и дают multi-ubiquitylated белки, предпочитаемые 26S протеосомами. Для multi-ubiquitylation иногда необходим еще один фактор, наз.E4.

(Рис.2.) | Conjugation pathway of ubiquitin и the ubiquitin-like modifier SUMO.

Подобно убиквитину все SUMO образуются первоначально как неактивные предшественники. Они созревают в результате протеолитического расщепления carboxy-конца. В итоге зрелые модификаторы экспозируют на С-конце остатки глицина. Эти остатки необходимы для образования конъюгатов SUMO–protein, т.е. образования изопептидного мостика между С-концом SUMO и ε-amino группой лизинового остатка белка мишени. Реакция катализируется группой CYSTEINE PROTEASES , наз. ULPs (ubiquitin-like protein-processing enzyme) или SUMO-specific proteases. SUMO-специфическая активность E1 очищена и охарактеризована у дрожжей и человека. Белок гетеродимерный , состоит из белков AOS1 (SUA1) и UBA2 (SUA2). UBA2 обладает четким сходством последовательностей с С-терминальной областью UBA1, E1 энзимом для убиквитина, тогда как AOS1 сходен с N-терминальной частью UBA1. Субъединица UBA2 обладает 'active site' цистеиновым остатком, необходимым для образования SUMO–E1 enzyme thioesters, однако обе субъединицы необходимы для активации SUMO in vitro и in vivo . SUMO имеет единичный E2-типа-конъюгирующий энзим, UBC9, который специфичен для SUMO и не влияет на убиквитин. Сравнение UBC9 с ubiquitin-специфическим E2 энзимом показало, что несмотря на общее сходство, имеются существенные различия между энзимами. В частности, поверхность UBC9, которая участвует в связывании SUMO, в основном заряжена позитивно, тогда как соотв. области ubiquitin-specific E2s (напр., UBC4 и UBC7) имеют негативный или нейтральный потенциал. Позитивно заряженная связывающая поверхность UBC9 высоко комплементарна по своему электростатическому потенциалу и гидрофобности негативно заряженной поверхности SUMO. Ubiquitin не может соединиться с UBC9, т.к. позитивно заряжен в этой области. UBC9 физически взаимодействует с почти всеми известными SUMO субстратами, следовательно. важен для распознавания субстрата. Но возножно за специфичность по аналогии отвечает еще неидентифицированная E3-type лигаза. В противоположность убиквитинину, конъюгация SUMO, по-видимому, не ведет к образованию SUMO–SUMO цепей. Типичные branched-point lysine residues (K29, K48, K63) убиквитина не присутствуют у SUMO.

SUMO de-conjugation

Sumoylation - это динамичный обратимый процесс. Отделение SUMO от белка мишени 'de-sumoylation', катализируется с помощью ULP протеаз. У дрожжей идентифицировано два таких энзима — Ulp1 и Ulp2. In vitro Ulp1 и Ulp2 м. катализировать процессинг С-конца SUMO и оба энзима м. удалять SUMO из isopeptide-linked конъюгатов. Сходство последовательностей ограничено 200 аминокислоными последовательностями, называемыми ULP доменом, котрый представляет собой каталитически активную область. Трехмерная структура ULP домена от Ulp1 определена в комплексе с S. cerevisiae SUMO (Smt3) предшественником (Рис. 3). Интересно, что Ulp1 не обнаруживает общих последовательностей или структурного сходства с de-ubiquitylating энзимами, хотя оба пиндлежат к сверхсемейству цистеиновых протеаз.

(Рис.3.) | Structure of the ULP-1–SMT3 complex.

конъюгации SUMO, де-конъюгация SUMO необходима для жизнеспособности почкующихся дрожжей. У этого организма лишь Ulp1, но не Ulp2, существеннен для жизнеспособности. SUMO конъюгаты накапливаются в клетках, лишенных или ULP1 или ULP2. Интересно, что SUMO CONJUGATE PATTERN определенный для каждого индивидуального мутанта, следовательно, два энзима действуют на разные субстраты. В соответствии с этим избыточная экспрессия ULP2 не м. супрессировать летальности делеции ULP1. Однако, инактивация ULP2 частично восстанавливает дефекты, вызванные дефицитом ULP1, а двойные мутанты накапливают меньше SUMO conjugates, чем любой из одиночных мутантов. У человека идентифицировано по крайней мере 7 ULPs, с размером от 238 до 1,112 аминокислот. Энзимы были названы SENPs или SUSPs (sentrin/SUMO-specific proteases). Разумно предположить, что разные энзимы м. иметь специализировнные функции. Правда разнообразие де-конъюгационных систем SUMO у млекопитающих м.б. объяснено частично тем фактом, что высшие эукариоты экспрессируют разные формы SUMO ( SUMO-1, -2, -3). Так, идентифицирован SUSP энзим у мышей, Smt3-specific isopeptidase 1 (SMT3IP1), которая обнаруживает in vitro более высокую расщепляющую активность в отношении SUMO-2 conjugates, чем SUMO-1 конъюгатов. На клетках млекопитающих показано, что ULPs имеют различную внутриклеточную локализацию. Напр., энзим млекопитающих SENP-1, который локализуется в ядре, не действует на цитоплазматические SUMO–RanGAP1 конъюгаты, но удаляет SUMO из ядерного субстрата PML (promyelocytic leukaemia). Однако, и др. факторы также важны, т.к. цитозольный SUSP-1 не отделяет SUMO от RanGAP1.

Main functions of SUMO

SUMO имеет значительно меньше клеточных субстратов, чем убиквитин, но некоторые из идентифицированных мишеней являются важными клеточными регуляторами (Table 1; ONLINE Fig 1). Обсуждаются две функциональные модели действия SUMO .

(Табл.1) | Known substrates for SUMO

An address tag for protein targeting? Первым идентифицированным субстратом для SUMO-1 был Ran GTPase-активируемый белок RanGAP1, компонент ядерного импорта machinery. RanGAP1 является ключевым регулятором Ras-like GTPase Ran, которая контролирует ядерно-цитоплазматический транспорт. Лишь SUMO-1–RanGAP1 конъюгаты м. стабильно взаимодействовать с Ran-binding protein 2 ( RanBP2), белком, расположенным на цитоплазматической стороне NUCLEAR PORE COMPLEX . Это м. указывать на то, что sumoylation или направляет RanGAP1 в комплекс ядерных пор или, напротив, стабилизирует RanGAP1–RanBP2 комплексы. Области в RanGAP1 , которые детерминируют sumoylation и RanBP2 связывание, не перекрываются. Это указывает на то, что SUMO не прямо обеспечивает RanBP2 связывание, а скорее индуцирует структурные изменения в RanGAP1, которые позволяют ему связываться с RanBP2.

Дрожжевой гомолог RanGAP1, Rna1, не имеет С-терминальной области RanGAP1 млекопитающих, которая является местом sumoylation, и , по-видимому, не sumoylated. Однако, белок ULP1 взаимодействует с компонентами комплекса ядерных пор дрожжей, указывая на то, что sumoylation у дрожжей также м. функционировать на путях ядерного транспорта. У Drosophila melanogaster мутация потери функции гена UBC9 (semushi ) предупреждает импорт в ядро транскрипционного фактора BICOID , это ведет к нарушению эмбриогенеза. Связано ли это с нарушением sumoylation Drosophila RanGAP1 белка?

Наиболее интригующие субстраты суляции обнаруживаются в специфических субъядерных протеиновых комплексах, а преимущественными местами накопления sumoylated белков являются т.наз. PML NUCLEAR BODIES (Box 1). PML, определяющий компонент PML ядерных тел, является членом семейства RING-FINGER PROTEINS . Он обнаруживает определенные ростовые и tumour-suppressive свойства и выполняет pro-apoptotic функцию. Эти активности, по крайней мере, частично обеспечиваются потенциалом PML действовать как транскрипционный ко-активатор совместно с p53 tumour suppressor белком. Фракция PML подвергается sumoylation в трех различных лизиновых остатках в белке. Предполагается, что sumoylation of PML регулирует сборку и/или стабильность ядерных телец. Поэтому детергент нерастворимая, содержащая ядерные тельца, клеточная фракция содержит большие количества SUMO–PML конъюгатов. Разборка ядерных телец с помощью вирусных белков (Box 2) или во время митозов коррелирует с полной потерей PML sumoylation.

После sumoylation of PML, транскрипционный корепрессор Daxx релокализуется в ядерные тельца, где он, по-видимому. сохраняется внеактивном состоянии (Рис. 4). Sumoylation of PML направляет также p53 в ядерные тельца, но это ведет к стимуляции транскрипционной и pro-apoptotic активности p53 скорее, чем к ингибиции. Предполагается, что направление p53 в ядерные тельца м.б. триггером активирующих модификаций в p53, таких как ацетилирование. Предполагается, что ядерные тельца м. стимулировать SUMO conjugation и что белки, которые временно ассоциирут с ядерными тельцами м.б. мишенями для SUMO. Установлено, что p53 сам является мишенью для sumoylation. Сайты sumoylation в p53 локализованы в С-терминальной области, которая регулирует ДНК-связывающую активность белка. В результате sumoylation of p53 до некоторой степени стимулирует транскрипционную и про-апоптическую активность белка. Установлено, что p53-related белок p73 также ковалентно модифицируется с помощью SUMO в своем крайнем С-терминальном лизиновом остатке. Sumoylation of p73 не меняет существенно его транскрипционные свойства, а влияет скорее на его субклеточную локализацию. SUMO–p73 конъюгаты преимущественно обнаруживаются также в detergent-нерастворимых ядерных комплексах.

(Рис.4.) | Sumoylation of PML modulates Daxx-mediated transcriptional repression

Белок Sp100, другой стержневой компонент PML ядерных телец, также является главным клеточным субстратом sumoylation. Точная функция Sp100 неизвестна, но его взаимодействие с хомосомными негистоновыми белками HP1 и HMG1/2 семейств указывает на роль в организации хроматина. Мутантный белок Sp100, неспособный присоединять SUMO, все равно локализуется в ядерных тельцах, указывая тем самым, что sumoylation of Sp100 нужна не для направления его в ядерные тельца. Однако, in vitro, sumoylated Sp100 обнаруживает высокое сродство к HP1 белку, указывая тем, что sumoylation of Sp100 м. непосредственно обеспечивать это взаимодействие. Связана ли sumoylation of Sp100 с рекрутированием HP1 в ядерные тельца и модулирует ли его репрессивную функцию.

Данные по транскрипционным регуляторам HIPK2 и TEL подтверждают роль SUMO в регуляции субъядерной локализации и транскрипционной активности белков. HIPK2 является serine/threonine kinase, которая физически взаимодействует с HOMEODOMAIN TRANSCRIPTION FACTORS и действует как транскрипционный корепрессор. SUMO-1-conjugated HIPK2 форма обнаруживается в detergent-нерастворимых субядерных комплексах. Природа этих ядерных точек не определена, но локализация HIPK2 в них зависит от sumoylation. TEL, ETS-related транскрипционный репрессор также локализуется в S-phase-specific ядерных точках SUMO-зависимым способом. Избыточная экспрессия UBC9 облегчает TEL-обусловленную репрессию, это указывает на модулирование активности TEL с помощью sumoylation. У млекопитающих прото-онкоген c-Jun и androgen receptor sumoylated, а разрушение SUMO-1 акцепторных сайтов этих белков усиливат их транскрипционную активность, следовательно, sumoylation негативно регулирует их трансактивационный потенциал. У Drosophila,транскрипционный репрессор Tramtrack 69 (Ttk69), который ингибирует нейрональную дифференцировку,идентифицирован как один из наиболее важных субстратов для SUMO conjugation. SUMO и Ttk69 белки локализуются на POLYTENE CHROMOSOMES , указывая, что SUMO-conjugated Ttk69 присутсвует в местах действия Ttk69 in vivo. Предполагается, что sumoylation м.модулировать взаимодействие транскрипционных факторов с транскрипционными корегуляторами.

...или an inhibitor of ubiquitylation? Изучение NF-κB ингибитора IκBα и ubiquitin-ligase Mdm2 выявило интересную функциональную cвязь между системами ubiquitylation и sumoylation. Транскрипционый фактор NF-κB неактивен в цитозоле в результате связывания со своим ингибитором IκBα. После стимуляции эффекторами, такими как tumour necrosis factor ( TNF), IκBα фосфорилируется, ubiquitylated и затем деградируется протеосомами. Это освобождает NF-κB от ингибитора и позволяет транскрипционному фактору войти в ядро и активировать гены мишени. Интересно, что SUMO м. конкурировать с убиквитином за IκBα, т.к. оба модификатора нацелены на один и тот же лизиновый остаок в IκBα. SUMO-modified пул IκBα защищен от TNF-индуцированной деградации, а sumoylation of IκBα ингибирует функцию NF-κB.

Система NF-κB/IκBα- эволюционно законсервированный путь, его аналог у Drosophila система Dorsal/ Cactus, в которой Dorsal является гомологом NF-κ B позвоночных, а Cactus соответствует IκBα. Неожиданно оказалось, что Dorsal — не Cactus — подвергается sumoylation. Sumoylation облегчает ядерный импорт Dorsal итем самым активирует его функцию.

Данные по Mdm2 показывают, что SUMO может играть более общую роль по стабилизации белков. Mdm2 это RING-finger белок, который выполняет роль подобную E3-типа убиквитиновой лигазе для p53 и себя самого. Стабильность самого Mdm2 также регулируется с помощью ubiquitin–proteasome системы, предполагается, что SUMO взаимодействует с ubiquitylation of Mdm2. То же наблюдалось для IκBα, где SUMO и ubiquitin действуют на один и тот же лизиновый остаток внутри RING finger of Mdm2. Тогда sumoylation of Mdm2 должна предупреждать ubiquitylation и последующую деградацию. В нормальных клетках большинство Mdm2 обладает подвижностью, соответствующей белку в 90 kDa, которая должна соотвествовать SUMO–Mdm2 конъюгату. Однако, после повреждения ДНК Mdm2 , по-видимому, de-sumoylated и затем ubiquitylated и деградирует. В результате снижения клеточного уровня Mdm2, p53 стабилизируется. Однако неясно. почему 90 kDa Mdm2 виды нечувствительны к ULP-обусловленной de-sumoylation in vitro

What does genetics tell us?

Интересно, что чувствительные к температуре мутанты S. cerevisiae генов для SUMO-activating энзима ( uba2-ts), SUMO-conjugating энзима (ubc9-ts) и de-sumoylation энзима Ulp1 (ulp1-ts) обнаруживают строгие дефекты клеточного цикла. Они вызывают остановку делений на G2/M границе, когда большая почкующаяся клетка реплицирует ДНК, а короткое MITOTIC SPINDLE указывает на то, что sumoylation одной или нескольких мишеней необходима у дрожжей для прохождения клеточного цикла. Мутанты, дефицитные по Ulp2 жизнеспособны, но они имеют фенотипические аномалии, такие как нарушение ходя клеточного цикла, гиперчувствительность к повреждениям ДНК и неправильное расхождение хромосом. Уровень мРНК ULP2 увеличивается во время ранней споруляции, указывая тем самым на роль в де-конъюгации некоторых субстратов во время мейоза у дрожжей.

Главной мишеною для SUMO в S. cerevisiae является SEPTINS Cdc3, Cdc11 и Sep7, которые образуют 10-nm филаментозное кольцо, окружающее шейку почки. Собственно сборка septin кольца контролируется с помощью неизвестного механизма в morphogenesis checkpoint, который действует на границе G2/M. Sumoylation септинов происходит во время митозов перед анафазой, а модификации исчезают внезапно в цитокинезе. Исчезноение шеечнго кольца нарушено у мутантных дрожжей, у который все SUMO-conjugation сайты септинов заменены аргининовыми остатками. Это уазывает на то. что динамика шеечного кольца нуждается в sumoylation. Однако, арест G2/M у мутантов uba2-ts, ubc9-ts не м.б. объяснен отсутствием sumoylated septins, т.к. септины с отсутствием сайтов конъюгации не дают нарушений роста.

Первый намек важности SUMO's для поддержания геномной интеграции получен на дрожжах. Белок Mif2 является частью центромерного мудьтипротеинового комплекса и необходим собственно для сегрегации хромосом и интеграции митотического веретена. Взаимодействие Ubc9 с белками CENTROMERE S. cerevisiae подтверждает идею, что sumoylation должна регулировать центромерные белки. У S. pombe, делеция гена или для SUMO (pmt3⁺) или Ubc9 (hus5⁺) ведет к аберрантным митоозам, повышению чувствительности к ДНК-повреждающим ангентам и потере с высокой частотой MINICHROMOSOMES , указывающих на то, что Pmt3 также участвует в процессах, таких как сегрегация хромосом и репарация ДНК-повреждений. Это подтверждается и на гомологах человека дрожжевых Rad51 и Rad52, физически взаимодействующих с Ubc9 и SUMO у дрожжей. Ubc9 локализуется вместе с Rad51 в SYNAPTONEMAL COMPLEXES во время мейоза. Путь Rad51/Rad52 участвует в рекомбинации ДНК и репарации двойных разрывов ДНК. Избыточная экспрессия SUMO подавляет гомологичную рекомбинацию после двойных разрывов ДНК и снижает резистентность клеток к ионизирующей радиации. DNA topoisomerase I и II человека sumoylated после повреждений ДНК и продукт гена WERNER SYNDROME ,DNA helicase семействаRecQ. Более того, др. член семейства RecQ helicase, BLOOM SYNDROME protein (BLM ), взаимодействует с Ubc9. Интересно,что белки Rad51 и Rad52, BLM и CENP-C (гомолог Mif2 человека), временно ассоциируют с PML ядддерными тельцами. Однако, неясно участвуют ли PML ядерные тельца в поддержании геномной стабильности и в репарации.

From substrates to function

Итак целый ряд важных клеточных регуляторов и функций контролируется с помощью sumoylation. Очевидно, что обратимая природа этих модификаций является критическим фактором в этих процесах. SUMO участвует или в стабилизации белков и/или их локализации в субклеточных комплексах. Имеющиеся данные указывают на то, что sumoylation способствует специфическим межбелковым взаимодействиям и стабилизирует преформировнные белковые комплексы. Эта регуляция м.б. динамической. Различные аспекты sumoylation выявляются на IκBα и Mdm2, в которых SUMO, по-видимому, противостоит функции убиквитина. Однако не везде SUMO действует подобным образом. Напр.,сайты sumoylation и ubiquitylation в p53 разные. Могут ли обе предполагаемые функции SUMO быть механически связаны (Рис. 5)? Привлекательной является гипотеза, что белки внутри больших ансамблей, которые индуцируются с помощью sumoylation более резистентны к ubiquitin/proteasome-зависимой деградации. Согласуется с этой моедлью наблюдение, что устранение PML sumoylation с помощью Herpes simplex virus ICPO белка не только вызывает разборку PML ядерных телец, но и индуцирует proteasome-зависимую деградацию PML.

(Рис.5.) | Reversible modification of proteins by SUMO и its consequences

SUMO, UBIQUITIN'S MYSTERIOUS COUSIN

Boxes

Links

Pathway of SUMO conjugation

SUMO de-conjugation

Main functions of SUMO

What does genetics tell us?

From substrates to function