Synaptic vesicle Biogenesis
M.J. Hannah, A.F. Schmidt, W.B. Huttner
Ann.Rev. Cell. Dev. Biol. 1999. V.15. Palo Alto (Calif) 733-798
M.J. Hannah, A.F. Schmidt, W.B. Huttner
Ann.Rev. Cell. Dev. Biol. 1999. V.15. Palo Alto (Calif) 733-798
| ACCESSORY FACTORS IN CLATHRIN-DEPENDENT SYNAPTIC VESICLE ENDOCYTOSIS Vladimir I. Slepnev & Pietro De Camilli Nature Reviews Neuroscience 1, 161 -172 (2000) |
Клатрином опосредованный эндоцитоз это специальная форма отпочковывания пузырьков, которая выполняет критическую функцию в рециклинге синаптических пузырьков нервных окончаний. Фундаментальным свойством этого эндоцитоза в нервных окончаняих является сходный клатрин-опосредованный эндоцитоз в др. типах клеток. Но выявляется более быстрая кинетика и сущемствование нескольких нейрон-специфических молекул, участвующих в процессе эндоцитоза.
Основными строительными блоками клатриновых оболочек являются клатрин и адапторный белок AP-2. Сборка оболочки стартует с олигомеризации AP-2 и последующего включения клатрина. По мере увеличения оболочки изгиб мембраны становится более выраженным и продолжается до тех пор, пока не произойдет отделения. Вновь сформированый пузырек быстро теряет свою оболочку.
Имеется много дополнительных факторов, которые обеспечивают образование покрытых клатрином пузырьков. Некоторые из них такие как, AP-180, amphiphysin, Eps15, epsin или dynamin участвуют в сборке оболочкии в регуляции динамики оболочки. Белок AP-180, напр., по-видимому, важен для предопределния размера оболочки. Сходным образом, amphiphysin, по-видимому, функционирует как мультифункциональный адаптор, который вносит вклад в привлечение белков оболочки, а dynamin, по-видимому, является критическим для события отшнуровки.
Lh/ дополнительные факторы координируют рост оболочки с изменениями липидного бислоя и с модификациями актинового цитоскелета. Напр., dynamin и некоторые связывающие его партнеры (напр., amphiphysin и syndapin) по-видимому, взаимодействуют функционально с актином. Сходным образом, endophilin, по-видимому, обладает lysophosphatidic acid acyl transferase активностью, которая м.б. важной для инвагинации мембраны.
Др. факторы , такие как synaptojanin, amphiphysin, intersectin или auxilin, участвуют во взаимодействии между эндоцитотическими механизмами и путями передачи внутриклуточных сигналов. Напр., synaptojanin является phosphoinositide phosphatase, который регулирует пул PtdIns(4,5)P2, важный как для эндоцитоза, так и для передачи сигналов.
Одним из важных аспектов является то, что разные дополнительные факторы, участвуюющие в клатрин-опосредованном эндоцитозе, м. действовать на нескольких стадиях во время процесса эндоцитоза. Это очевидно связано с существованием в каждом факторе связывающих сайтов для многих из молекул, участвующих в эндоцитозе. Необходимо выяснить иерархию, последовательность действия и точное место сборки для всех этих факторов в клатриновой оболочке.
Важна связь clathrin-accessory факторов с актином. Доказательства роли актина в клатрин-обусловленном эндоцитозе строгие в некоторых системах. Его участие пока непонятно, но предполагается, что актин м.б. вовлечен в ступень отшнуровки и последующей транслокации пузырьков прочь от мембраны.
Факт, что клатриновые оболочки формируются в синаптической мембране только после экзоцитоза указывает на то, что регуляция эндоцитоза в нервных окончаниях м.б. связана в процессом экзоцитоза, хотя механизм неизвестен. Кроме того, фосфорилирование белков является др. механизмом, участвующим в регуляции endocytic machinery.
(Рис.1.) | Domain structure of the coat components and accessory factors of clathrin-mediated endocytosis at the synapse.
(Рис.2.) | Documented interactions of the coat components and accessory factors of clathrin-mediated endocytosis.
(Рис.3.) | Sequential stages in clathrin-mediated endocytosis at the presynaptic terminal.
(Рис.4.) | Disruption of synaptojanin function in the giant reticulospinal synapse of the lamprey.
(Рис.5.) | Amphiphysin, dynamin and clathrin-coat components can transform liposomes into structures similar to the tubules and coated pits observed in situ .
(Рис.1.) | Domain structure of the coat components and accessory factors of clathrin-mediated endocytosis at the synapse.
(Рис.2.) | Documented interactions of the coat components and accessory factors of clathrin-mediated endocytosis.
(Рис.3.) | Sequential stages in clathrin-mediated endocytosis at the presynaptic terminal.
(Рис.4.) | Disruption of synaptojanin function in the giant reticulospinal synapse of the lamprey.
(Рис.5.) | Amphiphysin, dynamin and clathrin-coat components can transform liposomes into structures similar to the tubules and coated pits observed in situ .
| ORIGINAL RESEARCH PAPER
Sun, J.-Y. & Wu, L.-G. Fast kinetics of exocytosis revealed by simultaneous measurements of presynaptic capacitance and postsynaptic currents at a central synapse. Neuron 30, 171-182 (2001) | PubMed | FURTHER READING Bollmann, J. H., Sakmann, B. & Borst, J. G. Calcium sensitivity of glutamate release in a calyx-type terminal. Science 289, 953-957 (2000) | Article | PubMed | Schneggenburger, R. & Neher, E. Intracellular calcium dependence of transmitter release rates at a fast central synapse. Nature 406, 889-893 (2000) | Article | PubMed | |
Максимальная скорость свобождения нейротренсмиттера среди прочего зависит от количества сайтов пресинаптического высвобождения и скорости, с которой синаптические пузырьки могут сливаться с клеточной мембраной.
Итак, насколько быстро м. обычные синапсы высвобождать нейротрансмиттер из везикулярных хранилищ? Оказалось около 20 пузырьков в сек. на сайт высвобождения; слишком медленно чтобы соответствовать высоко-частотной передаче возбуждения, наблюдаемой в большинстве синапсов в ЦНС. Возможно виноват метод. При мониторинге постсинаптических реакций как уполномоченных пресинаптического экзоцитоза, ряд факторов м. приводить к занижению скорости высвобождения; напр., насыщение или десенсибилизация постсинаптических рецепторов. Более прямые измерения количества пузырьков, сливающихся с пресинаптической мембраной, м.б. произведено в синапсах, где нервные окончания большие; в этом случае, отдельное событие слияния м.б. обнаружено как увеличение пресинаптической мембраны capacitance.
Sun и Wu изучали высвобождение глютамата в одном из самых больших синапсов в стволе мозга крыс - the calyx of Held. Им удалось измерить пресинаптическое capacitance в результате одновременного мониторинга excitatory postsynaptic currents (EPSCs), возникающего в результате высвобождения глютамата. Sun и Wu нашли, что EPSC амплитуды были насыщены, когда значения capacitance достигали всего 35% от максимума, подтверждая предсказание, что измерение слияния пресинаптических пузырьков на самом деле дает более высокие значения количеств высвобождаемых трансмиттеров - более 300 пузырьков в сек. на активную зону.
Эти данные указывают на то, что конвенциональные центральные синапсы м. высвобождать трансмиттер со значительно большей скоростью, чем это было определено ранее.
Нейроны содержат два первичных класса регулируемых секреторных пузырьков: синаптические пузырьки и секреторные гранулы, которы хранят молекулы переносчики и высвобождают их после стимуляции. Секреторные гранулы (называемые также пузырьки с большое плотной сердцевиной) обеспечивают регулируемую секрецию белков, в частности нейропептидов. Эти молекулы переносчики транслоцируются через мембрану на уровне эндоплазматического ретикулема, проходят через комплекс Гольджи и упаковываются в секреторные гранулы. После секреции содержимого мембраны секреторных гранул подвергаются рециклингу обратно в комплекс Гольджи, если он заполнен нейропептидами. Так как место высвобождения нейропептидов, периферия клетки, удалено на значительное расстояние от комплекса Гольджи, то этот рециклинг имеет определенные ограничения по отношению к скорости, с которой мембраны секреторных гранул м.б. реутилизированы.
Напротив синаптические пузырьки обеспечивают регулируемую секрецию небелковых мессенджер молекул, нейротрансмиттеров, которые транспортируются через мембраны на уровне самих синптических пузырьков. Способность синаптических пузырьков получать нейротрансмиттеры непосредственно из окружающей цитоплазмы делает возможной локаьную реутилизацию мимбран синаптических пузырьков, независимо от эндоплазматического ретикулема и комплекса Гольджи.
Предполагается, что после экзоцитоза секреторных гранул некоторые их мембраны используются для биогенеза синаптических пузырьков скорее, чем для реутилизации в комплексе Гольджи, напр., в катехоламиновых нейронах small dense core vesicle (SDCVs).
Нейроэндокринные клетки содержат мембранные пузырьки, очень сходные с синаптическими пузырьками нейронов synaptic-like microvesicles (СПМВ). Все изученные трансмембранные белки СПМВ синтезируются и вставляются в мембраны в грубом эндоплазматическом ретикулеме, это сопровождается их транспортом в и через аппарат Гольджи. Анализ синаптофизина, основного мембранного белка СПМВ, показал, что вновь синтезированный синаптофизин не обнаруживается в секреторных гранулах, а покидает trans-Goldgi network (TGN) в составе конституитивных секреторных пузырьков и появляется на клеточной поверхности в течение 10-15 мин. После его первого появления на клеточной поверхности, вновь синтезированный синаптофизин подвергается циклам эндоцитоз-экзоцитоз, который первноачально обеспечивается мембранными пузырьками большими и более плоными, чем СПМВ. Постепенно синаптофизин появляется в СПМВ. Остается выяснить имеют ли сходные пути и другие вновь синтезированные мембранные белки СПМВ, такие как SV2, vesicular acetylchline transporter (VAChT), synaptobrevin или synaptotagmin.
Взаимоотношения между synaptic-like microvesicles и синаптическими пузырьками
Нейроэндокринные клетки содержат мембранные пузырьки, очень сходные с синаптическими пузырьками нейронов synaptic-like microvesicles (СПМВ). Все изученные трансмембранные белки СПМВ синтезируются и вставляются в мембраны в грубом эндоплазматическом ретикулеме, это сопровождается их транспортом в и через аппарат Гольджи. Анализ синаптофизина, основного мембранного белка СПМВ, показал, что вновь синтезированный синаптофизин не обнаруживается в секреторных гранулах, а покидает trans-Goldgi network (TGN) в составе конституитивных секреторных пузырьков и появляется на клеточной поверхности в течение 10-15 мин. После его первого появления на клеточной поверхности, вновь синтезированный синаптофизин подвергается циклам эндоцитоз-экзоцитоз, который первноачально обеспечивается мембранными пузырьками большими и более плоными, чем СПМВ. Постепенно синаптофизин появляется в СПМВ. Остается выяснить имеют ли сходные пути и другие вновь синтезированные мембранные белки СПМВ, такие как SV2, vesicular acetylchline transporter (VAChT), synaptobrevin или synaptotagmin.
Полученные на СПМВ данные м.б. экстраполированы на синаптические пузырьки. Во-первых, эти данные не подтверждают концепции, что синаптические пузырьки образуются из мембран секреторных гранул после экзоцитоза последних. Они не подтверждают также возможность, что синаптические пузырьки формируются из мембран, которые сняты со зрелых секреторных гранул и высвобождаются эндосомами. Скорее данные по переносу синаптофизина согласуются с концепцией, что биогенез синаптических пузырьков не зависит от секреторных гранул. Во-вторых, не подтверждается концепция, что синаптические пузырьки возникают из TGN. В-третьих, циклы ендоцитоза-экзоцитоза синаптофизина до появления его в СПМВ указывают на то. что ранние эндосомы, которые давно считают участницами ре-формации синаптических пузырьков путем рециклинга, участвуют и в их формировании de novo.
Синаптофизин появляется в СПМВ после мечения на клеточной поверхности.Это наблюдение вместе с (а) обнаружением синптофизина в плазмалемной - ранней эндосомальной мембранной системе и (б) эндоцитотический-экзоцитотический цикл вновь синтезированного синаптофизина перед его появлением в СПМВ указывают на то, что мембранаой донором СПМВ является плазменная мембрана (оболочка), ранние эндосомы или обеи. Формирование СПМВ проходит ступень нейроэндокринно-специфической сортировки, которая отделяет СПМВ мембранные белки от обычных составляющих плазматической мембраны и рание эндосомы, такие как трансферриновый рецептор и LDL рецептор.
Было предположено, что мембранами-донарами для СПМВ скорее являются ранние эндосомы, чем плазматическая оболочка. Однако нельзя исключить, что ранне эндосомы являются местами хранения СПМВ мембранных белков и что образование СПМВ все же происходит из плазматической оболочки. Обработка клеток дабавленным извне MesNa до изменениятемпературного режима показывает, что правктически весь биотинированный синаптофизин, появляющийся в СПМВ, происходит из плазматических мембран.
Однако имеется специализированный домен плазматических мембран, который дает СПМВ. Это согласуется с присутствием глубоких впячиваний плазматической оболочки в синаптических окончаниях, участвующих в рециклинге синаптических пцзырьков. Предполагается, что доменом, дающим СПМВ, и являются эти впячивания, в основном лишенные трансфериновых рецепторов. очень узкое устье кавеол создает прецендент для инвагинаций плазматических мембран, чье отверстие чрезвычайно избирательно в отношении поступления внеклетовчных молекул. Обнаруживаются повышенные количества синптофизина в плейоморфоной тубуло-цистреновой мембранной системе, непосредственно под плазматической мембраной, обозначаемой как перисома.
Другая возможность, что секвестрированный домен плазматической мембраны, дающий СПМВ, может соответствовать латеральной плазматической мембране или ее инвагинациям.
Имеются некоторые указания на то, что образуются отличающиеся популяции СПМВ из плазматических мембран и эндосом.
БИОГЕНЕЗ СИНАПТИЧЕСКИХ ПУЗЫРЬКОВ - КОМПАРТМЕНТЫ И ПУТИ ПЕРЕМЕЩЕНИЙ
Зрелые нейроны
Транспорт вновь синтезированных мембранных белков для синаптических пузырьков в синапсы Установлено, что мембранные носители представлены в основном сосиско-образными везикотубулярными структурами в 50-80 нм, чем сферами в 50 нм. Следовательно, в зрелых нейронах синаптические пузырьки не образуются в перикарионе и, следовательно, не происходят из TGN. Скорее мембрнные белки для синптических пузырьков транспортируются в аксоны мембранными носителями, предшественниками синаптических пузырьков, которые обеспечивают постоянный транспорт между TGN и плазматическими мембранами по аналогии с переносом вновь синтезированных мембранных белков СПМВ.
Антероградный аксональный транспорт мембранных белков для синаптических пузырьков в мембранных структурах, отлдичных от синаптических пузырьков указывает на то, что последние собираются в пресинаптическом терминале. Установлено, что в мембранных переносчиках, ассоциированных KIF1A, переносятся синаптофизин и синаптотагмин, но не SV2, транспорт которого в аксоны осуществляется, по-видимому, другими переносчиками, хотя позднее все 3 белка оказываются в одних и тех же синаптических пузырьках.
Перед транспортировкой мембранные белки сортируются, часть направляется в аксоны, другая - в дендриты и тело. Мембранные белки для синаптических пузырьков, следовательно, должны содержать домены для сортировки. У синаптобревина такой домен находится в цитоплазматическом участке, он необязателен для включения белка в синаптические пузырьки. У белка амилоидного предшественника (АРР) эот домен скорее находится в трансмембранной области-эктодеомене. Это м. указывать на то, что транспорт пресинаптических плазматических мембранных белков и мембранных белков для синаптических пузырьков обеспечивается разными носителями.
Образование синаптических пузырьков в синапсах
Пути рециклинга и мембрнаы доноры.
Kiss-and-run модель. Согласно этой модели синаптические пузырьки формируют временные поры с пресинаптическими плазматическими мембранами, через которые высвобождается нейрорансмиттер, а рециклинг заключается просто в закрытии поры и отсоединении от плазматической мембраны. Клатрин-опосредованный эндоцитоз. Согласно этой модели синаптический пузырек полностью сливается с пресинаптической мембраной, его последующий рециклинг следует по пути эндоцитоза, обеспечиваемого клатриновой оболочкой, когда мембрана синаптического пузырька высвобождается с помощью покрытых клатрином эндоцитотических пузырьков и помещается в мембрану эндосом, из которыз происходит повторное образование синаптических пузырьков. При этом способе возможна сортировка мембранных белков синаптических пузырьков и липидов из плазматических мембран и/или эндосомных мембран.
Инвагинации эндосомных или плазматических мембран. Предполагается, что покрытые клатрином почки имеются не только на пресинаптических плазматических мембранах, но и в глубоких инвагинациях пресинаптических плазматических мембран и вакуолей. Предполагается, что синаптические пузырьки рециклируют в одиночную покрытую клатрином почку и с помощью динамин-опосредуемого отщепления м. отделяться от пресинаптических плазматических мембран и их инвагинаций (рис3).
Механизм, обеспечивающий отпочковывание синаптического пузырька, например, в клатриновую оболочку, отличается от механизма отщепления синаптического пузырька, например, с помощью динаминового кольца. Сосуществавание этих двух механизмов или путей рециклинга синаптических пузырьков показывает: (а) один механизм в активной зоне следует концепции kiss-and-run и проявляется в основном только в отщеплении от мембраны пузырька с помощью динаминового кольца; (б) другой в неактивной зоне опрерирует преимуществено клатрин + динамин, почкование + отщепление мембран синаптических пузырьков, которые вставлены и вообще смешаны с плазматическими мембранами.
Два пула синаптических пузырьков, непосредственно реализуемый пул и резервный пул. Высвобождение нейротрансмиттера синапсами в ответ на относительно слабую стимуляцию затрагивает только непосредственно реализуемый пул, тогда как ответ на сильную продолжительную стимуляцию вовлекает и резервный пул. Предполагается, что путь активной зоны kiss-and-run рециклига синаптических пузырьков пополняет непосредственно реализуемый пул, а клатрин-опосредованный путь отпочковывания и отщепления неактивной зоны - пополняет резервный пул.
Незрелые нейроны
Экспрессия мРНК белков синаптических пузырьков обнаруживается в молодых постмитотических нерйонах до бразования нейритов и синапсов. Показано наличие конституитивного и регулируемоно экзо-эндоцитоза посредством мелких пузырьков до синаптогенеза и после формирования синапсов.
СОРТИРОВКА И СБОРКА КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАН СИНАПТИЧЕСКИХ ПУЗЫРЬКОВ
Значение белкового состава синаптических пузырьков для биогенеза
Во многих случаях различные популяции нейронов экспрессируют различные изоформы белков синаптических пузырьков, но каждый синаптический пузырек из определенного нейрона имеет один и тот же состав.
Униформность состава. Малые размеры пузырьков говорят о том. что они содержат относительно небольшое количество копий каждого белка, некоторые м.б. представлены 1-2 копиями. Постоянство состава м. обеспечиваться тем, что каждый белок синаптического пузырька должен индивидуально сортироваться и собираться с помощью собственного адпторного комплекса. Комбинация адапторных комплексов для всех белков синаптичесого пузырька будет давать матрицу для мембраны синаптического пузырька. Однако для плазмалеммной и эндосомальной донорских мемран описано только по одному адапторному комплексу (АР2 или АР3), следовательно, матрицы не существует. Очевидо всеми белками используется один адапторный комплекс.
Изменчивость состава. При некоторых условиях в синаптических пузырьках можно изменить количество некоторых составляющих, например, транспортера ацетилхолина (VAchT) или моноамина (VMAT2). Известно также существование синаптических пузырьков, сливающихся с мембранами, но не содержащие нейрорансмиттеров.
Межбелковые взаимодействия
Межбелковые взаимодействия, играющие роль в биогенезе синаптических пузырьков должны оперировать на двух уровнях: во время сегрегации мембранных белков для синаптических пузырьков от несинаптических белков, и во время сборки компоненитов в функциональную органеллу.
Гомо-олигомерные комплексы. Большинство белков крупных синаптических пузырьков образует гомо-олигомеры, включая синаптофизин, синаптобревин и синаптотагмин. Гомо-олигомеризация синаптофизина в РС12 клетках происходит на уровне TGN и сопровождается образованием конституитивных секреторных пузырьков, в которых белок транспортируется в плазматическую мембрану.
Гетро-олигомерные комплексы. Синаптические пцзырьки крыс состоят из SV2, синаптотагмина, синаптофизина, синаптобревина и субъедины в 39 кДа везикулярного протонового насоса (примерно 3 копии на пузырек). Однако этот коплекс не является ответственным за композицию всей мембраны синаптического пузырька. Выявлено межбелковое взаимодействие внутри мембраны синаптического пузырька между синаптобресином и синаптофизином, которое зависит от неидентифицированной посттрансляционной модификации, специфичной для зрелых нейронов.
Синаптобревин-синаптофизин-протоновый насос. Синаптофизин с помощью поперечных связей можетсоединяться в синаптических пузырьках с синаптобревином. Показано, что взаимодействие синаптобревина с синтаксином I является жизненноважным для события экзоцитотического слияния и, следовательно, взаимодействие синаптобревина с синаптофизином м. указывать на возможную регуляторную роль в экзоцитозе и возможно в формировании пузырька. Комплекс синаптобревина с синаптофизином содержит также и субъединицу везикулярного протонового насоса. Предполагается прямое взаимодействие синаптофизина с 39-кДа субъединицей протоногоо насоса (physophilin). Предполагается, что этот тройной комплекс обеспечивает накачку протонами синаптического пузырька.
Роль липидов синаптического пузырька для биогенеза
Хотя липидный состав пресинаптических мембран и мембран синаптических пузырьков в головном мозге крыс очень сходен, ганглиозиды, которые присутствуют на довольно высоком уровне ( примерно 13% от веса липидов) в синаптосомных плазматических мембранах, практически полностью отсутствуют в синаптических пузырьках. Пропорция фосфолипидов в двух мембрнанах относитеьно постоянна, около 75% от общего веса липидов. Отсутствие ганглиозидов восполняется в пузырьках увеличением доли холестерола. Имеются доказательства, что активная зона богата гликоконъюгаатами. Предполагается, что холестерол в мембранах взаимодействует со сфинголипидами (sphingomyelin и glycosphingolipids) посредством водородных мостиков sphingosine основания с холестеролом. Однако сфинголипидов в пузырьках мало, следовательно, должны быть другие компоененты, позволющие удерживать холестерол. Холестерол стремится взаимодействовать с полиненасыщенными жирными кислотами. Возможно, что удержание холестерола обеспечивается высокой кривизной стеноа пузырьков.
Протеин-белковые взаимодействия
Другим объяснением повышеннго количества холестерола м.б. то, что один из белковых компонентов синаптических пузырьков связывает холестерол. Возможно, что эту роль выполняет синаптофизин, отбирая холестерол в пузырьки или даже индуцируя или стабилизируя белково-липидный ансамбль, в котром участвуют и др. белки. Белками, замещющими функцию синаптофизина м. выступать synaptogyrin, SCAMP, synaptoporin.
Sorting Signals
Об отделении аксонаьных от соматодендритных белков на уровне TGN уже говорилось выше.
Сигналы для эндоцитоза. Белки синаптических пузырьков извлекаются с помощью эндоцитоза. Это установлено для синаптофизина и транспортеров нейротрансмиттеров VMAT2 и VAChT. Синаптофизин и SV2 обнаруживаются в разных эндосомах, это обусловлено или сортировкой в общем эндоцитотическом компартменте или разными путями интернализации. Рециклинг синаптотагмина, непосредственно взаимодействующего с инструментами эндоцитоза плазматичеких мембран АР2 и клатрином, в отличие от других белков, которые обязательно подвергаются эндоцитозу, м. регулироваться. Синаптобревин, связывающийся с другим адапторным комплексом (АР3), участвует в формировании пузырьков из эндосом.
Установлено, что длинный цитоплазматический С-терминальный хвост синаптофизина необходим для эндоцитоза и что он существенен для восстановления интернализации бехвостых мутантных низкой плотности рецепторов липопротеина.
Показано, что di-leucine эндоцитозный мотив ответственнен за эндоцитоз транспортеров VAChT и VMAT, но нет доказательств его участия в эндоцитозе других белков синаптических пузырьков.
Мутации в цитоплазматическом домене синаптобревина нарушают скорость его эндоцтоза.
Synaptic Vesicle Targeting Signals versus Synaptic Vesicle Exclusion Signals
Synaptic Vesicle Targeting Signals (SVTS) - это любые последовательности, которые увеличивают Synaptic Vesicle Targeting Index (увеличение пропорции белка в пузырьках по сравнению с его уровнем в гомогенате)...