В нейромышечных синапсах высвобождение ацетилхолина (ACh) происходит в дискретных специализированных областях пресинаптических плазменных мембран, активных зонах, где собираются синаптические пузырьки, органеллы, хранящие нейротрансмиттеры. Пресинаптические,открываемые напряжением, кальциевые канальцы концентрируются в активной зоне мембраны,обращенной лицевой поверхностью к специализациям постсинаптической мембраны, где плотно упакованы никотиновые ACh рецепторы. После поступления потенциала действия, триггеры деполяризации синхронизируют открытие этих кальциевых канальцев и происходит массивный приток кальция в нервные окончания. Временно кальций достигает субмиллимолярных концентраций в цитоплазматических µдоменах, контактирующих с активными зонами. В течение 200 µсекунд это повышение внутриклеточного кальция индуцирует высвобождение нейротрансмиттера. В нейромышечных соединениях индуцированное высвобождение ACh происходит в результате синхронизированного освобождения нескольких десятков квантов ACh, каждый из которых соответствует пакету примерно в 10000 молекул ACh. Такие пакеты могут высвобождаться и спонтанно, вызывая небольшую деполяризацию постсинаптических мембран. Эти кванты состоят из интегрального количестваь субквантов.
zone in sinaptic transmission
ACh синтезируется цитоплазмой нервных окончаний, где локализована холин ацетилтрансфераза (Morel, Israel, 2000). Затем он накапливается и хранится в синаптических пузырьках. Транспортером везикулярного ACh является специфически ингибируемый везиколом ACh-протон antiporter, который обменивает цитоплазматический ACh на внутривезикулярные протоны. Синаптические пузырьки сначала energetized с помощью вакуолярного типа протон АТФазы (v-H+ATPase), а рН градиент, кислый вне синаптических пузырьков используется для накопления нейротрансмиттера.
Высвобождение ACh из протеолипосом артропод очень напоминает высвобождение ACh синаптосомами. Высвобождение строго зависит от притока кальция.
В условиях покоя 40% ACh находится в цитоплазматическом пуле и 60% в синаптических пузырьках. Вновь синтезируемый меченный трасмиттер в основном обнаруживается в цитоплазматическом компартменте. ACh высвобождается из цитоплазматического метаболически активного компартмента, а не из везикулярного резервного пула в ответ на ганглиолярные стимулы. Цитоплазматический ACh или прямо высвобождается через пресинаптические мембраны с помощью белков этих мембран, например, медиатофора. Альтернативно он может высвобождаться из небольшой популяции активных пузырьков, быстро восполняемых из цитоплазматического пула, как только они высвободят свое ACh содержимое. Обе возможности не исключают друг друга и могут сосуществовать. Эксперименты с меченным ACh указывают на то, что вторая возможность наиболее вероятна.
Медиатофор транслоцирует ацетилхолин в ответ на действие кальция после реконституции в искусственных мембранах. После экспрессии в трансфицированных клетках, не содержащих транспортера везикулярного ACh, он наделяет эти клетки механизмом кальций-зависимого высвобождения с четкими количественными свойствами. Предполагается, молекулы медатофора могут высвобождать субкванты, состоящие из 1000 молекул ACh . Временное открытие молекул медиатофор высвобождает малые пакеты ACh . В этой модели
(Рис.1(1)) синхронизированное высвобождение может быть результатом одновременной активации ряда медиатофор, покрытых кальциевыми µдоменами. Так как синаптические пузырьки способны принимать и секвестрировать кальций, то существенной их ролью пузырьков, расположенных в активной зоне, является контроль за расположением кальциевого µдомена.
(Рис.1(1)) синхронизированное высвобождение может быть результатом одновременной активации ряда медиатофор, покрытых кальциевыми µдоменами. Так как синаптические пузырьки способны принимать и секвестрировать кальций, то существенной их ролью пузырьков, расположенных в активной зоне, является контроль за расположением кальциевого µдомена.
Альтернативно можно представить, что медиатофор создает поры для слияния, которые образуются когда синаптические пузырьки взаимодействуют с пресинаптичесими плазменными мембранами. Ряд белков, включая SNAREs, является компонентом пор слияния. Однако медиатофор обладает рядом свойств, делающих его хорошим кандидатом на эту роль. Он транслоцирует ACh кальций-зависимым способом. Медиатофоровая субъединица присутствует как в пресинаптичской плазменной мембране, так и в синаптической везикулярной мембране, часть его является составляющей v-H+ATPase. Гипотеза (Pис.1(2)) "kiss and run" постулирует временное открытие пор слияния и высвобождение трансмиттера без полного слияния.
Альтернативно поры слияния могут расширяться и приводить к коллапсу везикулярных мембран (Pис.1(3)). В модели "kiss ana run" после закрытия поры слияния синаптический пузырек быстро восполняет свое содержимое за счет вновь синтезированных нейротрансмиттеров из цитоплазматического компартмента. После полного слияния замещение синаптического пузырька нуждается в сортировке белков и липидов, эндоцитозе и сложном переносе мембран серез эндосомные компартменты. Показано, что последний способ экзоцитотического высвобождения действует только вне активных зон в местах спонтанного высвобождения ACh. В активной же зоне действует механизм "kiss and run".
Кластрирование ацетилхолинэстеразы в нейромышечных соединениях
Ацетилхолинэстераза (AChE) также концентрируется в нейромышечных соединениях в тесной ассоциации с синаптическими базальными ламинами, где она отвечает за окончание нейротрансмиссии. Это накопление AChE является маркером для специализированного соединительного внеклеточного матрикса (ВКМ), в котором накапливаются также AChE рецепторы (AChR) и формируется синапс. Как интегральный мембранный белок AChRподвергается латеральным мембранным перемещениям в плоскости клеточной мембраны и кластрируется в местах нейромышечных соединений в результате ассоциации с постсинаптическим цитосклетом? Синаптическая AChE является ВКМ-связанным белком и не может ассоциировать с постсинаптическим цитоскелеом для своего кластрирования. Преобладающей формой AChE в нейромышечных соединениях является асимметричная или А12 форма, состоящая из из трех тетрамеров каталитической субъединицы, ковалентно связанной с коллаген-подобным хвостом. Эта форма крепко прикреплена к синаптической базальной ламине посредством своего коллаген-подобного хвоста и не может быть удалена chaotropic агентами такими как 8 М мочевина или 4 М гуанидин HCl. Только протеолиз может эффективно высвобождать AChEиз синаптической базальной ламины.
Пре-мечение AChE на поверхности мышечных клеток Xenopus показывает, что предсуществующие молекулы AChE используются для образования кластеров, которые ко-локализуются с ацетилхолиновыми рецепторами в местах нейромышечных контактов. Очищенная птичья AChE с коллаген-подобным хвостом, трансплантированная в мышечные клетки Xenopus до присоединения к ним нервов, также накапливается в местах нейромышечных контактов. Было показано, что эта форма AChE связывается с гепаран-сульфат протеогликаном перлеканом, который в свою очередь связан с дистрогликановым комплексом посредством альфа-дистрогликана. Следовательно, этот комплекс является акцептором AChE и обеспечивает ее кластрирование в синапсах в результате латеральной миграции в плоскости мембран.
В коллаген-подобном хвосте AChE выявлен гапарин-связывающий мотив. Взаимодействие этого мотива с гепаран-сульфатной стороной цепи перлекановой молекулы, по-видимому, обусловливает локализацию этого энзима на клеточной поверхности. Мышечный агрин, который также концентрируется в местах синаптической дифференцировки, также может быть акцептором А12 AChE. Показано, что агрин может со-существовать с перлеканом в одних и тех же локусах на клеточной мембране, хотя и в низких концентрациях. альфа-дистрогликан может взаимодействовать с молекулами, связанными с ВКМ, которые имеют G-доменовый мотив, такими как ламинин, агрин и перлекан. С другой стороны бета-дистрогликан, трансмембранный компонент дистрогликанового комплекса способен обеспечивать трансмембранное сцепление между ВКМ компонентами и цитоскелетом. (Рис) Трансмембранная природа дистрогликановго комплекса позволяет ему подвергаться латеральным перемещениям в плоскости мембран и тащить за собой HSPG-AChEкомплекс так как это происходит с AChR.
Механизм кластрирования комплекса в местах синапсов неизвестен, однако он может осуществляться процессами, происходящими в цитоскелете. Цитоскелетные специализации, расположенные под постсинаптическими мембранами, содержат F-актин, уротропин/дистрофин и трансмембранный саркогликановый комплекс, которые могут участвовать в кластрировании и/или стабилизации DG-HSPG-AChE комплекса (рис В). Сведение в кастер AChRи AChEуказывает, что их кластрирование может обеспечиваться общими детерминантами. Показано также, что что кластеры дистрогликана и HB-GAM, который связывает HSPG также более многочислены в областях иных, чем AChRкластеры, насмотря на их колакализацию.