Открытие LOW-DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR (LDLR) позволило охарактеризовать hypercholesterolaemia и транспорт липидов. Внутриклеточный транспорт липидов - от места их абсорбции в ЖКТ до их процессинга и упаковки с помощью печени и распределения по периферическим тканям с помощью различных LIPOPROTEIN PARTICLES (Рис. 1) - хорошо известен. Однако, о внутриклеточной судьбе этих молекул известно меньше.

(Рис.1.) | The structure of low- и high-density lipoprotein particles.

Гомеостаз клеточного холестерола поддерживается посредством сочетанного действия биосинтезирующих и деградирующих энзимов, рецепторов, регуляторов транскрипуии и субклеточного транспорта белков. Имеется два пути, с помощью которыx клетки получают холестерол: или синтез de novo с использованием acetyl-CoA пути; или спасение (salvage) посредством LDLR пути.

Чтобы поддержать баланс между этими двумя источниками холестерола клетки млекопитающих транскрипционно регулируют специфические точки на каждом из путей. Некоторые наблюдения указывают на возможное существование специфического транспорта стерола и на пути сортировки. Во-первых. холестерол неслучайно распределяется среди различных субклеточных пулов; во-вторых, транспорт эндогенно синтезированного холестерола из endoplasmic reticulum (ER) в плазматическую мембрану, по-видимому, отличен от перемещения LDL-derived холестерола в плазматическую мембрану; и в третьих, одиночные генетичесские дефекты м. разрушать нормальный субклеточный транспорт.

Установлено, что multidrug-resistance (MDR) белки регулируют клеточный гомеостаз холестерола и липидов. Однако, не все пермеазы, которые здесь рассматриваются, являются MDR белками. Сверхсемейство ATP-binding cassette (ABC) пермеаз, напр., содержит как MDR, так и не-MDR транспортеры.

Cholesterol biosynthesis и salvage

Biosynthesis. Баланс между de novo биосинтезом холестерола и его salvaging с помощью LDLR пути поддерживается с помощью регуляции транскрипции ключевых точке каждого пути. Путь de novo регулируется с помощью тонко контролирующего энзима, который катализирует первую ступень биосинтеза холестерола, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR). Эта предетерминированная ступень в биосинтезе холестерола вызывает восстановление (reduction) HMGC до mevalonate. Энзим HMGCR содержит 8 трансмембранных доменов, которые запирают энзим в мембране ER, кроме того каталитический домен, который располагается в цитоплазме. Установлено, что мембранные домены ответственны за стерол-регулируемую деградацию энзима; однако, механизмы, с помощью которых этот стерол-сувствительный домен определяет уровень внуриклеточного холестерола остается неясным.

Salvage. Спасение (Salvaging) внеклеточного холестерола связано с рецепторами-опосредованным эндоцитозом LDL частиц, богатых холестеролом, посредством рецепторов LDLRs, семейством генов, которое включает и LDLR-related protein 1 (LRP1), который отвечает за связывание и интернализацию липопротеиновых частиц, богатых apolipoprotein E (APOE). Связав LDL частицы, рецептор интернализуется и затем высвобождает свой груз в эндосомы и лизосомы. После того, как он покидает лизосомы, холестерол транспортируется в ER и плазматическую мембрану с помощью промежуточной ступени, через аппарат Гольджи. Избыток свободного холестерола esterified с помощью acyl-coenzyme A:cholesterol acyltransferase (ACAT), энзима, который локализован в ER, и хранится в виде цитозольных капелек холестероловых esters.

Липопротеиновый транспорт липидов, таких как жирные кислоты, стеролы и glycosphingolipids в клетки, где их груз высвобождается в эндосомно-лизосомную систему , которая в конечном счете демонтирует частицы и спасает их стержневые компоненты. Хорошо известны события, которые происходят во время образования липопротеиновых частиц и маршруты достижения ими плазматических мембран (оболочек) клеток.

LDLR распознают белок, покрывающий LDL частицу, оболочка состоит преимущественно из APOB-100. Частицы содержаи преимущественно cholesterol esters и фосфолипиды (~42% и ~22% от сухой массы частицы, соответственно), кроме того apolipoprotein coat (~22%), и небольшие количества триглицеридов и свободного холестерола (~6% и ~8%, соответственно) (Рис. 1). Помимо этого, LDL частичы сождержат также glycosphingolipids. После связывания LDL частицы с ее рецептором, комплекс подвергается эндоцитозу с помощью CLATHRIN-COATED VESICLES . LDLRs и их лиганды затем транспортируются в ранние эндосомы, где LDL отделяется от своего рецептора и отсортировывается в поздние эндосомы и, наконец, в лизосомы. LDL частицы демонтируются в лизосомах (Рис. 2), и мало известно о событиях, которые управляют восстановлением демонтированных компонентов и, в частности, липидных компонентов частиц. LDLR возващаются в плазматическую мембрану из ранних эндосом, чтобы начать новый цикл эндоцитоза.

(Рис.2.) | Main routes of intracellular cholesterol movement.

Cholesterol transport

Свободный клеточный холестрол обнаруживается преимущественной в плазматической мембране, откуда он м. поступаль в др. клеточные органеллы для esterification, синтеза желчных кислот или продукции стероидных гормонов (Рис. 3). Механизмы, которые контролируют сортинг и перемещения холестерола, который или спасен или синтезирован, остаются невыясненными. Хотя большинство перемещений холестерола в клетке осуществляется с помощью везикулятрного транспорта, он, по-видимому, способен также перемещаться через цитозоль - напр., чтобы достигнуть митохондрий и пероксисом - очевидно путем соединения с акцепторами цитозольного стерола, такими как белки, переносящие стерол. Хотя холестерол перемещается быстро среди различных клеточных пулов (Рис. 2), его асимметричное распределение (высокая конценрация в плазматической мембране, низкая конц. в ER) остается постоянным.

(Рис.3.) | Cholesterol products.

Имеются доказательства существования отдельных путей для внутриклеточного транспорта эндогенно синтезировнного и экзогенно поставляемого холестерола; однако, неясно конвергируют ли они или остаются отдельными во время мобилизации холестерола. Схема, представляющая различные маршруты холестерола внутри клетки показана на (Рис. 2).

Эндогенно синтезированный холестерол, по-видимому, переносится от ER в плазматическую оболочку с помощью быстрого энерго-затратного процесса, который обходит Golgi. Этот механизм транспорта остается функциональным в присутствии хим. в-в. которые ингибируют транспорт микротрубочек, лизосомную функцию и синтез белка. Лизосомный LDL-derived холестерол быстро обнаруживается в плазматической мембране и есть указания на то, что этот процесс идет через Golgi en route. Более того, возможно также, что он используется и для esterification с помощью ACAT в ER, без осуществления цикла через плазматическую мембрану.

Показано, что быстры транспорт LDL-derived холестерола в плазматическую мембрану м.. независим от NPC1 белка, который участвует в облегчении выхода холестерола из эндосомно-лизосомной системы. Интернализация холестерола плазматической мембраны, однако, и его распределние в различныех клеточных компартментах зависит от функции NPC1. Предполагается, что избыток холестерола лучше всего хранится в плазматической мембране скорее, чем в эндосомно-лизосомной системе, где он м. случайно вызывать нарушения функции этих органелл, на что указывает фенотип NPC-болезни.

Транспорт LDL-derived холестерола является защищенным от энергии ядов (energy poisons), по-видимому, имеются разные пути для переноса из двух источников клеточного холестерола. Анализ NPC болезни позволил вявить транспорт холестерола из лизосом в плезматическую мембрану, который м.б. нарушен при болезни, хотя транспорт холестерола из ER tв плазматическую мембрану остается функциональным.

Caveolins и transport. Установлено, что caveolins участвуют во внутриклеточном транспорте холестерола. Caveolin 1 (CAV1) и CAV2 обнаруживаются в большинстве клеток, тогда как CAV3 специфичен для мышечных клеток. Кавеолины являются мебрнными белками, которые обнаруживаются в перую очередь в внвагинациях плзматической оболочкиi , а также в trans-Golgi network (TGN) и экзоцитотических пузырьках. Кавеолы, которые очень богаты кавеолином, вовлекаются в эндоцитоз, пиноцитоз, трансцитоз и сигнальную трнасдукцию. Кавеолин специфически связывается с холестеролом мембраны и облегчает перемещение вновь синтезированного холестерола из ER в плазматическую мембрану. Более того, концентрация холестерола плазматических мембран, по-видимому, является критической для функции кавеол, т.к. снижение холестерола в плазматической мембране ингибирует пиноцитоз и вызывает дисперсию GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL (GPI)-ANCHORED PROTEINS, что ведет к несоответствующей активации ниже стоящих сигнальных каскадов.

Анализ промоторной области гена CAV1 выявил две STEROL REGULATORY ELEMENT (SRE)-подобные последовательности и было показано, что транскрипция CAV1 активируется в ответ на свободный холестерол. Было установлено, что экспрессия кавеолина усиливается в несколько раз у Npc1^+/- гетерозигот и Npc1-дефицитных мышей, указывая тем самым на возможную роль кавеолина в транспорте лизосомного холестерола. Показано. что экспрессия доминант-негативной мутации кавеолина вызывает накопление внутри клетки свободного холестерола в поздних эндосомах и уменьшение холестерола на поверхности с соответствующим снижением оттока и синтеза холестерола. Все это указывает на то, что кавеолины м. осеспечиватьвнутриклеточный гомеостаз липидов и холестерола.

Холестерол и др. липиды ассиметрично распределены внутри микродоменов, богатых сфинголипидами, как в экзоплазматическом, так и цитоплазматическом листке плазматической мембраны. Предложена гипотеза платформ-плотиков ( 'raft hypothesis' ) , согласно которой сфинголипиды и холестерол собираются внутри мембран для образования платформ или плотиков, которые привлекают к себе некоторые белки и исключают другие. Кавеолины могут функционировать как стабилизаторы доменов платформ в разных мембранах, включая мембраны гольджи и плазматические мембрны (оболочки). В дополнение, возможны также два маршрута для мембранного транспорта между Golgi и плазматической мембраной: простой bulk-flow маршрут для белков без сортинг сигналов и маршрут для белков, предназначенных для платформ.

High-density lipoproteins. Отток холестерола м. происходить через плазматическую мембрану с помощью HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN PARTICLES (HDLs) (Рис.1.), процесса давно известного для обеспечения обратного транспорта холестерола из периферических тканей в печень. В дополнение, члены семейства scavenger рецепторов, SR-B1, отвечают за селективное поступление cholesterol esters из HDL частиц в клетки. При установлении молекулярных дефектов при Tangier disease было выявлено отсутствие связи в этом пути - транспортер, ответственный за перенос plasma-membrane фосфолипидов и холестерола в соответствующие акцепторы.

Multidrug-resistance proteins

Установлено, что multidrug транспортеры - в частности ABC TYPE - эффективно участвуют в липидном транспорте. Идентифицирован 51 белок (inventory of human ABC proteins), относящиеся к разным подсемействам. Эти белки выявлены по наличию ABC единицы (~200-250 аминокислот), которая содержит WALKER A И WALKER B MOTIFS .

На базе их топологии и и количества у них трансмембранных доменов предложена схема, которая размещает ABC белки по 7 подсемействам: ATФ-binding cassette 1 (ABC1); multidrug-resistance/transporter associated with antigen processing (MDR/TAP); multidrug resistance-associated protein/cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (MRP/CFTR); adrenoleukodystrophy (ALD); RNase L inhibitor (OABP); GCN20 (у дрожжей Saccharomyces cerevisiae); и White (white ген у Drosophila melanogaster). Семейство ABC обнаруживается также и у не-млекопитающих. Напр., характеристика открытой рамки считывания у S. cerevisiae выявила ~186 потенциальныx PERMEASES с несколькими трансмембранными доменами, 28-32 из которых приндлежат multidrug-resistance семейству. Повсеместное присутствие multidrug транспортеров подтверждается тем фактом, что у Escherichia coli, имеется 29 предполагаемых multidrug транспортреов, по крайней мере два из которых являются ABC типа.

ABC транспортеры характеризуются ABC cassette, которая позволяет блеку функционировать с использованием АТФ в качестве источника энергии. Второе семейство multidrug транспортеров, состоит из ANTIPORTS, SYMPORTS И UNIPORTS, было подразделено на пять сверхсемейств, включая resistance-nodulation-division семейство пермеаз. В отличие от ABC транспортеров, эти пермеазы не м. использовать АТФ и вместо него используют PROTON-MOTIVE FORCE (PMF) для получения энергии для транспорта. Хотя этот тип транспортеров общераспротсранен у прокариот, но известно несколько примеров и у эукариот - мышиный multidrug endosomal transporter (MTP), напр., и monoamine транспортеры VMAT1 и VMAT2, у крыс и телят, соотв. В соотвествии с их потребностью в PMF, который обычно поставляется с помощью кислого pH эндосомно-лизосомной системы, функция этих транспортеров подавляется веществами, которые разрушают PMF градиенты.

Идентификация sterol-regulated ABC белка (ABCA7) и выявление молекулярного дефекта при болезни Tangier возродился интерес к этому типу транспортных белков. Как показано в Табл. 1, ABC транспортеры являются важными вкладчиками в транспорт клеточных липидов. более того, члены PMF-зависимого семейства, такж, по-вивдимому, вовлечены в липидный гомеостаз, особенно в субклеточных компартментах, которые м. поддерживать PMF градиенты. Итак multidrug-resistance белки из разных подсемейств, по-видимому, являются привратниками, регулирующими гомеостаз внутриклеточного стерола и липидов.

(Табл.1) | Multidrug resistance proteins и associated diseases

Tangier disease

Изучение редкого аутосомно-рецессивного заболевания, Tangier disease, пивело к выводу о важности липидного транспорта. Tangier disease и familial HDL deficiency (FHD) характеризуются накоплением отложений стерола в ткани макрофагов и тяжелой нехватке HDL. Пациенты не имеют APOLIPOPROTEIN A-1 (APOA1) и накапливают cholesterol esters в ретикуло=-эндотелиальных клетоках различных тканей, включая печень, селезенку, костный мозг, миндалины, тимус и лимфатические узлы.

Как Tangier disease, так и FHD вызываются дефектами ABC-type плазматической мембрны транспортера, ABCA1. Более того, мутации в гене ABCA1 идентифицированы у пациентов с FHD, указывая тем самым, что FHD является гетерозиготной формой болезни Tangier. Экспрессия ABCA1 м.б. индуцирована в культивируемых клетках добавлением 22(R)-hydroxycholesterol и 9-cis-ретиноевой кислоты, Это указывает на возможное вовлечение семейств ядерных рецепторов печени liver X receptor (LXR) и retinoid X receptor (RXR). Стерол-зависимая трансактивация ABCA1 осуществляется его промоторной областью в 25-п.н. Это усиление ABCA1 с помощью стеролов (более, чем 7-кратная индукция) подтвердило в дальнейшем идею, что этот транспортер отвечает за транспорт стерола поперек плазматической мембраны.

Выявлены два новых члена ABC сверхсемейства, ABCG5 и ABCG8, которые мутантны у пациентов с sitosterolaemia, с актосомно-рецессивным нарушением, которое характеризуется повышенной абсорбцией и пониженной экскрецией с желчью пищевых стеролов, включая растительный стерол, sitosterol. Итак, эти транспортеры являются членами стероловых и липидных транспортеров (Табл. 1).

The ABCA1 protein. ABCA1 является типичным ABC транспортером, с 6 трансмембранными доменами и нуклеотид-связывающим доменом, повторенным дважды (Рис. 4). Нуклеотидные домены состоят из двух Walker A и Walker B мотивов, и члены подсемейства ABCA (Табл.1) содержат также гидрофобный домен, который разделяет две повторяющиеся единицы из 6 трансмембранных спиралей. Из-за свой гидрофобности этот домен м. взаимодействовать с мембраной и облегчать транспорт субстрата.

(Рис.4.) | Topology of ABCA и RND-type permeases.

Тяжелые нарушения обратного транспорта холестерола при б-ни Tangier привели к гипотеза, что причиной нарушения является белок, вовлекаемый в этот процесс. Установлено, что ABCA1 переносит липиды на APOA1 скорее, чем на HDL благодая их прямому соединению APOA1 с ABCA1 на плазматической мембране. Этот перенос затрагивает одновременно движение фосфолипидов и холестерола из наружного листка мембраны на APOA1. Несмотря на высокую концентрацию холестерола в доменах липидных платформ они не участвуют в ABCA1-опосредованном пути оттока липидов. Показано, что холестерол не связывается непосредственно с ABCA1 и, кроме того, что отток фосфолипидов с помощью ABCA1 не нуждается в холестероле и м. протекать нормально и в его отсутствие. Предполагается, что связывание APOA1 с ABCA1 ведет к образованию apolipoprotein-phospholipid комплексов, которые в свою очередь обеспечивают движение холестерола.

Niemann-Pick C disease

NPC блезнь - это редкий аутосомно-рецессивный LIPIDOSIS , характеризующийся накоплением unesterified холестерола в лизосомах. Пациенты обнаруживают прогрессивную нейродегенерацию и HEPATOSPLENOMEGALY , которые ведут к смерти в раннем детстве. Наиболее заметным биохимическим проявлением является накопление LDL-derived unesterified холестерола в эндосомно-лизосомной системе. Кроме того, холестерол накапливается в TGN, а его перемещение в и из плзматической мембрны задержано. В фибробластах нарушения выхода холестерола из лизосом сопровождаются ослаблением подавления двух ключевых компонентов гомеостаза холестерола - HMGCR и LDLR.

The NPC1 gene. Мутантный у большинства NPC пациентов ген NPC1 картируется в хромосоме 18q11-12 и кодирует мРНК ~4.9 kb, котрая продуцирует белок, состоящий из 1,278 аминокислот. Ген NPC1 имеет длину ~ 47 kb и состоит из 25 экзонов (размеры котрых колеблются от 74 до 788 нуклеотидов) и интронов (размером от 0.097 до 7 т.п.н.). Более 80 мутаций описано у пациентов с отсутствием NPC1, включая нонсенс и миссенс мутации, делеции и дупликации. Эти мутации распределялись по всему NPC1 гену и не выявляли функционально критических доменов; однако, имелся небольшой кластер мутаций в С-терминальной трети белка, в области, содержащей цистеиновые остатки, которые законсервированы у разных NPC1 ортологов.

Эффекты снижения или отсутствия NPC1 как у людей, так и у животных моделей, показывают. что этот белок являюеся существенным компонентом внутриклеточного транспорта холестерола. Кроме того, некоторые мутантные линии Chinese hamster ovary cell (CHO) с NPC1-disease фенотипом были охарактеризованы и было установлено, что они содержат дефектный ген NPC1. Функция белка NPC1 все еще неизвестна, хотя получены указания, что это липидная пермеаза.

The NPC1 protein. Анализ последовательностей NPC1 не выявил какой-либо существенной гомологии с др. белками. Однако, 3-7 трансмембранных домена (Рис. 4) обнаруживают гомологию с белком Patched (PTC). PTC является связанным с мембраной рецептором для Sonic Hedgehog (SHH), сигнальной молекулы, которая содержит ковалентно соединенную холестероловую половинку. Это сходство последовательностей распространяется и на чувствительные к стеролу домены HMGCR и sterol-regulated-element cleavage-activating protein (SCAP). У HMGCR, чувствительный к стеролу домен участвует в деградации энзима, когда клетка 'чувствует' адекватный уровень холестерола, тогда как SCAP м функционировать во время активации sterol-regulatory-element-binding proteins (SREBPs), из семейства транскрипционных факторов, которые регулируют некоторые ключевые энзимы на пути salvage и de novo синтеза холестерола (Рис. 5). В дополнение, у человека ген сходный с NPC1, Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), также содержит sterol-sensing домен.

(Рис.5.) | Sterol-regulatory-element-binding proteins.

NPC1 является мембранным гликопротеином. который локализуется на LAMP-POSITIVE ORGANELLES , преимущественно эндосомах и лизосомах. Он располагается преимущественно в RAB7-POSITIVE поздних эндосомах и лишь вторично в лизосомах и в TGN. Это указывает на то, что холестерол д. накапливаеться в NPC1^-/- клетках в первую очередь в поздних эндосомах, которые являются местом сортировки для различных клеточных компонентов. Кроме того, NPC1^-/- клетки не м. обеспечить отток эндоцитозированной sucrose или отсортировывать mannose 6-phosphate рецепторы, указывая тем самым, что ретроградное движение белков и груза из поздних эндосом в TGN м..б. нарушенным.

Далее было установлено, что NPC1^-/- клетки м. иметь генерализованный блок рециклинга липидов из поздних эндосом в Golgi и плазматическую мембрану. Роль холестерола и его потенциальная функцию в модулировании липидного транспорта изучали с помощью BODIPY -labelled lactosyl ceramide (BLC; glycosphingolipid), чтобы определить распределение glycosphingolipid в нормальных и NPC1^-/- клетках после эндоцитоза из плазматической мембраны, и было установлено, что он локализуется преимущественно в аппарате Golgi в нормальных клетках. Однако, в клетках от пациентов с болезнями накопления сфинголипидов, включая NPC1 disease, BLC, были обнаружены PERINUCLEAR VESICLES , которые являются характеристиками эндосом и лизосом.

Если нормальные клетки растут в присутствии высоких уровней холестерола (чтобы вызывать накопление холестерола в эндосомно-лизосомной системе), то BLC обнаруживается в околоядерныхпузырьках, как это происходит в NPC1^-/- клетках, указывая тем самым, что холестерол м. модулировать движение др. липидов внутри клетки. Далее было подтверждено участие NPC1 в регуляции движения различных липидов по позднему эндоцитотическому пути,in regulating the movement of various lipids late in the endocytic pathway, возможно, из поздних эндосом. Избыточная экспрессия NPC1 в клетках CHO показала. что эктопическая экспрессия NPC1 (примерно 15-кратное превышение эндогенного уровня) вызывала увеличение транспорта LDL-cholesterol в плазматическую мембрану, следовательно, NPC1 действительно участвует в субклеточном транспорте липидов.

нализ топологического расположения внутри мембран указывает на то, что NPC1 содержит 13 трансмембранных доменов (Рис. 4) три большие просветные гидрофобные петли и цитоплазматический хвост. В цитоплазматическом хвосте имеется dileucine мотив, который управляет высвобождением др. мембранных белков в эндосомно-лизосомную систему. Несколько glycosylation consensus последовательностей разбросаны по всему белку, большинство из которых, по-видимому, используется in vivo.

Некоторые уникальные consensus последовательности для прокариотического lipoprotein-attachment сайта, обычно обнаруживаемые в прокариотических multi-transmembrane белках, обнаружены и в NPC1 белке. За исключением одного сайта в amino-acid положении 904, все сайты обнаруживаются внутри предполагаемых трансмембранных доменов 2, 4, 10 и 11. Существование этих сайтов и их потенциал используемый in vivo м. объяснить некоторые проблемы, связанные с поытками растворить этот большой гликопротеин. Эти сайты, найденны в прокариотических пермеазах семейства RND. Установлено, что NPC1 и члены RND семейства обладают одной и той же RND signature: 6 трансмембранных доменов, разделенных большой гидрофильной петлей между трансмембранными доменами 1 и 2. Этот домен повторяется дважды (Рис. 4).

Экспрессия NPC1 человека в E. coli показывает. что NPC1 функционирует как multidrug пермеаза, одинаково с ее прокариотическими родственниками, делая NPC1 первым mammalian членом этого древнего семейства. На E. coli , экспрессирующих NPC1, показано, что NPC1 м. транспортировать эффективно жирные кислоты, но не холестерол или cholesterol esters. Это м.б. обусловлено отсутствием необходимых добавочных белков или соотв. акцепторов холестерола в мембранах прокариот или это м. просто отражать тот факт, что NPC1 не транспортирует холестерол. Фактически, NPC1 м. транспортировать жирные кислоты или фосфолипиды в качестве своего первичного субстрата и лишь косвенно облегчать транспорт холестерола. Или, NPC1 м. транспортировать группу липидов, таких как сфинголипиды и ганглиозиды en masse. Гипотетическая модель функции NPC1 показана на он-лайн

(animated online)

New cholesterol-transport candidates

Помимо NPC1 и ABC-type транспортеров известны и др. белки, которые регулируют или вносят вклад в субклеточное перемещение липидов и стерола.

NPC2. Мутации в гене, кодирующем небольшой растворимый белок из эпидидимиса человека (HE1), оказалось ответственны за вторую комплементарную группу NPC болезней, NPC2, примерно у 5% пациентов. После идентификации гомолога HE1 у свиней было выявлено его специфическое связывание с холестеролом. Ген HE1 или NPC2 локализован в 14q24.3 и содержит 5 экзонов. NPC2 (HE1) экспрессируется во всех проанализированных тканях. Белок испытывает классическую MANNOSE 6-PHOSPHATE MODIFICATION , характерную для растворимых лизосомных белков и м.достигать лизосом доже когда добавлено экзогенно. Подтверждено, что этот малый ~18-kDa растворимый гликопротеин находится в просвете лизосом.

Пациенты с NPC2 болезнью также характеризуются накоплением свободного холестерола в эндосомно-лизосомной систеье, указывая тем самым, что NPC2 участвует в выходе холестерола и/или дрю липидов из эндосомных и лизосомных мембран. Однако, трудно понять как этот малый холестерол-связывающий белок участвует в этом процессе, особенно, если учесть что NPC1 находится преимущественно в поздних эндосомах, где холестерол накапливается и гда располагается этот белок.

Локализация NPC1 и NPC2 указывает на то, что они м. не взаимодействовать прямо, а функционируют в виде двух ступенек одного и того же пути. Предложена модель, согдасно которой NPC2 действует как мостик, позволяющий свободному холестеролу, освободившемуся от своей половинки из жирных кислот благодаря действию lysosomal acid lipase, проникнуть в мембрану органеллы (Рис. 6). В отсутствие NPC2, свободный холестерол м. формировать структуры, которые refractive к такому включению в мембрану или, альтернативно, он м. кристаллизоваться.

(Рис.6.) | Cholesterol movement facilitators.

Предплагается, что свободный хорестерол легко кристализуется при физиологической температуре. Фактически кристализаия холестерола в лизосомх просходит после поступления cholesteryl-ester липидных капелек, очевидно благодаря бомбардировке системы со свободным холестеролом после гидролиза cholesterol esters с помощью кислой липазы. Сходные кристаллы обнаружены в лизосомах NPC-дефицитных мышей. Итак, функция NPC2 м. облегчать инсерцию холестерола в эндосомные и лизосомные мембраны или альтернативно удерживать холестерол растворенным пока не произойдет инсерция (Рис. 6).

MLN64. Др. потенциальный регулятор субклеточного перемещения липидов MLN64. Это 50-kDa белок, первоаначально был идентифицирован как усилитель транскрипции в злокачественных malignant (MLN) клетках и картирован в 17q12-21. Белок MLN64 содержит домен, который гомлогичен steroidogenic acute-regulatory protein (STAR), который регулирует поступление холестерола в митохондрии путем облегчения переноса холестерола с наружной на внутреннюю мембрану митохондрий и, в конце онцов, продукцию стероидов надпочечниках и гонадах. Помимо MLN64 и STAR, некоторые и др. белки содержат START (STAR-related lipid transfer) домен, включая белок сигнальной трансдукции p122-RhoGAP и белок переносчик phosphatidylcholine.

Кристалическая тсруктура STAR показывает, что домен START связывает одиночную молекулу холестерола. Предполагается, что STAR функционирует курсируя с холестеролом через межмембранное пространство митохондрий по одной молекуля за раз. Это наблюдение м. распространить и на MLN64, который, как полагают. содержит 4 трансмембранных домена на N-конце и С-конце домена START, который находится полностью в цитозоле.

MLN64 ко-локализуется с NPC1 в мембранах поздних эндосом. Это м. указывать на то, что он м. выполнять свою роль по выводу холестерола вместе сNPC1. Однако, неясно как. START домен, который связывает холестерол, по-видимому, локализуется в цитозоле. MLN64 облегчает перемещение холестерола между двумя мембранами, возможно и двумя пузырьками. Но какова затем функция NPC1?Возможно MLN64 облегчает выход холестерола из поздних эндосом независимо от NPC1, который м. участвовать в более генерализованном оттоке липидов (см (animated online) . Альтернативно, MLN64-derived холестерол м. направляться в др. клеточные компартменты, по сравнению с NPC1-derived холестеролом. Наконец, не выявлено пациентов с накоплением холестерола в эндосомной системе, которые бы имели мутации в гене MLN64 gene.

NPC1L1. Строгая сиквенс и структурная гомлогия NPC1L1 и NPC1 указывает на то, что NPC1L1 м. иметь сходную роль с NPC1. NPC1L1 картирован в коротком плече хромосомы 7 в 7p13. Белок имеет 42% идентичных последовательностей и 51% сходство с NPC1. В отличие от NPC1, однако, NPC1L1 локализуется в TGN, и NPC1L1 м. иметь сходную функцию с NPC1 в этом месте. В противоположность NPC1, промоторная область NPC1L1 содержит как стерол-регулируемые элементы, так и YIN-YANG-1-BINDING SITES , указывая тем самым. что его экспрессия м. регулироваться стеролом и липидами. NPC1L1 содержит также sterol-sensing домен, подтверждая, что он участвует в транспорте стерола и липидов.

Ubiquitous mammalian permeases?

Идентификация NPC1 как первого у млекопитающихas RND-типа транспортера ставит вопрос, имеются ли др. белки млекопитающих, принадлежащие к этому семейству. Т.к. они нуждаются в PMF для функционирования, то др. белки эжтого семейства м. регулировать др. ступени эндоцитотического и экзоцитотического пути, т.к. просветы органелл в этой системе имеют более низкие значения pH, чем клеточный цитозоль. Вторым благоприятным условием для таких белков м.б. потенциал поперек внутренней митохондриальной мембраны . Итак, др. члены семейства RND у млекопитающих, возможно будут идентифицированы и функционируют в этих местах.

Имеется несколько кандидатов. Во-первых, гомологичный NPC1, NPC1L1, обнарживающий RND signature (Рис. 4),поэтому этот белок м.функционгировать как RND пермеаза. Его субклеточная локализация в TGN, в кислом компартмете (pH ~6.0), согласуется во вторым обязательным условием функционирования RND пермеаз.

Во-вторых, рецептор морфогена PTC также обнаруживает сильную гомологию с NPC1. Его предполагаемая топология согласуется с таковой у NPC1, и имеет также RND signature. Хотя этот рецептор и охарактеризован, его точная функция невыяснена. Hedgehog белки - класс секретируемых белков, включающий SHH, Indian hedgehog, Desert hedgehog и Tiggy-winkle hedgehog - являются лигандами для рецептора и необходимы для развития Drosophila, мышей и человека. Они модифицируются с помощью ковалентного присоединения молекулы холестерола к их С-концу в результате аутопротеолитических событий в ER, которые обусловливают их секрецию и возможно связывание с соседними клетками посредством PTC рецепторов.

PTC, в свою очередь, взаимодействует с seven-transmembrane-domain белком Smoothened (SMO) (Рис. 7). Хотя события этого пути изучены недостаточно полно, ясно, что SHH соединяется с PTC и препятствует его взаимодействию с SMO, чтов свою очередь позволяет SMO инициировать каскад событий, которые ведут к экспрессии специфических генов. Мутации, инактивирующие PTC или активируюие SMO вызывают в итоге базально-клеточную карциному, medulloblastoma, rhabdomyosarcoma и др. опухоли у человека.

(Рис.7.) | The Hedgehog-Patched-Smoothened pathway.

Sterol-sensing домен PTC обеспечивает его везикулярный транспорт и регуляцию SMO, выявляя тем самым взаимосвязь между SMO и регуляцией стерола с помощью PTC. Это чистая спекуляция, но факт, что PTC содержит RND signature, и факт, что он ликализуется внутри эндосомной системы, строго подтвержает, что PTC м.б. еще одним эукариотическим членом семейства RND пермеаз.

Conclusions и future directions

Cholesterol и other lipids. Помимо холестерола в мембранах присутствуют жирные кислоты, гликосфинголипиды и ганглиозиды и д. существовать механизмы их переноса и распределения. Данные о судьбе жирных кислот после отделения их от холестерла в результате действия кислой липазы малочисленны (Рис. 6). Считается, что жирные кислоты транспортируются с помощью активного механизма, но ничего не известно о белках, участвующих в этом процессе.

Только начинаем оценивать важность жирных кислот особенно в свете наблюдаений, что уровни жирных кислот скорее, чем холестерол, регулируют созревание SREBPs в определенных тканях.

Do multidrug proteins regulate lipid transport? Нет сомнений, что multidrug белки, особенно ABC типа участвуют в транспорте и гомеостазе липидов (Табл. 1). Классификация NPC1 как multidrug пермеазы добавляет новое семейство в эту группу регуляторов транспорта липидов. Идентификация NPC1L1 и PTC как потенциальных членов этого семейства открывает новые возможности для исследования клеточного липидного гомеостаза.

Помимо рассмотренных малые sterol-carrier белки, fatty-acid-carrier pбелки и annexins участвуют в транспорте липидов. Это подтверждается тем, что транспорт холестерола из очищенных лизосомных мембрна более чем в 100 раз медленнее, чем в интектных клетках, эо указывает на то, что дополнительные растворимые фактры необходимы для эффективного хода этого процесса.

С точки зрения б-ни NPC и генерализованного блока транспорта липидов важно понять, как glycosphingolipids, gangliosides и жирные кислоты выходят из эндосомно-лизосомной системы. Показано, что происходит накопление и др. липидов в NPC1^-/- клетках помимо холестерола, таких как lysobisphosphatidic кислота, GM2 и GM3 ганглиозиды, гликосфинголипид globotriaosylceramide, и даже amyloid-β белок protein. Итак, NPC1 , по-видимому, важный регулятор транспорта, отсутствие которого м. вызывать выраженный клеточный запор ('traffic jams').

Multidrug permeases and subcellular cholesterol transport

Links