Epithelial-Mesenchimal Transformations: Cushings
ТРАНСФОРМАЦИИ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМНЫЕ эндокардиальных подушек сердца
В сердечной трубке детерминируются две популяции эндокардиальных клеток в сегменте тракта оттока и актриовентрикулярного канала, которые в ответ на сигналы, продуцируемые миокардиальными клетками, трансформируются в мезенхимные клетки (эпителиально-мезенхимная трансформация). Установлено, что эндокард атриовентрикулярного канала экспрессирует TGFβ3 в ответ на сигнал от миокарда , что TGFβ3 эндокарда атриовентрикулярного канала функционирует аутокринно, индуцируя определенные характеристики, необходимые для формирования ткани подушек ( характеристики подобные гладкомышечным характеристикам миофибробластов (DeRucter at al., 1997).) и что TGFβ3 один или в комбинации с TGFβ2 недостаточен для трансформации эндокарда атриовентрикулярного канала в инвазивную мезенхиму в культуре (Nakajima at al., 1998).	Непосредственное добавление TGFβ-3 к клеткам мишеням обусловливает инвазивную миграцию, но только в культурах, которые активированы in vivo индуктивным взаимодействием с миокардом . Селективное подавление TGFβ-3 обусловленных аутокринных сигналов в совместной культуре эндокардиальных клеток и миокарда обусловливает отсутствие миграции эндокардиальных клеток, даже если они экспрессируют ранние маркеры , связанные с активацией эндокардиальных клеток (например,α-smooth muscle actin, ES/130, and TGFβ-3).Эти результаты уазывают на то, что (i) два сигнальных пути необходимы для старта и завершения эпителиально-мезенхимной трансформации в областях, формирующих подушечки и (ii)что сигналы эндокардиального пути дублируются TGFβ-3 и не являются функционально вырожденными ( redundant)для миокардиального пути (Ramsdell , Markwald, 1997). С помощью моноклональных антител против smooth muscle-specific α-actin (SMA),изучали иммуногистохимически участие этой формы актина в формировании ткани эндокардильаных подушек у птиц. Мигрирующие мезенхимные клетки экспрессируют SMA под мембранами клеточной поверхности . Эти клетки обнаруживают снижение специфического для эндоотелиальных клеток маркерного антигена, QH1. Стационарные эндотелиальные клетки не экспрессируют SMA. Накопление SMA в мезенхимной ткани сохраняется вплоть до конца плодного периода. Премиграторные эндотелиальные клетки , культивируемые в полной среде (CM199), содержащей TGF β3, экспрессируют SMA, тогда как клетки культивируемые только на CM199 не экспрессируют. С началом эндотелиально-мезенхимной трансформации , мигрирующие мезенхимные клетки экспрессируют SMA и экспрессия этой формы актина запускается с помощью TGF β3. Это одно из инициальных событий цитоскелетной реорганизации эндотелиаольных клеток(Nakajima et al., 1997). Transforming growth factor-β (TGF β) большинством клеток секретируется в виде латентно ассоциированного пептида (latency associated peptide) и латентного связывающего белка ( latent TGF β-binding protein (LTBP)-1). Используя поликлональную антисыворотку против LTBP-1 (Ab39) и культуру эмбрионального сердца изучали тканевое распределение LTBP-1 и его функциональную роль во время образования эндокардиальных подушек в сердце эмбрионов мыши. Зрелый TGF β белок необходим для начала эндотелиально-мезенхимной трансформации , для инициации образования ткани эндотелиальных подушек. Двойное окрашивание антителами показало, что LTBP-1 ко-лаколизуется с TGF β1 во внеклеточных фибриллярных структурах, окружающих мезенхимные клетки эндокардиальных подушек. Показано, что LTBP-1 локализуется в 40-100 nm внеклеточных фибриллярных структурах и в 5-10-nm микрофибрилах. anti-LTBP-1 антисыворотка (Ab39)ингибирует эндотелиально-мезенхимную трансформацию в атриовентрикулярных эндокардиальных клетках, культивируемых совместно с с миокардм в трехмерном геле. Эти результаты указывают на то, что LTBP-1 существует как внеклеточная фибриллярная структура и играет роль в хранении TGF beta в качестве большого латентного TGF β комплекса(Nakajima at al., 1997). У эмбрионов перепела на ранних стадиях развития (12), т.е. еще до инициации эпителиально-мезенхимной трансформации экспрессируются высокие уровни мРНК для ММР-2. ММР-2 постоянно экспрессируется в популяции этих клеток, т.е. экспрессия не зависит от миокардиальных сигналов, инициирующих процесс трансформации. Однако миокардиальные сигналы обусловливают переход этого фермента в активную форму (66 кДа)на стадиях 18-24, что соответствует времени эпителиально-мезенхимной трансформации и выселению клеток в кардиальный гель. Клетки гипертрофируются их слипчивость друг с другом уменьшается и в них активируются специфические гены, способствующие миграции мезенхимных клеток в матрикс сердечного геля. В это же время происходит и активация внеклеточной серин-протеазы, урокиназы.(Alexander at al., 1997). У эмбрионов мыши (16 стадия развития . 10-й день. По Theiler's (1989)) в атриовентрикулярном канале и в проксимальной части тракта оттока часть эндокардиальных клеток трансформируется. Этот процесс характеризуется гипертрофией клеток, потерей молекул межклеточной адгезии и усилением экспрессии молекул адгезии с субстратом. Эндотелиальные клетки принимают мезенхимную морфологию и проникают с миoкардиальную базальную мембрану/сердечный гель, состоящие из 2-х неравных размеров базальных мембран: толстой, производной миокарда и тонкой, ассоциированной с эндотелием. Перед инвазией мезенхимных клеток наблюдаетс экспансия ВКМ в форме локальных ацетобулярных набуханий ткани, результат взаимодействия коллагена и гиалуроната, дающего полностью гидратированный гель. Мезенхимные клетки и заселяют эти тканевые разбухания и формируют дефинитивную ткань подушечек. Региональные специфические взаимодействия миокарда с эндотелием инициируют формирование предклапанной мезенхимы. Сигнальные субстанции ВКМ, продуцируемые эмбриональным миокардом стимулируют цитодифференцировку атриовентрикулярного эндотелия в мезенхиму клапанов. Так, удаление EDTA soluble (ES) антигенов блокирует эпителиально-мезенхимную трансформацию. Миокардиальная базалная мембрана/сердечный гель в этот период содержат фибронектин, коллагены (I,III,IV), ламинин, тенасцин,цитотактин, витронектин, тромбоспондин, фибулин-1 и -2, фибриллин-подобные молекулы, хондроитин-сульфат и гиалуроновую кислоту . Хотя фибронектин экспрессинуется повсеместно, но в областях трансформации образуются уникальные формы фибронектина, отсутствующие в вентрикуляной области. С ним ассоциируют сигнальные молекулы ES1. След., эпителиально-мезенхимная трансформация опосредуется мультикомпонентным комплексом содержащим фибронектин и другие белки, появляющиеся только в областях эндотелиальной дифференцировки. Тромбоспондин 1 экспрессирует преимущественно в тканях кардиальных подушек, но заметно снижается после завершения этого периода. Тромбосподин 2 экспрессируется на низком уровне в кардиальных подушках и кардиомиоцитах. Ламинин присутствует в сердечном геле, на поверхности как эндотелия, так и миокарда. Присутствует и kоллаген IV. Фибулины наиболее четко локализуются в ткани эндокардиальных подушек, хотя они обнаруживаются и во многих других тканях. Фибулин-1 и-2 экспрессируются в тканях эндокардиальных подушек у эмбрионов птиц и мышей, причем фибулин-2 ко-локализуюется с фибронектином. Кроме того фибулин-1 специфически ассоциирует со спиральной аортикопульмональной перегородкой, атриовентрикулярными клапанами, полулунными клапанами аорты и легочной артерии. Он также концентрируется на границе между мезенхимой нижней части эндокардиальных подушек и миокардом мышечной части межжелудочковой перегородки . Тенасцин-с обнаруживается в сердечном геле где образуются сердечные подушечки. После затухания миграции мезенхимных клеток экспрессия тенасцина снижается, сохраняется только в периферических частях аортикопульмональной перегородки. Он ко-распределяется вместе с фибулином-1, но теносцин-С экспрессируется более фокально и не маркирует все области тканей подушек. Известно, что теносцин-С связывается с фибронектином. Витронектин также участвует в регуляции миграции мезенхимных клеток в подушки, он синтезируется миокардиальными клетками и некотрыми мезенхимными клетками подушек. Известно, что н ингибирует движение клеток по фибронектину (Little, Rongish,1995).

Непосредственное добавление TGFβ-3 к клеткам мишеням обусловливает инвазивную миграцию, но только в культурах, которые активированы in vivo индуктивным взаимодействием с миокардом . Селективное подавление TGFβ-3 обусловленных аутокринных сигналов в совместной культуре эндокардиальных клеток и миокарда обусловливает отсутствие миграции эндокардиальных клеток, даже если они экспрессируют ранние маркеры , связанные с активацией эндокардиальных клеток (например,α-smooth muscle actin, ES/130, and TGFβ-3).Эти результаты уазывают на то, что (i) два сигнальных пути необходимы для старта и завершения эпителиально-мезенхимной трансформации в областях, формирующих подушечки и (ii)что сигналы эндокардиального пути дублируются TGFβ-3 и не являются функционально вырожденными ( redundant)для миокардиального пути (Ramsdell , Markwald, 1997).

С помощью моноклональных антител против smooth muscle-specific α-actin (SMA),изучали иммуногистохимически участие этой формы актина в формировании ткани эндокардильаных подушек у птиц. Мигрирующие мезенхимные клетки экспрессируют SMA под мембранами клеточной поверхности . Эти клетки обнаруживают снижение специфического для эндоотелиальных клеток маркерного антигена, QH1. Стационарные эндотелиальные клетки не экспрессируют SMA. Накопление SMA в мезенхимной ткани сохраняется вплоть до конца плодного периода. Премиграторные эндотелиальные клетки , культивируемые в полной среде (CM199), содержащей TGF β3, экспрессируют SMA, тогда как клетки культивируемые только на CM199 не экспрессируют. С началом эндотелиально-мезенхимной трансформации , мигрирующие мезенхимные клетки экспрессируют SMA и экспрессия этой формы актина запускается с помощью TGF β3. Это одно из инициальных событий цитоскелетной реорганизации эндотелиаольных клеток(Nakajima et al., 1997).

Transforming growth factor-β (TGF β) большинством клеток секретируется в виде латентно ассоциированного пептида (latency associated peptide) и латентного связывающего белка ( latent TGF β-binding protein (LTBP)-1). Используя поликлональную антисыворотку против LTBP-1 (Ab39) и культуру эмбрионального сердца изучали тканевое распределение LTBP-1 и его функциональную роль во время образования эндокардиальных подушек в сердце эмбрионов мыши. Зрелый TGF β белок необходим для начала эндотелиально-мезенхимной трансформации , для инициации образования ткани эндотелиальных подушек. Двойное окрашивание антителами показало, что LTBP-1 ко-лаколизуется с TGF β1 во внеклеточных фибриллярных структурах, окружающих мезенхимные клетки эндокардиальных подушек. Показано, что LTBP-1 локализуется в 40-100 nm внеклеточных фибриллярных структурах и в 5-10-nm микрофибрилах. anti-LTBP-1 антисыворотка (Ab39)ингибирует эндотелиально-мезенхимную трансформацию в атриовентрикулярных эндокардиальных клетках, культивируемых совместно с с миокардм в трехмерном геле. Эти результаты указывают на то, что LTBP-1 существует как внеклеточная фибриллярная структура и играет роль в хранении TGF beta в качестве большого латентного TGF β комплекса(Nakajima at al., 1997).

У эмбрионов перепела на ранних стадиях развития (12), т.е. еще до инициации эпителиально-мезенхимной трансформации экспрессируются высокие уровни мРНК для ММР-2. ММР-2 постоянно экспрессируется в популяции этих клеток, т.е. экспрессия не зависит от миокардиальных сигналов, инициирующих процесс трансформации. Однако миокардиальные сигналы обусловливают переход этого фермента в активную форму (66 кДа)на стадиях 18-24, что соответствует времени эпителиально-мезенхимной трансформации и выселению клеток в кардиальный гель. Клетки гипертрофируются их слипчивость друг с другом уменьшается и в них активируются специфические гены, способствующие миграции мезенхимных клеток в матрикс сердечного геля.

В это же время происходит и активация внеклеточной серин-протеазы, урокиназы.(Alexander at al., 1997). У эмбрионов мыши (16 стадия развития . 10-й день. По Theiler's (1989)) в атриовентрикулярном канале и в проксимальной части тракта оттока часть эндокардиальных клеток трансформируется. Этот процесс характеризуется гипертрофией клеток, потерей молекул межклеточной адгезии и усилением экспрессии молекул адгезии с субстратом. Эндотелиальные клетки принимают мезенхимную морфологию и проникают с миoкардиальную базальную мембрану/сердечный гель, состоящие из 2-х неравных размеров базальных мембран: толстой, производной миокарда и тонкой, ассоциированной с эндотелием. Перед инвазией мезенхимных клеток наблюдаетс экспансия ВКМ в форме локальных ацетобулярных набуханий ткани, результат взаимодействия коллагена и гиалуроната, дающего полностью гидратированный гель. Мезенхимные клетки и заселяют эти тканевые разбухания и формируют дефинитивную ткань подушечек. Региональные специфические взаимодействия миокарда с эндотелием инициируют формирование предклапанной мезенхимы. Сигнальные субстанции ВКМ, продуцируемые эмбриональным миокардом стимулируют цитодифференцировку атриовентрикулярного эндотелия в мезенхиму клапанов. Так, удаление EDTA soluble (ES) антигенов блокирует эпителиально-мезенхимную трансформацию. Миокардиальная базалная мембрана/сердечный гель в этот период содержат фибронектин, коллагены (I,III,IV), ламинин, тенасцин,цитотактин, витронектин, тромбоспондин, фибулин-1 и -2, фибриллин-подобные молекулы, хондроитин-сульфат и гиалуроновую кислоту . Хотя фибронектин экспрессинуется повсеместно, но в областях трансформации образуются уникальные формы фибронектина, отсутствующие в вентрикуляной области. С ним ассоциируют сигнальные молекулы ES1. След., эпителиально-мезенхимная трансформация опосредуется мультикомпонентным комплексом содержащим фибронектин и другие белки, появляющиеся только в областях эндотелиальной дифференцировки. Тромбоспондин 1 экспрессирует преимущественно в тканях кардиальных подушек, но заметно снижается после завершения этого периода. Тромбосподин 2 экспрессируется на низком уровне в кардиальных подушках и кардиомиоцитах. Ламинин присутствует в сердечном геле, на поверхности как эндотелия, так и миокарда. Присутствует и kоллаген IV. Фибулины наиболее четко локализуются в ткани эндокардиальных подушек, хотя они обнаруживаются и во многих других тканях. Фибулин-1 и-2 экспрессируются в тканях эндокардиальных подушек у эмбрионов птиц и мышей, причем фибулин-2 ко-локализуюется с фибронектином. Кроме того фибулин-1 специфически ассоциирует со спиральной аортикопульмональной перегородкой, атриовентрикулярными клапанами, полулунными клапанами аорты и легочной артерии. Он также концентрируется на границе между мезенхимой нижней части эндокардиальных подушек и миокардом мышечной части межжелудочковой перегородки . Тенасцин-с обнаруживается в сердечном геле где образуются сердечные подушечки. После затухания миграции мезенхимных клеток экспрессия тенасцина снижается, сохраняется только в периферических частях аортикопульмональной перегородки. Он ко-распределяется вместе с фибулином-1, но теносцин-С экспрессируется более фокально и не маркирует все области тканей подушек. Известно, что теносцин-С связывается с фибронектином. Витронектин также участвует в регуляции миграции мезенхимных клеток в подушки, он синтезируется миокардиальными клетками и некотрыми мезенхимными клетками подушек. Известно, что н ингибирует движение клеток по фибронектину (Little, Rongish,1995).