Unravelling the RB pathway

Имеются многочисленные доказательства того, что p16^INK4a действует повсеместно как опухолевый супрессор в опухолях человека. Инактивирующие мутации в INK4a были картированы в семьях с семейной меланомой и было установлено, что INK4a мутации встречаются во многих типах спорадических опухолей. Факт, что исключительные события в опухолях вызывают потерю или p16^INK4a или RB, или избыточную экспрессию cyclin D1 или CDK4, все это указывает на то, что такие сигнальные пути оперируют при надзоре за опухолями ( tumour surveillance).

Самой простой моделью является та, согласно которой RB ограничивает ход клеточного цикла путем связывания с и удерживания E2Fs, которые, если освобождены от RB, обеспечивают вступление в S-фазу. Однако, это осложняется тем фактом, что три белка семейства RB (еще p107 и p130) регулируют функцию разных E2Fs, каждый гетродимер состоит из одной E2F субъединицы (1–6) с DP-1 или DP-2 связывающим партнером (Рис. 2). Сyclin D-зависимые киназы, включая 6 голоэнзимов, которые собираются из циклинов D1, D2 или D3, и CDK4 или CDK6. Имеется также 4 отдельных члена семейства INK4 , которое помимо p16^INK4a, включает p15^INK4b, p18^INK4c и p19^INK4d. Известными мишенями для INK4 белков являются cyclin-D-зависимые киназы, единственным распознаваемым субстратом для которых являются белки семейства RB. Если p16^INK4a, cyclin D1, CDK4 и RB часто дегерулированы в опухолевых клетоках, то p15^INK4b, p18^INK4c и cyclin D2 участвуют менее часто и в меньшем количестве типов опухолей. Участвуют ли p107 и p130, cyclin D3, CDK6 и p19^INK4d в формировании опухолей менее ясно. Итак, различия в паттернах экспрессии или активности этих белков д. объяснять их дифференциальые роль в туморогенезе.

'Free' E2F–DP комплексы активируют экспрессию генов, но их ингибирование с помощью белков самейства RB м. или блокировать активацию E2F или активно репрессировать транскрипцию путем привлечения др. негативных регуляторов к промоторам, чувствительным к E2F. E2F6 является аномальным. он не имеет трансактивирующего домена к которому присоединяются белки семейства RB; когда ассоциированный с субъединицей DP, E2F6 связывается с ДНК, то, по-видимому, конкурирует с др. E2F комплексами за сайты промотора. Избыточная экспрессия E2Fs 1–3 м. управлять вступлением в S фазу путем индукции генов, которые кодируют циклины S-фазы и cyclin-dependent kinases (CDKs), ДНК полимеразу-α, энзимы, участвующие в метаболизме нуклеотидов и некоторые белки, которые функционируют в обеспечении репликации ДНК. Потеря только E2f3 мыши ингибирует активацию многих E2f-регулируемых генов и сильно замедляет пролиферацию клеток, тогда как потеря E2f1 не оказывает такого эффекта. Однако, и E2f1 и E2f3 м. запускать апоптоз, который зависит от p53 и родственного p53 белка, p73.

RB преимущественно взаимодействует с E2Fs 1–3, тогда как p107 и p130 ассоциируют с E2F4 и E2F5 (Рис. 2). RB обычно соединяется — и, следовательно, ингибирует — только с небольшой фракцией из всей активности E2F и, очевидно, что потеря RB не м. полностью дерегулировать переход от G1 к S-фазе, т.к. p130 и p107 , по-видимому, компенсируют. Считается, что роль RB в супрессии опухолей зависит от E2Fs, но в немногих доступных мышиных моделях, опухолвый фенотип и апоптоз, результат нарушения белков семейства Rb, м.б. супрессирован на E2f1-null или E2f3-null фоне. Тем не менее, RB ассоциирует со многими белками, включая др. транскрипционные факторы, которые возможно позволяют RB регулировать экспрессию генов E2F-независимым способом.

Один из ключевых аргументов, что p16^INK4a действует на RB пути, получен в наблюдении, что p16^INK4a не ингибирует эффективно переход от G1-фазы в клетках, в которых отсутствует RB. Однако, теперь известно, что активность p16^INK4a связана с другими CDK ингибиторами семейства HETEROCHROMATIN , которое функционирует противоположно cyclin E–CDK2. Митоген-зависимое образование cyclin-D-зависимых киназ во время G1 фазфы секвестрирует p27^Kip1 и p21^Cip1, удерживая их от ингибирования Cdk2 (Рис. 3). Напротив, белки INK4 мобилизуют связывание пула Cip/Kip белков из cyclin D–CDK комплексов, вызывая ингибирование CDK2. Т.к. cyclin E–CDK2 кооперируют с cyclin D–CDK4 с инактивацией RB, то роль p27^Kip1 заключается в поддержании RB в его активном гипофосфорилированном состоянии (Рис. 3). CDK2 фосфорилирует др. субстраты, которые независимо вносят вклад в синтез ДНК, так что следуя логике, экспрессия INK4 белков м. затрагивать активности, которые не связаны с функцией семейства RB per se.

(Рис.3.)

| Activity of p16^INK4a и CDK inhibitors.

The INK4 family и cancer

Трудно понять, почему INK4a играет столь важную роль в супрессии опухолей по сравнению с др. членами семейства INK4. У мышей гены Ink4a и Ink4b , которые тесно сцеплены на хромосоме 4 (хромосоме 9p у человека), экспрессируются незаныительно во время плодного развития или у юных животных и только у взрослых мышей выявляются p16^Ink4a и p15^Ink4b. Открывается возможность, что эти два гена адаптированы противостоять инлдуцированным средой формам клеточных стрессов, которые потенциально способствуют возникновению опухолей. Ink4a-null мыши (retaining a functional Arf) склонны к образованию опухолей. Однако, в сравнении с данными, указывающими на то, что INK4a мутации значительно более распространены, чем те, что затрагивают INK4b, в опухолях человека, Ink4b-null мыши не обнаруживают ни аномалий развития, ни спонтанно развивающихся множественных опухолей в поздней жизни. Но разрушение Ink4b у мышей делает их предрасположенными к EXTRAMEDULLARY HAEMATOPOIESIS и лимфоидной гиперплазии, это согласуется с наблюдениями. что экспрессия INK4b замалчивается в определенных миэлоидных и лимфоидных опухолях человека.

В отличие от Ink4a и Ink4b, Ink4c и Ink4d гены экспрессируются повсеместно и обильно в течениее всего развития мыши и в виде стереотипных ткане-специфических паттернов в течение взрослой жизни. Мыши без функционального Ink4d не образуют опухолей и имеют нормальный не осложненный жизненный путь. Однако самцы без Ink4d и Ink4c имеют вроженные дефекты в развитии зародышевых клеток и являются стерильными; отсуствие Ink4d и Kip1 ведет к нейрональной дисфункции из-за неспособности некоторых нейронов в головном мозге выходить из клеточного цикла во время раннего постнатального периода. Мыши без Ink4c спонтанно образуют опухоли средней доли гипофиза, которые возникают также у Kip1-null животных и у Rb гетерозигот. Мыши без Ink4c и Kip1 формируют опухоли средней доли гипофиза в ускоренном темпе, также как и др. эндокринные новообразования. Следовательно, p18^Ink4c, а не p16^Ink4a, является доминантным регулятором Rb в этих типах клеток.

**Disabling the mouse Ink4a–Arf locus**

Разрушение Ink4a экзонов 2 и 3 (Рис. 1b) ведет к фенотипу, который объяснялся потерей функции p16^Ink4a . Мыши спонтанно и быстро давали опухоли разных типов в течение первого года их жизни. EARLY-PASSAGE mouse embryo fibroblasts (MEFs) от таких животных обнаруживали необычные свойства. оказывались способными расти непрерывно в культуре не обнаруживая признаков старения и были чувствительны к трансформации с помощью онкогенного Ras, не нуждаясь в добавочных иммортализующих онкогенах, так их как Myc или аденовирус E1A. Однако, когда Arf был селективно подавлен в результате разрушения его уникального первого кодирующего экзона (1β), то животные с отсутствием только Arf и MEFs обнаруживали кардинальные признаки, первоначально обнаруженные у 'Ink4a' нокаутных мышей. Свойства, первоначально относимые к потере p16^Ink4a , исходили на самом деле от нарушенного p19^Arf.

Установлено, что животные, содержащие мутантный Ink4a аллель не дают каких-либо опухолей в течение первого года жизни, тогда как они же с частичной делецией экзона 1β делают это. Ясно, что показатель уровня спонтанных опухолей у Ink4a-null животных значительно меньше, чем у Ink4a/Arf-null и чистых Arf-null линий.

BALB/c мыши имеют мутантный аллель Inka, который, по крайней мере частично, нарушает функцию p16^Ink4a. Эти животные дают PLASMACYTOMAS в ответ на внутрибрюшинные инъекции pristane oil, указывая тем самым, что B cells от Ink4a-null мышей м.б. гиперчувствительными к трансформациям. Мыши. экспрессирующие трансген Myc, управляемый IMMUNOGLOBULIN PROMOTER-ENHANCER (Eμ), дают D-клеточные лимфомы в первый год жизни. Помещение Eμ–Myc трансгена в Ink4a мутантный фон ускоряет В-клеточный лимфомагенез, при этом латентность лимфом значительно укаорачивается у животных без Ink4a/Arf или Arf только.

MEFs, происходящие из чистой Ink4a-null линии не распознают дефектов клеточного цикла. Напротив Arf-null MEFs, которые пролиферируют более быстро, чем контрольные клетки в культуре обладают свойствами постоянно поддерживаемых клеточных линий, тогда как Ink4a-null MEFs имеют нормальные профили клеточного цикла , арестовываются собственно истощенной сыворотке и не обладают колоние-образующими преимуществами, при помещении в низкую плотность. Ink4a-null MEFs подвергаются репликативному старению и не м. б. трансформированы с промщью одного онкогенного Ras. Когда Ink4a и Arf антисмысловые вектора вносили в первичные MEFs, то также обнарвживали. что Ink4a недостаточен для становления, но облегчает избегание старения.

Несмотря на факт, что немногие признаки, характерные для потери Arf, проявляются у чистых Ink4a-null мышей, p16^Ink4a действует все-же как опухолевый супрессор. Ink4a-null животные являются особенно чувствительными к влиянию канцерогенов, таких как dimethylbenzanthracene (DMBA) и urethane. DMBA-обработанные Ink4a гетерозиготы дают опухоли легких, в которых экспрессия с оставшегося аллеля Ink4a замалчивается. Некоторые Ink4a-null спонтанно дают меланомы. Это особенно интересно, не только потому, что семейные меланомы ассоциируют с мутациями p16^INK4a у людей, нои потому, что Ink4a/Arf-null и Arf-null линии дают мало доказательств развитию меланом, несмотря на скрещивание этих животных с экспрессирующими Ras трансген под контролем промотора тирозиназы. Еслиn Ink4a/Arf делеция в одной хромосоме комбинируется с мутантным аллелем Ink4a на др. (leaving one wild-type copy of Arf in cis), то показатель меланом значительно увеличивается. Воздействие DMBA вызывает даже более высокие частоты сильно агрессивных меланом.

Итак, по-первых, потеря Ink4a, хотя и недостаточна, чтобы гарантировать туморогенез, однако значительно сенсибилизирует мышей к carcinogenic insults. Во-вторых, меланома м.б. успешно моделирована у мышей особенно с едва различимой констелляцией founding генетических событий, которые сильно предрасполагают к опухолям. В-третьих, доказано, что Arf является HAPLO-INSUFFICIENT для супрессии опухолей, однако в комбинации с би-аллельной потерей Ink4a, элиминации лишь одной копии гена Arf (и продолжающаяся экспрессия других в меланомных клетках), по-видимому, достаточно , чтобы запрограммировать разные исходы, чем те, что наблюдаются у Ink4a/Arf-null или Ink4a-null мышей.

Ink4a и Arf in cellular senescence

Подобно Ink4a и Ink4b, Arf не обнаруживает заметной экспрессии во время развития плода. Однако, эксплантация MEFs в культуру ведет к быстрой индукции этих трех генов, указывая, что 'culture shock' per se - это все, что нужно. Причина - несоответствующие условия и ростовые факторы, несоответствующее напряжение кислорода, отсуствие соотвествующего матрикса или гетеротипических межклеточных взаимодействий — те же самые гены, по-видимому. м. вносить вклад в стресс-зависимый арест клеточного цикла in vivo. MEFs, эксплантированные от животных с отсутствием Ink4a или Ink4b, подвергаются старению в культуре, а Arf-null MEFs - нетt. Более того, спонтанное образование MEF-derived клеточных линий обычно сопровождается делецией Arf или мутацией p53. Напротив, потеря Rb не позволяет избегнуть старения и все три члена семейства Rb д.б. делетированы, чтобы гарантировать MEF иммортализацию и чувствительность к Ras трансформациям. Следовательно, разрыв Arf–Mdm2–p53 пути является более критическим, чем ниспровержение Rb пути для избежания репликативного старения у MEFs.

Одной из возможных интерпретаций является та, что мышиные клетки полагаются более на p53путь, чем на Rb путь в отношении их реакции на культуральный шок. Однако, установлено, что некоторые типы мышиных клеток м больше зависеть от Ink4a, чем от потери функции Arf при образовании постоянно растущих линий клеток. Итак, разумно предположить, что Ink4a, Ink4b и Arf вносят свой вклад в старение способом, специфичным для типов клеток. Участие INK4a репликативном клеточном старении показано с помощью первичных линий эпителиальных клеток ячеловека, таких как кератиноциты и эптелий молочных желез. Показано, что культуральные условия — скорее, чем удвоение популяции per se — детерминирует время индукции INK4a в перививаемых эпителиальных клетках человека. Следовеательно, не имеется доказательств, чтобы предположить, что INK4a функционирует как часть теломера-зависимого митотического таймера, а специфические сигналы, которые отвечают за индукцию p16^INK4a еще неидентифицированы.

ARF is activated by hyperproliferative signals

Arf индуцируется онкогенами, такими как Myc, аденовирус E1A, мутантный Ras и v-Abl^59-62. Это обусловливает активацию p53 и изменение маршрута клеток , которые поддерживают онкогенные повреждения, чтобы выбрать альтернативные судьбы — или арест роста или апоптоз. Потеря Arf или p53 элиминирует этот механизм надзора за опухолями и вместо этого позволяет онкогенам управлять пролиферацией тем способом, который благоприятствует неконтролируемому росту клеток и быстрому образованию опухолей. Экспрессия высоких уровней Myc в первичных MEFs запускает апоптоз, но строго отбирает появляющиеся редкие немортализующиеся варианты, которые теряют или p19^Arf или p53 функцию.Сходным обраом, у живых животных интактный Arf–Mdm2–p53 путь защищает Eμ–Myc трансгенных животных от формирования В-клеточных лимфом. Первоначально Myc-индуцированная пролиферация в B-lymphoid клетках ограничивается с помощью апоптоза Однако, лимфома возникает и большинство из них имеют Arf делеции или потерю p53. Внесение Eμ–Myc трансгена в гетерозиготный Arf фон ускоряет это заболевание, а функциональный аллель Arf обычно делетируется из опухолевых клеток, которые возникают. Eμ–Myc трансгенные животные, у которых отсутствуют оба аллеля Arf , разиваются значительно более тяжелые заболевания и гибель от очень агрессивной lympholeukaemias в течение двух месяцев после рождения, это подтвержает защитную роль Arf's.

По сравнению с Myc, экспрессия высоких уровней онкогенного Ras в первичных MEFs вызывает др. исход - а именно, p53-зависимый арест клеточного цикла. Напотив, Arf-null MEFs стимулируются к пролиферации с помощию Ras и подвергаются трансформации. Хотя онкогенный Ras индуцирует экспрессию p19^Arf, однако независимый Ras-активируемый, сигнальный путь mitogen-activated protein kinase (MAPK) м. индуцировать Mdm2 в Arf-null клетках. Противоположные эффекты Ras на p19^Arf и Mdm2 м., следовательно. детерминировать уровень p53. Это м. объяснить находку, что Ras-трансформировнные клетки, которые сохраняют p53 дикого типа, резистентны к p53-зависимому апоптозу, который индуцируется при повреждениях ДНК.

Arf индуцируется также с помощью E2f1, Это ведет к интригующей идее, что p19^Arf осуществляет соединение между путями Rb и p53 (Рис. 4). Ни E2f1, ни Myc не обнаруживают прямого взаимодействия с промотором Arf. Тем не менее, предполагается, что эффект мутаций в Rb пути м.б. устранен активацией Arf. E2f1, подобно Myc, является потенциальным apoptotic при избыточной экспрессии, и установлено, что апоптические функции Myc м.б. опосредованы, по крайней мере частично, через индукцию E2f1. Однако, E2f-1 м. также активировать p53 и p73 через Arf-независимые пути и в противоположность in vivo исследованиям Myc, мы еще не знаем, м. ли образование опухолей, вызываемых потерей Rb и активацией E2f, ускоряться на Arf-null фоне.

(Рис.4.)

| A signalling network central to tumour suppression.

Белок p53, активированный с помощью повреждений ДНК, передает сигналы через p19^Arf-независимый и p19^Arf-зависимый пути. Ионизирующая радиация запускает 'ataxia-telangiectasia, mutated' (ATM) киназа-зависимое фосфорилирование как p53 , так и HDM2, которое аннулирует их функциональное взаимодействие и запускает p53 транскрипционный ответ. Налюдения, что E2f1 также является субстратом Atm kinase, и что он стабилизируется, если фосфорилирован таким способом, поозволяют предположить, что Atm м. также передавать сигнал p53 через E2f1–Arf ось (Рис. 4). Это м.б. помочь объяснить, как потеря Arf, хотя и не очень существенная для активации p53, модифицирует продолжительность ответа на повреждения ДНК.

Хотя аномальный порог митогенных сигналов активирует Arf, ивозможно Ink4a, оба не обнаруживают заметной экспрессии в .scnhj делящихся эмбриональныхз клетках in vivo. Концепция, что Ink4a/Arf активно репрессируются во время развития in utero пришала из исследований Bmi1репрессора, который, если неактивен в зародышевой линии мышей, то ведет к онтогенетическим аномалиям лимфоидной и ЦНС. Поразительно, эти дефекты обратимы на Inka/Arf-null генетическом фоне. Некоторые др. генные продукты, включая Twist и Tbx-2, также являются мощными репрессорами Arf (Рис. 4). Эти последние гены обнаруживают избыточную экспрессию в RHABDOMYOSARCOMAS и карциномах груди человека, соотв., это указывает на то. что даже в отсутствие мутаций ARF, HDM2 или p53, др. генетические модификаторы м. нарушать путь к определенным опухолям.

Signalling loops и branch points

В то время как активность E2f м связывать Rb путь с p53 через Arf, последние гены м. зависеть от функции белков семейства Rb, чтобы вызвать арест клеточного цикла (Рис. 4). MEFs без Rb, p107 и p130 резистентны к p19^Arf-индуцируемому аресту. Простейшим объяснением м.б. то, что способность p53 индуцировать CDK ингибитор, p21^Cip1, делаест способным p19^Arf предупреждать фосфорилирование белков Rb-family. Однако, p19^Arf м. индуцировать арест G1 в первичных клетках, у которых отсутствует p21^Cip1, т.к. др. белки также д. связывать Arf–Mdm2–p53 путь с Rb.

Мутация p53 или амплификация Mdm2 часто сопровождаются избыточной экспрессией Arf. Наротив, повторное внесение дикого типа p53 в такие клетки супрессируетс синтез Arf synthesis. Эти данные говорят в пользу контроля петлей обратной связи, в которой p53 активация глушит функцию Arf (Рис. 4). Механизмы репрессии прямые или косвенные остаются неизвестными, хотя предполагается, что p53, на мишени Arf, м. помогать заканчивать Arf ответ, во многом тем же способом, что и Mdm2, мишень для p53, м. заканчивать p53 ответ.

Наконец, Arf–Mdm2–p53 путь не м. совершенно линейным. Мыши с отсутствием всех трех генов формируют спектр опухолей. которые не обнаруживаются у животных с отсутствием только p53 или обоих p53 и Mdm2. Более того, введение p19^Arf в эти трипло-нулевые MEFs вызывает арест клеточного цикла в G1 фазе, хотя и со значительно более медленной скоростью, чем в клетках, сожержащих Mdm2 и p53. Следовательно, p19^Arf м. иметь мишени и помимо Mdm2 (Рис. 4).

Future directions

Взаимосвязи между RB и p53 путями обнаруживают сложную синальную сеть, которая является субъектом для многих inputs и feedback controls (Рис. 4). Установлено, что Ink4a и Arf функционально взаимодействуют при избегании клеточного старения. Пока непонятоно, как эта сеть отвечает чтобы дать разные контрастирующие биологические исходы, такие как пролиферация, с одной стороны, арест клеточного цикла или апоптоз, с др. стороны. Если E2Fs являются скорость ограничивающими для вступления в S-фазу, а также обеспечивают соединение функций RB и p53 путей, затем уровни активности E2F м.б. важными вместе с 'physiological' порогами сигналов для обеспечения пролиферации , а избыток E2F запускает компансаторный checkpoint controls. Если предположить, что E2f–p53 содединение осуществляется через p19^Arf, то потеря Arf должна будет прерывать предачу сигналов между E2fs и p53 и увеличивать образование опухолей. Роль Arf's in vivo в модулировании туморогенеза в ответ на потерю Rb еще не исследована.

Др. идея, что белки, такие как Bmi-1, Tbx2 и Twist активно репрессирующие экспрессию Ink4a/Arf во время развития, м. предупреждать активацию Rb- и p53-зависимых checkpoint mechanisms, которые м препятствовать быстрой клеточной пролиферации in utero. Однако, наблюдения, что Twist и Tbx2 избыточно экспрессируются в опухолях человека говорит о том, что несоответствующая супрессия ARF во взрослых тканях увеличивает вероятность образования опухолей. Расширение этой концепции м.б. пи условии, что все опухоли имеют дефекты функции p53, хотя фактически некоторые опухоли имеют не мутантные ARF, HDM2 и p53 геныТ.е. опухоли м. возникать и при интактной RB и p53 сети.

THE INK4a/ARF NETWORK IN TUMOUR SUPPRESSION