Allan M. Weissman Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 169 -178 (2001)
| The ubiquitylation pathway.
| The many functions of de-ubiquitylating enzymes.
| E2–E3 interactions.
| E3–substrate interactions
| Different functions for different ubiquitin linkages.
ORIGINAL RESEARCH PAPERS
Li, W. et al. A ubiquitin ligase transfers preformed polyubiquitin chains from a conjugating enzyme to a substrate. Nature 18 Feb 2007 (doi: 10.1038/nature05542)
Ravid, T. & Hochstrasser, M. Autoregulation of an E2 enzyme by ubiquitin-chain assembly on its catalytic residue. Nature Cell Biol. 21 Feb 2007 (doi: 10.1038/ncb1558)
Предполагалось, что polyubiquitin цепочки конструируются в сайте Lys остатка в субстрате путем последовательного добавления мономеров ubiquitin к дистальному концу растущей цепочки. Исследования Li et al. эта точка зрения была поставлена под сомнение, т.к. они показали, что polyubiquitin цепочки быстро формируются на E2 ubiquitin-conjugating энзиме, когда очищенные E2, E3 (ubiquitin ligase) и ubiquitin инкубируются вместе. Цепочки формируются на каталитическом остатке Cys, с которого ubiquitin переносится на субстрат. Далее авт. показали, что, по крайней мере in vitro, polyubiquitin цепочка может переноситься en bloc с E2 на Lys остаток субстрата мишени. Происходит ли это in vivo неизвестно, но Li et al. удалось установить, что polyubiquitin цепочки прикреплены в каталичтическому остатку Cys той же самой E2 в клетках, обработанных ингибитором proteasome.
В др. исследовании Ravid и Hochstrasser наблюдали in vivo образование polyubiquitin цепочек на каталитическом остатке Cys дрожжевой Ubc7, ортологе E2, исследованном Li et al. Стабильность Ubc7 зависит от партнера по связыванию, Cue1, т.к. Ubc7 подавляется в отсутствие Cue1. Сигналом для деградации Ubc7, как было установлено, является polyubiquitin цепочка, формируемая на каталитическом остатке Cys, но Cue1 не спасает Ubc7 путем предупреждения образования этой цепочки. Вместо этого, Cue1, по-видимому, действует как защитный chaperone, который делает возможной сборку polyubiquitin цепочки на Ubc7, но предупреждает лигазу от того, чтобы она распознавалась как сигнал к деградации протеосомами.
Как же polyubiquitin цепочка генерируется на E2? Li et al. показали, что ubiquitin может быть перенесен с E2 на другой, чтобы сформировать di-ubiquitin цепь. Для этого, по-видимому, необходимо, чтобы E2 энзимы димеризовались, что было продемонстрировано для нескольких отличюащихся E2s. Необходимы дальнейшме исследования, чтобы установить, как di-ubiquitin цепочки затем удлиняются в более длинные ubiquitin цепочки, которые необходимы для эффективной деградации.
FURTHER READING
Hochstrasser, M. Lingering mysteries of the ubiquitin-chain assembly. Cell 124, 27–34 (2006)
Welchman, R. L. et al. Ubiquitin and ubiquitin-like proteins as multifunctional signals. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6, 599–609 (2005)
Ubiquitin - высоко законсервированный эукариотический белок в 76-аминокислот, который ковалентно соединяется с белками в виде мономеров или lysine-linked цепочек.
Ubiquitylation является результатом высоко специфического мультиферментного процесса, связанного с классами энзимов E1s, E2s и E3s. Имеется единственный известный E1 (ubiquitin-activating enzyme) ген, несколько E2s (ubiquitin-conjugating enzymes) и существенно большее количество потенциальных E3s (ubiquitin protein ligases).
E2s характеризуются законсервированным стержневым доменом. Различаются E2s как по стержневому домену, по N- and C-терминальным расширениям, обладающие потенциалом детерминировать специфичность E3 взаимодействий, так и по их локализации внутри клетки.
Специфичность ubiquitylation в первую очередь связана с E3s. Имеется два основных класса E3: HECT доменовые E3s и RING finger E3s. Кристаллическая структура членов обоих классов, связывающихся с E2, пока неизвестна.
HECT E3s включают E6-AP, участвующий в HPV-E6-зависимой деградации p53, а также и ряда др. белков. Большинство HECT E3s имеют N-терминальный C2 домен и несколько WW доменов.
RING finger E3s включают состояфщие из одиночной субъединицы E3s, таккие как Mdm2 и c-Cbl, а также мультисубъединичные E3s. Последние облают общими свойствами, характерными для членов семейства cullin, в качестве компонента активного комплекса.
Ubiquitylation обратимо. Удаление ubiquitin с белков, разборка multi-ubiquitin цепочек, и процессинг предшественника ubiquitin в зрелые формы обеспечиваются de-ubiquitylating энзимами.
Модификации с помощью ubiquitin связаны обычно с деградацией белков путем направления их в протеосомы. Однако, ubiquitin выполняет и др. роль в клетке, не связанную с протеосомной деградацией, но также влияющей на судьбу белка.
Simon Frantz Choosing to be single Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, (2002)
Как клетки решают monoubiquitylated или polyubiquitylated? Это решение является критическим, т.к. будучи нагруженным одиночной копией ubiquitin предопределяет будет ли белок вовлечен контролируемый эндоцитоз или будет направлен на деструкцию протеосомами.
Установлено, что распознавание ubiquitin' ом и monoubiquitylation зависит от ubiquitin-interacting motif ( ), который обнаруживается во многих группах белков, включая эндоцитотические белки и убиквитиновые лигазы. Polo и др. показали, что детерминанты, которые необходимы для monoubiquitylation эндоцитозом регулируемых белков Eps15 и eps15R, картируются в С-терминальных областях белков — в области, которая содержит два домена UIM. Делеционный анализ этой области показал, что один из этих доменов является критическим для monoubiquitylation и связи с ubiquitin-содержащими белками, тогда как др. домен критический только для monoubiquitylation. Функция домена UIM иллюстрируется и тем, что ubiquitin ligase — которая катализирует перенос ubiquitin, — м. monoubiquitylate eps15, но не UIM-делетированные мутанты.
Было также показано, что др. белки, которые участвуют в эндоцитозе, — epsins, которые взаимодействуют непосредственно с clathrin и участвуют в internalization, и (hepatocyte growth-factor regulated tyrosine kinase substrate), который участвует в рекрутировании клатрина в эндосомы, — также функционируют через посредство UIM домена. Hicke и др., а также Stenmark и др, нашли, что UIM домены в epsins и Hrs, соотв., необходимы для связывания ubiquitin. Stenmark и др. также обнаружили, что ubiquitylated белки локализуются специфически на Hrs- и clathrin-покрытых микродоменах, это указывает на то, что Hrs/clathrin оболочка концентрирует ubiquitylated белки, прежде чем сформируются пузырьки.
ORIGINAL RESEARCH PAPERS Polo, S. et al. A single motif responsible for ubiquitin recognition and monoubiquitination in endocytic proteins. Nature 416, 451-455 (2002) |
Jianping Jin, Xue Li, Steven P. Gygi & J. Wade Harper
Dual E1 activation systems for ubiquitin differentially regulate E2 enzyme charging
Nature 447, 1135-1138 (28 June 2007) | doi:10.1038/nature05902
Ubiquitin и др. ubiquitin-like molecules (UBLs) после трансляции прикрепляются к белкам посредством последовательного энзиматического каскада, который использует E1 активирующий энзим, E2 конъющирующий энзим и E3 ligase. Было предположено, что одиночный E1 — UBE1 (ubiquitin-activating enzyme E1) — активирует ubiquitin и что субстратная специфичность каскада (белки которого модифицируются с помощью ubiquitin) обусловлена исключительно разнообразием E2s и E3s. Jin et al. подтвердили, что оба эти предположения неправильны, идентифицировав вторую E1 для ubiquitin, которая и определяет отдельный ubiquitin-conjugating путь.
E1 энзимы характеризуются доменом аденилирования, который состоит из двух ThiF-homology мотивов, которые связывают и аденилируют (активируют) UBL, a catalytic cysteine domain (CCD), к которому аденилированный UBL временно прикрепляется во время каскада, и С-терминальный ubiquitin-fold domain (UFD), который рекрутирует E2. Jin et al. исследовали геном человека по генам, которые кодируют ThiF-homology domain. Они идентифицировали все известные E1s и ранее неохарактеризованный белок UBA6 (известный также как UBE1L2 (ubiquitin-activating enzyme E1-like 2)). UBA6 содержит также CCD и UFD так что только по составу доменов UBA6 сильно напоминает E1 энзим.
Способность UBA6 активировать разные UBLs, включая некоторые, для которых E1 неизвестна, была протестирована in vitro. Неожиданно UBA6 активированный ubiquitin, но не др. UBLs были протестированы. Это подтвердилось in vivo: UBA6, который конъюгировался с ubiquitin, может быть изолирован их клеток в условиях, которые стабилизируют E1–ubiquitin промежуточные образования.
Затем авт. сравнивали специфичность UBA6 по переносу ubiquitin на разные E2s с таковой UBE1. Хотя некоторые E2s заряжались с помощью UBA6 и UBE1 с одинаковой эффективностью, две E1s обнаруживали разные специфичности. Почти половина протестированных E2s заражалась только с помощью UBE1, в то время как ранее неохарактеризованная E2 идентифицировалась как первая UBA6-specific E2 (USE1).
Дифференциальная зарядка E2s законсервирована in vivo: деплеция UBA6, вызванная small-interfering-RNA, избирательно редуцирует уровни заряженных USE1, но не той UBE1-специфичной E2. UBA6 и USE1 формируют часть второго ubiquitin-conjugating каскада; однако, E3s и субстраты мишени для USE1 остаются неизвестными. Специфичность разных E1s преимущественно генерируется с помощью UFD т.к. переключение UFDs между UBA6 и UBE1 меняет специфичность в направлении некоторых (но не всех) E2s.
Итак, эти находки показывают непредвиденный уровень регуляции в ubiquitin-conjugation каскаде. Ранее зависимость процесса от ubiquitin часто исследовали путем ингибирования UBE1 и, следовательно, необходима переоценка настоящей зависимости от ubiquitin.
Lee, I. & Schindelin, H. Structural insights into E1-catalyzed ubiquitin activation and transfer to conjugating enzymes. Cell 134, 268–278 (2008)
Ubiquitin-активирующие (E1) энзимы катализируют первую ступень каскада убиквитинирования, в результате которого добавляется ubiquitin (Ub) и др. ubiquitin-like белки (Ubls) к белкам мишеням. Короче, E1 энзим соединяется с Ubl, аденилирует его C конец и затем переносит Ubl на Ub-conjugating (E2) белок для следующей ступени каскада убиквитинирования. Хотя общий механизм активности E1 известен, структура E1 энзима оказвалась неуловимой. Lee and Hermann Schindelin описывают анализ кристаллической структуры Е1 энзима Saccharomyces cerevisiae, Uba1, связанного с Ub.
труктура Uba1 содержит 6 modular доменов: IAD, AAD, FCCH, SCCH, 4HB и UFD. 4 из этих доменов, AAD, FCCH, SCCH и UFD, упакованы вместе, чтобы сформировать большой центральный каньон (приблизительно 40-Aо шириной), один конец которого приспособлен под Ub. Ширина каньена указывает на то, что он может также быть приспособлен под E2 белок. Эта структура также включает 3 флексибельных линкера, которые соединяют UFD, FCCH и SCCH с сотов. с ними соседствующими доменами.
Путем анализа структуры Uba1 и с помощью наблюдения эффектов характерных точковых мутаций, авт. получили информацию о функции и механизме активности E1 activity. E1 энзимы оказались высоко специфичными как к Ubls, так и E2 энзимам. В кристаллической структуре три разные стороны Ub взаимодействуют с Uba1, а Uba1 предоставляет остатки, которые контактируют с Arg72 из Ub, ключевой аминокислотой для узнавания Ub. Хотя приблизительно 33% области поверхности Ub внедряется в Uba1. Авт. полагают, что эти наблюдения возможно объясняют специфичность E1 энзимов к Ubls. При внесении точковой мутации в Uba1, авт. показали, что UFD выполняет ключевую роль в связывании E2 белков. Более того, UFD , , по-видимому, отвечает за конформационные изменения, которые, как полагают авт., возможно являются критическими для передачи Ub на следующий E2 белок.
Т.к. E1 энзимы и Ubs из разных организмов обнаруживают существенную гомологию, то UBE1, гомолог Uba1 у млекопитающих, может принимать сходную архитектуру, как и Uba1 и может активировать Ub тем же самым способом.
Review ArticleThe ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins
Camilla Raiborg & Harald Stenmark (26 March 2009) | doi:10.1038/nature07961
| Рисунки к статье
Избирательный перенос мембранных белков на лизосомы для деструкции необходим для собственно передачи клеточных сигналов и метаболизма. Убиквитилирование управляет этим процессом, специфицируя какие белки д. транспортироваться в просвет лизосом с помощью мультивезикулярного эндосомного пути. Аппарат endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) сортирует меченный ubiquitin груз в инвагинации эндосомных мембран. Затем посредством высоко консервативного механизма, используемого также в цитокинезе и почковании вирусов, обеспечивается разрыв содержащих груз пузырьков внутри просвета по периметру мембраны. Участие аппарата ESCRT в супрессии болезней, таких как рак, нейродегенеративные и инфекционные нарушения, подчеркивает его важность в клетках.