Targeting telomeres in cancer

Теломеры являются терминальными нуклеопротеиновыми структурами, расположенными на концах эукариотических хромосом. Эти структуры функционируют как защита геномной стабильности путем ограничения нежелательной репаративной активности ДНК на концах хромосом, а в клетках человека путем контроля тотального количества времени, в течение которого клетка может делиться, ограничивая тем самым накопление геномной нестабильности в активно делящихся клетках [1].

Сохранность генома контролируется с помощью теломерной нуклеопротеиновой структуры посредством функции специфичного для теломер 'shelterin' белкового комплекса [2] (see Glossary). Внутри комплекса shelterin, субъединицы TRF2 и POT1 блокируют не санкционируемый доступ активности по репарации ДНК на теломерах [3]. Однако, в соматических клетках теломеры укорачиваются при каждом делении (феномен наз. проблемой концевой репликации) приводя к минимальному порогу длины теломеры, известному как Hayflick Limit. Как только этот порог нарушается, теломеры теряют свою защитную способность, приводя к двум критическим исходам [1]. Или клетка обнаруживает угрозу, связанную с таким укорочением теломер, вызывая инициацию зависимого от p53 сигнального каскада, который индуцирует репликативное старение, состояние перманентного ареста клеточного роста, или клетки обходит клеточные КПП (checkpoints) и продолжает пролиферировать. Если клетка продолжает пролиферировать, то укорочение теломер в конечном итоге убивает клетку при кризисе, независимо от регуляторный механизм длины теломеры активирован, чтобы позволить устойчивый рост.

Огромное большинство раковых опухолей, 85-95% от всех случаев, сохраняют длину теломеры путем усиления активности экспрессии голоэнзима теломеразы [4]. Теломераза - это специализированная обратная транскриптаза, чей стержень состоит из hTERT каталитической субъединицы, малого ядрышкового рибонуклеопротеида dyskerin (DKC1) и hTR не кодирующей РНК [5], которая предоставляет матрицу для синтеза de novo новой теломерной ДНК на концах хромосом, так что не происходит сталкивания с Hayflick Limit [6]. Следовательно, первичной целью противораковых исследований стало изобретение стратегии, нацеленной на теломеразу, чтобы ингибировать пролиферацию раковых клеток. Однако, одним из критических предостережений стала возможность, что ингибирование теломеразы в опухолях д. приводить к активации др. механизма регуляции длины теломер, известного как ALT [7].

Поддержание длины теломер с помощью ALT использует зависимый от гомологичной рекомбинации (HR) обмен и/или зависимый от HR синтез теломерной ДНК [8]. Свободные концы ДНК, такие как те, что в сайтах репарации повреждений или при коллапсе репликативной вилки внутри теломерной ДНК в ALT клетках, д. служить в качестве матрицы в процессе, который сходен с breakage-induced replication (BIR) [9]. В этом процессе поврежденная или частично реплицированная тепломерная нить проникает в др. гомологичную хромосому, чтобы инициировать синтез ДНК, приводя к восполнению длины теломеры. Альтернативно, линейные или циркулярные внехромосомные TTAGGG ДНК фрагменты, обнаруживаемые в ALT клетках, должны служить в качестве матриц для синтеза теломер путем амплификации по окружности (rolling circle) [10]. Хотя это неизвестно в точности, как ALT клетки удлиняют свои теломеры, клетки, которые используют ALT обладают набором уникальных свойств и эти отличительные признаки предоставляют ценную информацию для поддержания теломер с помощью пути ALT [11] (Box 1). Box 1. Molecular hallmarks of ALT The mechanism of telomere maintenance in ALT that results in the exchange of DNA between chromosome ends produces signatures that taken together, but not in isolation, are consistent with ALT activity. Heterogeneous telomere length: In primary and telomerase positive cells, telomeres either progressively shorten or remain at fixed lengths, respectively. In ALT cells, recombination produces long and short telomeres that, in standard methods of telomere length measurement, manifest as sharp fluctuations over successive generations [106]. Changes in telomere length can also be accounted for by an elevated frequency of telomere loss that is observed in ALT. Telomere recombination: Evidence for a causal role for recombination in ALT comes from the observation of the direct 'copy and paste' of a telomere integrated 'tag' from one telomere to one on another chromosome [8]. This assay is not trivial, so fluorescence in situ hybridization (FISH) or chromosome-orientation FISH (CO-FISH) analysis of telomere sister chromatid exchange events in metaphase spreads is frequently substituted to indicate ALT activity [107]. Extra-chromosomal telomeric repeat (ECTR) DNA: ALT cells and tumors contain large amounts of extra-chromosomal DNA species [108]. Two-dimensional (2D) electrophoresis of telomeric DNA can be employed to ascertain important structural information regarding ECTR [109]. Newly developed assays that employ the ?29 DNA polymerase to amplify trace amount of partially single-stranded CCCTAA, C-circles [98], and double-stranded TTAGGG, T-circles [110], circular extra-chromosomal telomeric DNAs have proven to accurately indicate ALT activity. ALT-associated PML bodies (APBs): APBs are large PML bodies in which telomeric DNA and shelterin proteins are clustered 73 and 111. A host of other proteins that otherwise do not localize to PML bodies have been visualized in APBs. These include DNA repair factors: MRN (Mre11-Rad50-Nbs1), RFC (Rad17, Rad9, Rad1 and Hus1), RAD51, RPA2, BRCA1, SMC5/6 [11], and several chromatin modifiers such as HP1, HIRA, and ASF1a [112]. The precise role of APBs remains unclear with suggestions that they represent 'factories' of telomere recombination and elongation by replication coupled DNA synthesis. Alternatively, since the frequency of APBs increases upon cell cycle arrest, they may be linked with the suppression of DDR much like the senescence-associated heterochromatic foci (SAHF) that are observed in senescence [113]. Even though 5-15% of cells within a heterogeneous cell culture or tumor exhibit APBs, their size and focal properties make them readily visible in fluorescence microscopy. Therefore, APBs are commonly used to infer ALT activity. However, despite their prominence in ALT, the case for direct causality is not watertight as some ALT positive cells and tumors lacking APBs have been identified. Absence ofATRX: The deletion of the ATRX gene and/or protein strongly correlates with ALT (See main text). ATRX mutation or absence of ATRX protein may serve as a useful biomarker for ALT in tumors. Telomerase repression: By definition, telomere length maintenance in the absence of telomerase remains the 'gold standard' for ALT [35]. Repression of hTERT, and often hTR, gene expression most likely involves epigenetic silencing via DNA methylation.

Хотя ALT-позитивные опухоли возникают менее часто, чем позитивные по теломеразе опухоли, Обследование раковых опухолей человека выявило доказательства ALT при glioblastoma multiforme (GBM) [12], diffuse intrinsic pontine gliomas (DIPG) [13], pancreatic neuroendocrine (PanNET) опухолях [14], human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2) позитивных карциномах груди [15], раках мезенхимного происхождения, включая остеосаркому, астроцитому и липосаркому, и опухоли от пациентов с синдромом Li-Fraumeni [16]. Многие из этих раковых опухолей остаются плохо изучены и прогноз их часто смертелен. Поэтому понимание молекулярной биологии того, как путь ALT активируется и может быть подвергнут воздействию, имеет важный приоритет.

Несмотря на богатство информации о ALT, механизм активации ALT и идентификация участвующих факторов, остаются неуловимыми. Естественно, поскольку shelterin координирует репликативный и пост-репликативный процессинг хромосомных концов и поскольку TRF2 [17], RAP1 [18] и Ku70/80 гетеродимер [19], как было установлено, репрессируют рекомбинацию на теломерах, то было заподозрено, что специфические мутации в shelterin наделяют гипер-рекомбинацией теломеры. Однако, поиски таких мутаций в shelterin и в 293 генах, которые ранее были связаны с ALT пока не дали ожидаемых результатов [20]. Тем не менее крупномасштабное секвенирование генома идентифицировало ассоциированные с ALT мутации в α -thalassemia/mental retardation syndrome X-linked (ATRX) и в death domain-associated protein (DAXX) генах, и что более неожиданно в самих генах гистонов. ATRX - это SNF2 helicase/ATPase и ремодельер хроматина [21], тогда как DAXX как недавно было пересмотрено является гистоновым шапероном 22 and 23. Это открытие открыло область эпигенетической регуляции теломер в попытке понять, как ALT активируется и регулируется.

ALT associated mutations in histone H3, ATRX, and DAXX

Первое доказательство, что эпигенетические и хроматиновые дисфункции участвуют в ALT, получены в исследовании came PanNET и GBM опухолей [14]. Эти опухоли содержат крупные собранные в кластеры теломерные фокусы, как показывает fluorescence in situ hybridization (FISH), которые напоминают ALT-ассоциированные PML тельца (APBs). Те же самые опухоли также всегда лишены обнаружимой экспрессии ATRX, а часто и DAXX [14]. Эта удивительная корреляция между ALT и нарушением экспрессии ATRX была в дальнейшем подтверждена отсутствием обнаружимых количеств белка ATRX в 22 ALT клеточных линиях и гибридных клеточных линиях, которые обладают активностью ALT 20 and 24. Следовательно, ATRX появляется как самый сильный кандидат, идентифицированный кстати для супрессии ALT. Курьезно, ген дикого типа ATRX был обнаружен при секвенировании ДНК большинства ALT клеточных линий, это подтверждает, что, скорее всего, существуют ALT клеточно-специфичные пост-транскрипционные или пост-трансляционные изменения в созревании белка ATRX.

Кроме того, многие GBM и DIPG опухоли содержат гетерозиготные мутации в гене гистона H3.3, H3F3A, и менее часто в H3.1 генах, HIST1H3B и HIST1H3C. Эти мутации результат аминокислотных замен, которые изменяют критические регуляторные модули непосредственно по lysine 27 в (K27 M) и по glycine 34 (G34R, G34 V), которые косвенно затрагивают лизин 36 гистона H3 (H3K36) 12 and 13. Статус метилирования H3K27 и H3K36 ассоциирован с транскрипционной репрессией и активацией, соотв. [25]. Мутация K27 M действует как доминантно негативная в Polycomb regulatory complex (PRC2), поскольку она непосредственно ингибирует каталитическую активность Enhancer of Zeste (EZH2), H3K27me2/3 lysine methyltransferase (KMT), чтобы действительно устранить H3K27me2/3 в этих опухолях [26]. Это вполне возможно нарушает регуляцию глобальной экспрессии генов и может активировать онкогены 27 and 28. Сходным образом G34R/V мутации, по-видимому, поддерживают экспрессию некоторых генов, включая MYCN онкоген, вообще-то путем переориентации геномного широкого связывания H3K36 KMT, Set-domain containing 2 (SETD2) [29]. Помимо K27 M и G34R/V опухолей, обладающих геномными CpG hypo-methylator фенотипами 28 and 30 с выраженным гипо-метилированием теломерных проксимальных генов и субтеломерных повторов [30]. Заметим, что клетки, происходящие от ATRX пациентов, обнаруживают гипо-метилирование тандемных ДНК повторов, включая субтеломерные повторы [21]. Поэтому несколько линий доказательств строго подтверждают, что эти мутации вызывают выраженные изменения в эпигенетическом ландшафте субтеломерного и теломерного хроматина, которые облегчают активацию механизма поддержания теломер с помощью ALT механизма.

Однако, несмотря на подтверждённую причинную связь между этими мутациями и активацией ALT, имеются определенные предостережения, которые ставят под вопрос эту прямую связь. Во-первых, в большинстве опухолей мутации появляются взаимно исключающим способом и опухоли часто не демонстрируют ALT. Более того, некоторые ALT позитивные опухоли имеют функциональными гистон H3, ATRX и DAXX экспрессию, указывающие, что др. дефекты или вообще клеточно неавтономные факторы в микроокружении опухолей, могут вносить вклад в проявление определенных отличительных признаков ALT. Во-вторых, ни K27 M и G34R/V мутации, ни DAXX мутации не обнаруживаются вовремя секвенирования многих ALT клеточных линий [20]. В-третьих, ATRX сцеплен с моделированном ДНК, сборкой хроматина, репрессией транскрипции и процессом репликации, большей частью в тандемных повторах [31]. Однако, роль ATRX в теломерах и последствия нарушений ATRX при ALT остается загадочной. Вообще-то наиболее основательно, ни острый, ни пролонгированный нокдаун ATRX в клетках HeLa и SV40 иммортализованных BJ фибробластов недостаточен для превращения в ALT 20 and 32. Следовательно, хотя в отсутствие ATRX, скорее всего, затрагиваются теломеры способом, который уникален для ALT, наиболее вероятно участие фактора, а не 'X-factor' для активации ALT. Точная роль ATRX в ALT может быть прояснена после повторного внесения экспрессии ATRX в ALT клетки. Наконец, определение ALT статуса в этих опухолях базируется на поразительном присутствии только крупных теломерных FISH фокусов 12 and 14. Некоторые из отличительных признаков ALT, такие как ALT ассоциированые PML тельца (APBs) и внехромосомные теломерные повторы (ECTR) (Box 1), ранее наблюдались в клетках, которые не обладали настоящей ALT активностью, когда тщательно были протестированы 33 and 34. Мы подтвердили, что более детальный анализ некоторых отличительных признаков ALT [35], напр., использование др. ALT диагностиков, таких как базирующийся на polymerase chain reaction (PCR) C-circle метод, который определяет внехромосомную теломерную ДНК [36], может гарантировать подкрепление случаев ALT активности в таких опухолях.

A distinctive chromatin landscape at ALT telomeres

Теломерный хроматин млекопитающих, по-видимому, имеет несколько структурных признаков, которые отличают его от др. регионов. Теломерная ДНК обычно организована в регулярно расположенные в пространстве плотно упакованные нуклеосомы, которые имеют более короткие (40 пн) линкерные сегменты ДНК между нуклеосомами [37], вообще-то благодаря малому числу линкерного связывающего гистона H1 [38]. Биохимические исследования показали, что TTAGGG повторы по существу плохой субстрат для сборки нуклеосом [39] и будучи собранными теломерные нуклеосомы, в отличие от большинства др., обладают прирожденной мобильностью [40]. Теломеры часто обозначают как гетерохроматиновые структуры, учитывая концентрацию в них H3K9me3 и H4K20me3 и низкие уровни ацетилирования гистонов (Figure 1A) [41]. Обогащение гетерохроматиновыми метками может коррелировать с более значительной длиной теломер, а также с повышенными уровнями H3K9me3, H4K20me3 и HP1, наблюдаемыми в теломерой естественной длины у лабораторных мышей (25-150 kb) и в клетках человека с удлиненными теломерами (~20 kb) 38, 42 and 43.

Figure 1. The chromatin landscape of mammalian telomeres. (A) In germ and stem cells human telomeres (9-20 kb) are elongated by the telomerase complex, which consists of the catalytic hTERT subunit, the hTR template RNA, and the auxiliary factor dyskerin (DKC1). Typically, they display features of heterochromatin at sub-telomeric and telomeric compartments. In this figure, enrichments of tri-methylated lysine 9 of histone H3 (H3K9) and tri-methylated lysine 20 of histone H4 (H4K20) promote the association of heterochromatin protein 1 (HP1). The boundary between sub-telomeric and telomeric chromatin is demarcated by di-methylated lysine 79 of histone H3 (H3K79me2) and by enrichment of DNA methylation of sub-telomeric chromatin. (B)Alternative lengthening of telomeres (ALT) telomeres are considerably longer (4-50 kb) and contain an increased presence of variant repeats such as C-type TCAGGG repeats. These provide a platform for the binding of orphan nuclear receptor proteins such as NR2F2 and the nucleosome remodeling deaceteylase complex, NuRD-ZNF827. ALT telomeres display reduced levels of H3K9me3. As a result, they may contain elevated levels of histone acetylation as suggested by the reduced compaction of nucleosomal arrays. Sub-telomeric chromatin also displays reduced heterochromatic marks and altered DNA methylation patterns. The more open chromatin configuration of ALT telomeres may promote homologous recombination directed telomere elongation and greater transcription of the telomeric non-coding RNA (TERRA). ALT telomeres are distinct in that they contain variant C-type TCAGGG repeats and sumoylated TRF2. These features of ALT telomeres may lead to displacement of TRF2 and perhaps its binding partner, RAP1. Notes. (i) For the purposes of graphical clarity, we have illustrated features of telomeric chromatin and telomeric DNA separately, even though they co-exist in vivo. (ii) Other shelterin components TIN2, TPP1, and POT1 are present at both telomerase-positive and ALT telomeres. However, for the purposes of graphical clarity, they are not shown in the figure of ALT telomeres (B).

Эпигенетический ландшафт теломер, по-видимому, совершенно отличен от регионов в непосредственной близости (Figure 1A). В отличие от суб-теломерных регионов, теломеры обнаруживают пониженные уровни H3K79me2 [44], и хотя теломерные повторы лишены канонических сайтов метилирования CpG, субтеломерные регионы обнаруживают сильно метилированные CpG [45]. Это влияет на транскрипционную репрессию теломерных не кодирующих РНК, TERRA [46], и на регуляцию активности теломеразы 43 and 45. Недавно ощутимые количества метилирования не-CG ДНК были обнаружены в теломерах эмбриональных стволовых клеток человека [47]. Последствия такого редкого и необычного метилирования ДНК в теломерах неясны, но это сцеплено с геномным импринтингом и клеточным репрограммированием [48].

Эта корреляция между более длинными теломерами и повышенной плотностью и гетерохромтинизацией теломер, по-видимому, нарушена в ALT теломерах, даже если они существенно длиннее, чем их не-ALT аналоги (Box 1). Сравнения между теломерным хроматином клеток с ALT и экспрессирующих теломеразу, показало, что ALT теломеры обладают более расслабленной и доступной структурой хроматина с пониженной плотностью нуклеосом (Figure 1B) [49]. Субтеломерные паттерны метилирования ДНК, по-видимому, гетерогенны и на пониженных уровнях 45 and 50, на таких как уровни H3K9me3 [49]. Это коррелирует с повышенными уровнями TERRA, которые обнаруживаются в ALT клетках (Figure 1B) [20]. Итак, согласно наблюдениям, что нарушения различных ДНК и гистоновых метилтрансфераз у мышей приводят к повышенной рекомбинации в теломерах и к формированию APB, очевидно, что дефекты формирования гетерохроматина составляют эпигенетическую основу для ALT 51-53.

Неизвестно, нарушает ли истощение аналогов человека этих модификаторов хроматина специфически структуру теломерного хроматина или затрагивает ALT. Очевидно, что ингибирование гистоновых деацетилаз (HDACs) из-за trichostatin A (TSA), чтобы блокировать образование гетерохроматина, усиливает образование ECTR и повышает обмен теломерных сестринских хроматид в теломерах, указывая, что активность ALT чувствительна к изменениям в структуре хроматина [54]. Сходным образом, пониженные уровни линкерного гистона H1, как было установлено, усиливают рекомбинацию теломер [55]. Из-за интереса к статусу ALT теломерного хроматина необходимо разработать всеобъемлющую характеристику ландшафта ALT хроматина. Первоначально необходимо исследование во времени каждой пост-трансляционной сайт-специфической модификации гистонов ALT теломеров, которые могут быть полезны для идентификации факторов, участвующих в становлении и поддержании хроматина ALT теломеров.

Более того, имеются дополнительные структурные компоненты, уникальные для организации ALT теломеров. Помимо находящихся в составе канонических TTAGGG повторов, ALT теломерная ДНК, как известно, содержит вариант C-типа TCAGGG повторов и небольшую пропорцию G-типа TGAGGG повторов, которые располагаются внутри хромосомных теломер, и APBs 56 and 57. Пропорция вариантов повторов увеличивается, чем больше длина теломеров [58]. Как такие повторы вариантов появляются в теломерах, остается неизвестным. Мутагенез из-за репарации повреждений, индуцированных реактивным кислородом, в теломерах является одной из таких возможностей. Интересно, что наблюдаются дисфункции митохондрий в ALT опухолях мышей [59]. Они могут быть также результатом обусловленного теломеразой мутагенеза теломер [58]. Т.о., повторы вариантов могут быть генетическими остатками до этого активного механизма поддержания теломер [58].

Последовательность варианта TCAGGG создает высокое сродство связывания мотивов для ядерных орфановых рецепторов: COUP-TF2 (NR2F2) и TR4 38 and 57 , которые рекрутируют комплекс nucleosome remodeling deacetylase (NuRD), в частности NuRD-ZNF827 [114] (Figure 1B). Инжиниринг теломер, чтобы они содержали последовательность TCAGGG в клетках, позитивных по теломеразе, за счет экспрессии мутантной матрицы РНК теломеразы, способствует связыванию ядерных орфановых рецепторов и формированию ECTR, но это не приводит к межтеломерному копированию интегрированного тэга (Box 1) 57 and 114. Скорее это приводит к тому, что комплекс NuRD-ZNF827 способствует активности ALT за счет изменений ландшафта хроматина теломер, это повышает взаимодействия теломер и способствует рекрутированию HR белков [114]. Вообще-то наиболее важным является тот факт, что TRF2 обладает пониженным сродством связывания с последовательностями теломерных вариантов [57]. Как результат, интегральные функции TRF2 в организации теломерного хроматина, также, как и его роль в защите хромосомных концов и регуляции длины теломер, скорее всего, нарушены. Итак, ALT теломеры существуют вместе с атипичной конфигурацией хроматина с отклонениями в последовательностях теломерной ДНК, что может влиять на загрузку TRF2.

How chromatin dysfunction may affect ALT telomeres

Repair of DNA damage at ALT telomeres

Клетки, которые используют ALT, почти всегда лишены p53, обнаруживают сложные перестройки кариотипа, экстенсивную micronucleation, и нарушение способности препарировать ДНК, это согласуется с врожденной нестабильностью генома [20]. Это доказывается персистенцией нерепарируемых фокусов повреждений ДНК и спонтанной совместной локализацией теломерной ДНК и факторов репарации повреждений ДНК, которые образуют фокусы, наз. telomere-dysfunction induced foci (TIFs), которые присутствуют как в APB, так и в не-APB фокусах [60]. Тот факт, что эти TIFs могут быть супрессированы за счет эктопической экспрессии TRF2, но не hTERT подтверждает, что они возникают из дефектов в структурной целостности и не образуются в присутствии коротких теломеров [61]. Предполагается, что основой этого феномена может быть вытеснение TRF2 из теломер, обусловленное повторами TCAGGG 57 and 114 или секвестрацией пулов TRF2 вдали от теломер в APBs, для этого может использоваться сумоилирование TRF2 с помощью SMC5/6 комплекса [61] (Figure 2). Снижение только связывания TRF2 может давать теломеры, которые существуют временно или частично в состоянии отсутствия защиты на разных стадиях клеточного цикла [62] (Figure 2). Несмотря на присутствие TIFs слияние теломер за счет NHEJ редкое в клетках ALT, подтверждая присутствие достаточной защиты теломер [60]. Это, по-видимому, не обусловлено нарушением активности RNF8-RNF168 или нарушением рекрутирования 53BP1. Однако, снижение TRF2 может также альтернативно нарушать рекрутирование факторов, участвующих в нормальном репликативном процессинге теломер или в снятии запрета на рекрутирование HR белков. В любом случае может происходить ассоциация DNA damage response (DDR) факторов с теломерами. Кроме того, вытеснение TRF2 может также вызывать снижение уровней RAP1 в теломерах, которое д. быть существенным, поскольку RAP1 участвует в ингибировании homology directed repair (HDR) [18] (Figure 2).

Figure 2. DNA damage suppression at mammalian telomeres (A) In normal and telomerase-positive telomeres, TRF2, POT1, and the T-loop structure block the association of ataxia-telangiectasia mutated (ATM) and ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) kinases to prevent non-homologous end joining (NHEJ)-mediated fusion of telomeres. In some circumstances, TRF2-associated RAP1 represses homology directed repair (HDR) activity at telomeres. Similarly, the compact heterochromatic state of telomeres may block NHEJ and HDR activities at telomeres and, therefore, contribute to genome stability. (B) At alternative lengthening of telomeres (ALT) telomeres, the presence of variant C-type repeats and resultant binding of nuclear orphan receptor protein, NR2F2, may dislodge or prevent TRF2 binding at telomeric DNA. The sumoylation of TRF2 may also contribute to its sequestration to APBs. Combined with the relaxed chromatin configuration of ALT telomeres (see Figure 1), telomeres may be more amenable for stochastic binding of DNA repair proteins such as ATM, RNF-8, RNF-168, and 53BP1 (black arrows). These proteins modify chromatin by phosphorylation of histone H2AX (?H2AX) by ATM, poly-ubiquitination of histone H2A by RNF8-RNF168, and may transiently activate the DNA damage response (DDR) at ALT telomeres. Alternatively, proteins such as 53BP1 may recognize bi-partite histone modifications consisting of di-methylation of lysine 20 in histone (H4K20me2) and mono-ubiquitination of lysine 15 in histone H2A (H2AK15). Despite the localization of these factors to telomeres, NHEJ is prevented. This is most likely due to the persistence of the T-loop. The reduced heterochromatic status of ALT, telomeres and perhaps its elevated levels of histone acetylation, may contribute to the inhibition of NHEJ activity of 53BP1, thereby facilitating homologous recombination.

Поскольку TRF2 координирует сборку нуклеосом на теломерах [63], снижение белка TRF2 д. вызывать более открытую конфигурацию хроматина на ALT теломерах (Figure 2). Интересно, что инкорпорация повторов варианта TCAGGG в теломераза-позитивные клетки, которые, по-видимому, нарушают ассоциацию TRF2 с теломерами, коррелирует со снижением H3K9me3 [114]. Др. недавнее исследование установило, что снижение H3K9me3 частично нарушает зависимое от NHEJ слияние теломер в клетках TRF2 нокаутных мышей [64]. Это напоминает наблюдения, где нарушения гетерохроматина и измененные паттерны ацетилирования гистонов, по-видимому, колеблются в выборе механизма репарации между NHEJ и HR 65 and 66. Следовательно, пониженные уровни H3K9me3 в ALT клетках могут вызывать предрасположенность теломер к механизму, базирующемуся на HR. Это может отражать консервативные функции гетерохроматина, т.к. при нарушении H3K9me3 KMT у Drosophila melanogaster, Suppressor of Variegation 3-9 (Su(var)3-9), дестабилизирует тандемные повторы и способствует генерации внехромосомных наборов, повторяющихся ДНК [67]. Вероятность, что изменения в балансе между гетерохроматиновыми H3K9me3 и модификациями ацетилирования гистонов, происходящими в ALT теломерах, занижены за счет наблюдаемого усиления ALT отличительных признаков, главным образом ECTR и APBs, вследствие обработки ALT клеток с помощью ингибитора гистоновой деацетилазы, Trichostatin A (TSA) [54]. Т.о., поскольку ECTR постоянно генерируется в ALT клетках, кажется вполне возможным, что активность HDAC на теломерах каким-то образом устраняется способом, которые способствует ALT. Некоторые из HDACs участвуют в репликативном процессинге и стабильности нормальных, позитивных по теломеразе и в ALT теломерах, такие как члены семейства sirtuin NAD-зависимые HDACs, SIRT1 [68] и SIRT6 [69] (нормальные и теломераза позитивные), HDAC5 (ALT) [70], и NuRD комплекс (ALT) [114].

Повреждения ДНК, как было установлено, способствуют формированию APBs [71]. Образование APB использует повышенные перемещения теломеров внутри ядра, чтобы сформировать кластеры из двух до пяти теломеров на APB 72 and 73. Пермиссивный хроматин может сделать возможной повышенную подвижность теломер теломер в ALT. Ассоциация 53BP1 усиливает подвижность теломеров [74], а их соединение с поврежденным хроматином происходит посредством распознавания нуклеосом, обладающих ди-метилированным H4K20 и убиквитинированным H2AK15 [75]. Следовательно, значительно большая подвижность ALT теломеров может быть обусловлена персистенцией повреждений, ассоциированных с модификациями хроматина, которые привлекают факторы, такие как 53BP1, которые локализуются, хотя и частично в APBs [76]. Одним из предостережений этой модели является то, что ацетилирование гистонов, в частности H4K16, делает хроматин доступным даже устойчивым к ассоциации с 53BP1 [66]. Интуитивно это придает смысл в отношении ALT, учитывая, что 53BP1, по-видимому, мешает репарации ДНК за счет гомологичной рекомбинации и вызывает слияния теломеров посредством NHEJ, сопровождаемые полным снятием защиты с теломер, как это происходит в TRF2 нокаутных клетках 3 and 74. Существует более одного параметра, которые могут менять подвижность ALT теломеров, что происходит при более значительной локализации орфановых ядерных рецепторов на ALT теломерах 38 and 57. Предыдущие исследования показали, что в ответ на андрогенные стимулы ядерные рецепторы могут запускать внутри - и межхромосомные взаимодействия, чтобы вызывать транслокации 77 and 78. Хотя этот процесс, по-видимому, снова использует NHEJ, он вполне допустимо, что действуя и контексте теломеров, повышая гомологию последовательностей и вызывая альтерации в ландшафте хроматина, будет действовать в пользу гомологичной рекомбинации.

Т.о., уровни TRF2, изменяющие последовательность и ассоциацию ядерных рецепторов и модификаций хроматина могут координировать процесс перемещения теломеров в ALT клетках. Это, скорее всего, будет способствовать ALT-специфической ассоциации факторов, которые создают или поддерживают с HR пермиссивный хроматин. Дальнейшее выявление сложности ALT структуры хроматина необходимо, чтобы исследовать эту возможность и достичь четкого понимания последствий частичной DDR и роли модификаций хроматина в ALT теломерах. Текучесть модификаций хроматина в ходе клеточного цикла могут быть важными детерминантами этих процессов, которые следует учитывать в таких исследованиях.

Replication and chromatin assembly at ALT telomeres

Теломеры напоминают ломкие места и характеризуются дополнительными осложнениями аппарата репликации ДНК 79 and 80. Напр., высокое содержание GC теломерных повторов означает, что вторичные структуры, такие как G-quadruplexe, могут формироваться и препятствовать прогрессии репликативной вилки [81]. TRF2-ассоциированные геликазы, такие как WRN и BLM, участвуют в устранении таких G-квадруплексов, также, как и Holliday соединений [82]. Кроме того, TRF2 работает вместе с Apollo нуклеазой и топоизомеразой 2α, чтобы смягчить репликативный стресс на теломеры [83].

Однонаправленный проход репликативной вилки означает, что в случае коллапса вилки, надвигающаяся конвергентная репликационная вилка не сможет восстановить репликацию [79]. Остановившаяся репликационная вилка внутри теломера спонтанно регрессирует в топологии промежуточных образований ДНК, которые могут быть использованы в качестве матриц для ничем не оправданных событий рекомбинации ДНК [84]. Следовательно, поскольку ALT теломеры существенно длиннее, то вероятность репликативных осложнений, скорее всего, будет возрастать более высокой длине теломеров, увеличивая пропорцию последовательностей вариантов повторов и потенциально за счет снижения загрузки или вытеснения TRF2. Фактически, удлинение теломер за границы обычных гомеостатических уровней, по-видимому, достаточно для возникновения некоторых ALT отличительных особенностей, таких как ECTR, за счет активации механизма 'telomere trimming', но не ALT, per se 33 and 34. Неизвестно, увеличиваются ли репликативные стрессы в этом примере. очевидно, что избыточная экспрессия TRF2, как было установлено, противодействует элонгации теломер в ALT клетках, это снова подтверждает, что пулы связанных с теломерами TRF2 могут быть ограничены на ALT теломерах[85]. Прямые доказательства в пользу идеи, что репликативный стресс может быть признаком ALT, получены в наблюдениях, что делеция replisome helicase, RTEL (regulator of telomere length) в клетках мыши, которые имеют длинные теломеры, как было установлено, провоцируют образование ECTR [86]. В этом исследовании продукция ECTR была блокирована из-за воздействия на клетки соединений, которые полностью останавливают репликационную вилку [86]. Следовательно, повторная инициация репликации на впавшей в коллапс вилке может быть потенциальным источником, с помощью которого может быть активирована ALT.

Пертурбации в сборке хроматиновых структур во время репликации ДНК могут быть также результатом коллапса репликационной вилки и повреждений ДНК. В самом деле, ATRX целенаправленно воздействует на тандемные повторы, которые преимущественно образуют G-quadruplexes in vitro и раскручивают эти структуры, чтобы поддержать репликацию [87]. В соответствии с этим дефицит ATRX ассоциирует с репликативными стрессами, обусловленными остановкой репликационной вилки [88] (Figure 3A). Как упоминалось выше ATRX вместе с гистоновым шапероном DAXX, необходим для отложения гистона H3.3 в теломерах. Гистон H3.3 сцеплен с транскрипционной активностью и, следовательно, он обеспечивает ей высокие скорости. Прирожденная нестабильность нуклеосом в тандемных повторах свойственна теломерам, подтверждая, что гистон H3.3 может также быть предметом быстрого оборота, независимо от транскрипционной активности. Следовательно, комбинированные активности геликаз и гистоновых шаперовнов комплексов ATRX-DAXX могут идеально подходить для устранения G-quadruplexes и облегчения сборки хроматина как во время S-фазы, так и вообще вне S-фазы, где они служат для пост-репликативной репарации повреждений хроматина (Figure 3A). Ассоциация ATRX с хроматином происходит посредством модуля связывания богатых цистеином H3K9me3, домена ADD (ATRX-DNMT3-DNM3L) и блокируется с помощью H3K4me3 89 and 90. Многие из миссенс мутаций ATRX располагаются в этом модуле распознавания H3K9me3 [91]. Следовательно, в отсутствие ATRX, как это имеет место в линиях ALT клеток и ALT позитивных опухолях, G-quadruplexes могут оставаться не расправленными и будут блокировать прогрессию вилки (Figure 3B), это будет ограничивать скорость репликации и репрессировать транскрипцию теломеров. Даже благодаря роли ATRX в транскрипционном контроле TERRA возникают расходящиеся результаты 49 and 92, каковы последствия потери функции ATRX на сборку хроматина во время репликации, не были исследованы в ALT клетках. Это могло бы предоставить информацию, каковы последствия мутации ATRX и изменения сборки хроматина на ALT теломерах.

Figure 3. Chromatin assembly mechanisms at mammalian telomeres. (A) Owing to several unique features (listed beneath the fork), telomeres are classified as regions that are difficult to replicate. As a result, the speed of fork progression may be reduced. Should aberrant DNA structures form (e.g., G-quadruplexes) because of replicative stress at telomeric TTAGGG tandem repeats, ATRX binds to chromatin via H3K9me3 to catalyze the ATP dependent unwinding of these structures. This enables DAXX mediated incorporation of histone H3.3-H4 dimers and faithful chromatin assembly at tandem repeats. (B) In the absence of ATRX (?-thalassaemia/mental retardation X-linked), a feature of Alternative Lengthening Telomeres (ALT) positive tumors and alternative lengthening of telomeres (ALT) cell lines, these aberrant DNA structures like G-quadruplexes that form remain unresolved and impede deposition of histone H3.3-H4 by the histone chaperone, DAXX (death domain associated). This may lead to prolonged replicative stress as illustrated by the accumulation of replication protein A (RPA) over single stranded DNA. At ALT telomeres, changes in the telomeric genomic sequence may displace TRF2. This could augment replicative difficulties at ALT telomeres. The ensuing changes in chromatin might alter transcription of telomeric non-coding RNA (TERRA). (C) During DNA replication in S-phase, the anti-silencing function 1 (ASF1) co-operates with the mini-chromosome maintenance (MCM2-7) complex and recycles parental histone H3.1-H4 dimers that are evicted as the fork progresses. These histones are transferred behind the fork and re-distributed onto newly replicated DNA strands. This might occur via chromatin assembly factor 1 (CAF1), although this needs to be formally proven. Similarly, ASF1 regulates the de novo assembly of histone H3.1-H4 dimers via the CAF1. This is mediated through a cooperative association between CAF1 and proliferation nuclear antigen (PCNA). The genomic features of telomeres render them as difficult to replicate. (D) In instances of hyper elongated telomeres, the co-depletion of the histone chaperones ASF1a and ASF1b was shown to induce ALT in otherwise non-ALT cells. Following depletion of ASF1, histone management at the fork is deregulated and transfer of evicted histones is impeded. This causes the fork to slow down further and eventually stall. Tracts of partially replicated single stranded DNA may form G-quadruplex structures or become bound by RPA, most notably on the lagging strand that block chromatin assembly. The resolution of G-quadruplexes could involve the Bloom syndrome RecQ helicase (BLM) or the PIF1 helicase to initiate repair of the fork by homology directed repair (HDR) . Gaps or lesions in chromatin may subsequently be filled away from the fork outside of S-phase by histone H3.3 histone chaperones like Histone Regulator A (HIRA) and/or the ATRX-DAXX-H3.3 complex . The depletion of ASF1 coincides with the repression of telomerase and a switch from telomerase mediated telomere elongation to telomere maintenance by ALT associated recombination.

Inducing ALT by disruption of histone transfer

Нуклеосомы представляют собой препятствия, которые необходимо преодолеть, чтобы гарантировать прохождение репликационной вилки. Паралоги anti-silencing function 1, ASF1a и ASF1b, являются шаперонами гистоновых димеров H3.1/H3.3-H4, которые играют жизненно важную роль в этом процессе. ASF1a и ASF1b, по-видимому, возникают в результате дупликации и последующего изменения функции родоначального ASF1 гена [93]. Соотв., ASF1a и ASF1b обладают отличающимися геномными свойствами и паттернами генной экспрессии, а также предпочтительными взаимодействиями с белками [93]. В то время как ASF1b может переносить H3-H4 димеры на комплекс chromatin assembly factor 1 (CAF1) во время репликации ДНК посредством взаимодействия с p60 субъединицей, ASF1a может избирательно взаимодействовать с главным независимым от репликации шапероном гистона H3.3-H4, histone regulator A (HIRA) [93]. Следовательно, ASF1 в качестве гистоновых шаперонов играют важную роль, которая влияет на сборку хроматина как во время репликации, так и помимо её. В самом деле, совместное истощение обоих паралогов ASF1 приводит к дефектам прогрессии вилки [94]. В этом примере, ASF1 непосредственно соприкасаются с mini-chromosome maintenance 2-7 (MCM2-7) репликативной геликазой, чтобы получить димеры гистонов H3-H4 и преобразовать их затем позади репликационной вилки, где они инкорпорируются в нуклеосомы возникающих вновь нитей ДНК, вообще-то с помощью CAF1 комплекса [94], хотя формально это ещё не продемонстрировано. Одновременно, ASF1 переносит вновь синтезированные гистоновые димеры H3-H4 для включения их в хроматин посредством proliferation nuclear antigen (PCNA)-ассоциированного CAF1 [95] (Figure 3C). В случае репликативного стресса, ASF1 регулирует небольшие резервуары гистонов, которые секвестрированы для сборки хроматина, как только репликационная вилка будет исправлена и повторно инициирована [96]. Те новые гистоновые димеры, которые переносят ASF1 для отложения de novo посредством CAF1, содержат модификации гистонов, такие как H3K9me1, и ацетилирование гистонов как H4K5, так и H4K12 [97] (Figure 3C). Следовательно, ASF1 играет также роль в сохранении пост-трансляционных модификаций гистонов. В отсутствии ASF1, структурная целостность хроматина оказывается под угрозой и в принципе жизненно важная эпигенетическая информация может быть потеряна, это будет оказывать влияние на функцию хроматина и за счет расширения на клеточную судьбу.

В соответствии с нарушениями сборки хроматина, совместное истощение ASF1 паралогов, ASF1a и ASF1b, в человеческих иммортализованных позитивных по теломеразе клетках и в нормальных диплоидных фибробластах, могут фундаментально изменять теломеры и приводить к активации пути ALT [32]. Это открытие характеризует первый опубликованный случай прямой индукции ALT в клетках человека. Более того, эта индукция происходит быстро - в течение 3-х дней после нокдауна и сильно ограничена клетками с длинными теломерами. Это вряд ли связано с ограничением чувствительности методов, использованных для детекции ALT, поскольку методы, такие как C-circle assay, по-видимому, исключительно чувствительны к присутствию ALT [98]. Скорее свойства, которые делают теломеры ломкими сайтами репликации ДНК и сборки хроматина могут быть смешанными и усиливаются в присутствии длинных теломер. Кроме того, длинные теломеры могут обнаруживать склонность к увеличению частоты внутри- и межтеломерных ассоциаций. Это подразумевает, что вероятность рекомбинации или ALT индукции, увеличивается, как только появляются дефекты запуска. Мы полагаем, что отсутствие связи со сборкой хроматина после репликации ДНК в отсутствие ASF1 приводит к истощению родительских гистонов. На коротком расстоянии резервы новых гистонов, которые регулируются с помощью гистонового шаперона NASP [99], д. быть адекватными для восстановления хроматина. Однако на более значительном расстоянии, таком как в случае длинных теломер, эта способность оказывается под угрозой за счет ограничений поставки гистонов, означая, что потеря родительских гистонов становится проблематичной, приводит к продолжительному коллапсу вилки и теломерной рекомбинации. Повреждения хроматина, которые возникают, могут быть повторно репарированы, как только репликация ДНК завершится с помощью др. гистоновых шаперонов, подобных HIRA и даже ATRX, как способ поддержания геномной целостности и распространения измененного эпигенетического ландшафта га теломеры, которые в этом случае используют индукцию ALT (Figure 3D).

Фенотипы индукции ALT возникают в ответ на репликативный стресс, обусловленный нокдауном ASF1, они были получены путем супрессии некоторых отличительных особенностей ALT (ECTR и APBs) после подавления intra-S-phase checkpoint киназы, ataxia telangiectasia and Rad3-related protein (ATR). Интересно, что они были также супрессированы путем нокдауна Bloom syndrome (BLM) RecQ геликазы [32], это важно поскольку подавление BLM может представлять потенциальный терапевтический путь для избирательных мишеней ALT раковых клеток [100]. Механизм может быть связан с BLM-обусловленным устранением G-quadruplexes, которые формируют треки одной нити ДНК на или позади вилки, это предоставляет субстрат для HDR [32]. Однако, PIF1 геликаза, по-видимому, является основным фактором, участвующим в устранении G-quadruplexes [101]. Альтернативно, BLM быть апикальным фактором в процессинге свободных концов ДНК в процессе, который может участвовать в репарации путем регрессии вилки [32]. В любом случае дальнейшее выяснение ALT индукции в этом контексте заслуживает внимания.

Вообще-то наиболее интригующим аспектом истощения ASF1 и индукции ALT является совместная репрессия экспрессии гена hTERT и почти полного прекращения каталитической активности hTERT. Как это происходит, неясно, но это может быть связано с противовоспалительной транскрипционной программой, которая активируется после нокдауна ASF1 [32]. Поскольку активность ALT не сохраняется, как только уровни ASF1 возвращаются к норме, этот противовоспалительный механизм может быть модулирован, чтобы поддерживать ALT фенотипы и активность в клеточных линиях. Это может быть важным in vivo для ALT опухолей, поскольку цитокины и паракринные противовоспалительные факторы могут участвовать в становлении опухолевых микроусловий, которые часто являются признаками рака. Это подразумевает кратковременную эпигенетическую дисфункцию в качестве источника геномной нестабильности, который запускает сложные перестройки, характерные для раков. Был также предположен механизм, с помощью которого диктуется выбор пути поддержания теломер.

Вопрос причинной связи между нарушением регуляции ASF1 и ALT остается неизвестным. Скорее всего, что ASF1a или ASF1b делетированы в ALT опухолях. Скорее всего, ASF1b, по-видимому, избыточно экспрессируется в некоторых раковых опухолях ([102], TCGA база данных). Альтернативно ASF1a сцеплен с индукцией старения [103], и тогда нарушение регуляции или делеция экспрессии ASF1a может снижать клеточную способность постоянно выходить из клеточного цикла. Кроме того, не стоит сбрасывать со счетов, что после истощения ASF1 др., пока неизвестные функции ASF1 или паттерны связывания могут быть затронуты, и это может предопределить клеточный исход. Наконец, поскольку гистоновые шапероны обладают конкурентным связыванием гистоновых субстратов [104], то возможно, что нарушение функции ATRX/DAXX в ALT опухолях будет приводить к активации дополнительных функций с помощью ASF1. Тем не менее, поскольку активация ALT является редким событием, то способность индуцировать ALT посредством истощения ASF1 может быть значительным полезным свойством для систематической идентификации факторов, которые управляют индукцией ALT и регулируют поддержание ALT.

Concluding remarks

We have discussed recent developments in the area of ALT telomere biology and the new interest in the relationship between chromatin dysfunction and the activation of ALT. It is becoming clearer that telomere function is particularly sensitive to changes in chromatin structure and post-translational histone modifications. Although many unresolved issues remain (Box 2), the complementation of innovative proteomic and molecular biology tools with new cellular imaging technologies will undoubtedly provide the requisite answers. For example, the application of CRISPR technology now allows site-specific targeting of proteins to genomic loci and telomeres are particularly amenable for this [105]. It will be interesting to see whether chromatin modifiers can be targeted to alter telomeric chromatin in a way that brings about ALT or directly suppresses it. Future studies will undoubtedly be challenging, but a greater understanding of telomere maintenance by ALT in cancer will be of immense value for efforts seeking to develop both anti-ALT and anti-telomerase based cancer therapies.

Assembly of telomeric chromatin to create ALTernative endings Roderick J. O'Sullivan, Genevieve Almouzni Trend in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 675-685

Assembly of telomeric chromatin to create ALTernative endings
Roderick J. O'Sullivan, Genevieve Almouzni
Trend in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 675-685