Реснички являются "антенной", обеспечивающей трансдукцию внешнесредовых сигналов на внутриклеточные пути. Реснички играют интегральную роль во многих клеточных функциях, включая передачу онтогенетических сигналов, нарушения симметрии, межклеточную адгезию, контроль клеточного цикла, реакцию на стрессы и реакцию на повреждения ДНК (e.g., [1]-[6]). Большинство ресничек обладают общим набором эволюционно закрепленных признаков: реснички поддерживаются с помощью базирующейся на микротрубочках основы, аксонемы; они строятся с помощью внутрижгутикового транспорта (IFT), микротрубочковые моторы управляют системой транспорта грузов [7]; и могут быть подразделены структурно и функционально на разные компартменты. Эти компартменты включают микротубулярный триплет базального тельца, который укореняет ресничку в клетке, переходную зону (TZ) микротубулярных дублетов, которая которая закрепляет ресничку на мембране, и стержень реснички с дублетами, где происходит IFT. Базальное тельце и TZ также действуют как избирательные фильтры при возвращении и отправлении груза реснички, функционирующие посредством физического закрытия и механизмов распознавания специфических грузов [7]-[9]. Стержень реснички традиционно рассматривается как недифференцированное целоеe [10], хотя недавние доказательства пролили свет на подразделение стержня реснички [11].

Inversin/Nephrocystin-2 специфически располагаются в компартменте Inversin compartment (InvC), в проксимальной порции стержня реснички по соседству с TZ [12]. Этот регион, как полагают, играет роль в трансдукции и умножении сигналов [13]-[15], расположении реснички и в цилиогенезе [16], [17]. Продукты нескольких генов - включая INVS/NPHP2, NPHP3, NEK8/NPHP9 и ANKS6/NPHP16 - располагаются в InvC. Взаимодействия между генами InvC и др. генами реснички лишь недавно начали исследовать и не обнаруживается хорошей генерализации между животными и клеточными моделями [18]-[22].

Механизмы, которые первоначально устанавливают InvC сегодня неизвестны, хотя пути доставки для некоторых компонентов InvC известны. Работы на моделях позвоночных пролили свет на специфическое для InvC специфическое взаимодействие комплекса, состоящего из Inversin, Nek8, Nphp3 и Anks6[23]-[25]. Nek8, Nphp3 и Anks6 локализуются в InvC зависимым от Inversin способом, но сам Inversin локализуется независимо от др. белков [23], [24]. Unc119b - возможно, хотя не подтверждено, является компонентом InvC - может обеспечивать путь доставки InvC. В клетках млекопитающих, Unc119b связывает myristoylated грузы, включая Nphp3 и транспортирует его в ресничку. Как только Unc119b-Nphp3 комплекс транслоцируется в ресничку, то малая GTPase Arl3 заставляет Unc119b освободить связанный груз [26]. Др. компоненты InvC, иные, чем Nphp3, пока неизвестно, myristoylated ли они и переносятся ли посредством Unc119b, указывая на дополнительные пути поставки в InvC. Необходим ли Unc119b для локализации Inversin и как Unc119b сам доставляется в проксимальную часть реснички, неизвестно.

Нематода Caenorhabditis elegans хорошо изученная модель биологии ресничек [27]. C. elegans обладает нервной системой с ресничками [28]-[31] которая в первую очередь используется круглыми червями для детекции внутренних и внешних стимулов и сигналов. Реснички с Amphid каналом в голове и флазмидные реснички в хвосте подвергаются воздействию и ощущают внешние окружающие условия посредством кутикулярных пор [32], [33]. В отличие от большинства первичных ресничек у млекопитающих ствол реснички C. elegans с amphid каналом и флазмидных ресничек подразделяется на два региона: проксимальный регион с дублетами микротрубочек, соединяющийся с TZ, и дистальный регион, базирующийся на микротубулярных синглетах, который простирается от региона дублетов [32], [33]. Т.к. и дублетный регион ресничек C. elegans и InvC первичных ресничек млекопитающих расположены на проксимальном конце реснички, непосредственно соединенным с TZ в основании реснички, и составляет лишь часть длины ствола реснички, предыдущие работы рассматривали их как композиционно, так и функционально сходными [13], [17], [34]. Взаимоотношение между InvC млекопитающих и регионом дублетов C. elegans ресничек не были достаточно охарактеризованы; здесь мы представили доказательства, что InvC и регион дублетов является отличающимися, но перекрывающимися регионами ресничек.

Геном C. elegans кодирует ортологи некоторых из белков, ассоциированных с InvC, включая сам Inversin (NPHP-2), Unc119b (UNC-119), Arl3 (ARL-3) и возможно Nek8 (не охарактеризованная пара паралогов NEKL-1 и NEKL-2), но, скорее всего, не Nphp3 или Anks6. Из них NPHP-2 и ARL-3, как было установлено ранее, являются локализующими область дублетов у C. elegans [17], [35]. C. elegans также обладает некоторыми белками, обогащенными в области дублетов, которые не ограничены InvC первичных ресничек млекопитающих; сюда входят kinesin-II IFT мотор KLP-11 и ассоциированная с мембраной малая GTPase ARL-13 [35]. Моторы IFT Kinesin-II и OSM-3 работают кооперативно, чтобы осуществлять IFT ансамбли из IFT-A и IFT-B и строить регион дублетов - OSM-3 в отдельности достаточен для построения региона синглетов [36]. ARL-13, скорее всего, стабилизирует взаимодействие между IFT-A и IFT-B частицами и необходим для ультраструктурной целостности региона дублетов [35], [37]. Мутанты arl-13 обладают множественными дефектами ресничек, некоторые из которых могут быть супрессированы делецией гистоновой деацетилазы hdac-6, посредством неизвестного механизма [35]. HDAC6 млекопитающих также противодействует цилиогенезу в первичных ресничках млекопитающих: HDAC6 нокауты могут супрессировать дефекты цилиогенеза, возникающие в результате INVS/NPHP2 RNAi в клетках MDCK [16].

В данной работе мы попытались молекулярно рассечь проксимальную часть реснички C. elegans и получить информацию о природе InvC и региона дублетов. Мы исследовали взаимодействия между генами, ассоциированными с регионом дублетов, определить территории и взаимозависимость локализации белковых продуктов этих генов и осуществить ультраструктурный анализ делеционных мутантов этих генов. Мы установили, что InvC законсервирован у C. elegans, он формируется в раннем развитии и отличается от региона дублетов. Nphp-2 взаимодействует с генами региона дублетов, чтобы регулировать размещение реснички, ультраструктурный паттерн микротрубочек, tubulin glutamylation и территориальные размеры NPHP-2 и ARL-13. Наконец, мы показали, что nphp-2, arl-13, klp-11 и unc-119 распадаются на два параллельных перекрывающихся генетических модуля и что взаимодействия между двумя модулями модулируются с помощью hdac-6 и arl-3.

Discussion

В данном исследовании мы предоставили доказательства (1) C. elegans обладает законсервированным InvC компартментом, (2) взаимодействия между nphp-2 и arl-13 регулируют формирование ультраструктурного паттерна, (3) размер InvC и региона дублетов различаются и генетически регулируются, (4) hdac-6 и arl-3 модулируют взаимодействия между nphp-2, arl-13, klp-11 и unc-119, (5) и что глютамилирование микротрубочек стоит ниже действия генов InvC и региона дублетов. Кроме того, мы установили, что гены, ассоциированные в проксимальной частью реснички (TZ, InvC и регионом дублетов) могут быть сгруппированы в параллельные генетические модули, которые взаимодействуют, чтобы управлять закреплением ресничек и собственно цилиогенезом. Наконец, мы предложили несколько возможных механизмов для целенаправленной доставки и ограничения в InvC NPHP-2.

Limitations of overexpression reporter constructs

В последние 20 лет белки для флуоресцентного мечения делают возможным получение информации по локализации in vivo и механизмам транспорта. Однако преимущественными методами внесения трансгенов в C. elegans, являются микроинъекции, дающие внехромосомные массивы, содержащие множественные копии репортерной конструкции [53]. Многие аспекты цилиогенеза тонко регулируются и многие нуждаются в стехиометрических количествах компонентов ждя соотв. функции. Ранее мы показали, что избыточная экспрессия белков может приводить к дефектам цилиогенеза и IFT, приводя к фенотипу SynDyf [17], [54].

Мы искали, как минимизировать эти эффекты на наши заключения, избегая прямых сравнений между множественными репортерами и используя одновременное мечение антителами. Необходимы сравнения на генетическом фоне в норме и у мутантов. На этих фонах мы тестировали все конструкции для получения доминантных дефектов цилиогенеза (S1 Table). На соотв. мутантном фоне, мы обычно тестировали возможность устранения мутантного фенотипа, это бы указало, что репортер функционален (Fig. 4A) [17], [29], [50], [54]-[57]. Напр., локализация NPHP-2: GFP сходна на фоне дикого типа и на мутантном фоне nphp-2 и устраняет фенотип nphp-2 nphp-4 SynDyf (Fig. 4B) [17]. Следовательно, можно заключить, что NPHP-2: GFP обеспечивает и аккуратное и функциональное отражение паттерна эндогенной локализации.

Использование ARL-13: GFP хорошо представлено в литературе, при этом 5 работ проверяли локализацию ARL-13::GFP в amphid и phasmid ресничках [34], [35], [37], [58], [59], а 6-я работа исследовала локализацию ARL-13::GFP AFD ресничках [60]. В двух работах ARL-13::GFP конструкция была той же самой, что была использована в нашей работе [35], [59]. Более того, этот ARL-13::GFP репортер функционален [35] и обнаруживает сходную локализацию на фоне дикого типа и у мутантов arl-13 (Jinghua Hu, personal communication). В трех работах ARL-13::GFP репортеры были использованы для определения локализации внутри реснички ARL-13::GFP [34], [59], [60]. Кроме того, ARL-13::GFP трансгенные линии использовали в работах лаб. Hu and Blacque, где они были получены независимо и обнаруживали сходную локализацию.

В будущем геномная инженерия (напр., CRISPR) позволит легко нагружать одиночной копией флуоресцентной метки белки и анализировать in vivo [61]. Эти техники не панацея, т.к. некоторые гены, включая nphp-2, могут экспрессироваться на очень низком уровне для мечение одиночной меткой без подходящей микроскопической техники (personal communication, Knudra Transgenics).

The nature of the doublet region

Регион дублетов у C. elegans и проксимальная частьl InvC у млекопитающих считаются аналогичными [11], [13], [17], [34], [37]. У C. elegans, ряд факторов ассоциирует с регионом дублетов, включая NPHP-2, ARL-13, UNC-119, ARL-3, HDAC-6, the Kinesin-II components KAP-1/KLP-11/KLP-20 [35]-[37] и glutamylated tubulin [50]. Однако, ортологи большинства белков из региона дублетов C. elegans локализуются вдоль всей реснички[26], [62]-[71]; это вызывает сомнение об эквивалентности между регионом дублетов C. elegans и InvC млекопитающих. Скорее всего, что регион дублетов у C. elegans аналогичен всему стволу реснички, базирующемуся на дублетах у млекопитающих, а InvC млекопитающих аналогичен C. elegans InvC (modelled in Fig. 9).

Figure 9. Model of the composition of the proximal cilium. ARL-13 is depicted as membrane associated based on published characterizations [37]. NPHP-2 is depicted as membrane associated based on the membrane association of Inversin in mammalian primary cilia, and because in C. elegans NPHP-2 reporters appear membrane associated by casual observation [12], [17]. Kinesin-II is microtubule associated, and UNC-119 is depicted nonspecifically because of the diffuse localization of GFP::UNC-119. Poly-glutamylated tubulin is depicted as a modification of the B-tubule, as reported [45].

NPHP-2 localization requires an EF-hand

Передача сигналов кальция играет критическую роль в сигнальной трансдукции и функции ресничек [72], [73]; реснички содержат высокие концентрации кальция и многие TZ обладают доменами связывания кальция [74]. NPHP-2 гомолог у позвоночных Inversin имеет два calmodulin-связывающих IQ домена [75], [76], один из которых необходим для собственно локализации [12]. Calmodulin управляет внутриклеточными концентрациями кальция посредством calcium-binding EF-hand. Хотя C. eleganss NPHP-2 не кодирует предполагаемый IQ домен он обладает EF-hand. Этот EF-hand необходим для локализации и функции NPHP-2 в amphid и phasmid ресничках, подобно IQ2 домену в Inversin. Существуют достоверные отличия между EF-hand в NPHP-2 и IQ2 доменом в Inversin: делеция EF-hand из NPHP-2 приводит к полному отсутствию локализации ресничек, тогда как делеция домена IQ2 в Inversin приводит к неправильной локализации Inversin по всей ресничке. В обеих системах, Inversin/NPHP-2 не располагаются более в InvC. Это указывает на то, что детекция и связывание Ca²⁺, и последующая гипотетическая модуляция активности Inversin/NPHP-2 являются критическим, консервативным свойством белка. Возникают две возможности функционирования этих доменов: Ca²⁺ специфицирует локализацию NPHP-2, модулирует активность белка, или обе.

UNC-119 is a proximal ciliary protein

Мы установили, что UNC-119 располагается в проксимальной части реснички и исключен из дистального региона. GFP::UNC-119 и одновременное мечение GT335 показало, что GFP::UNC-119 исключен из TZ, т.к. микротрубочки TZ не glutamylated (см. Fig. 8, одновременное мечение GT335 с TZ-исключенными ARL-13::GFP и NPHP-2::GFP). У C. elegans, UNC-119 метит более короткую часть реснички, чем ARL-13 или GT335, маркеры, ассоциированные с регионом дублетов. Кроме того, Unc119b млекопитающих физически взаимодействует с компонентом InvC Nphp3 и проксимально ограничивается в ресничках клеток RPE, подтверждая, что Unc119b ассоциирует с InvC [26]. Однако, GFP::UNC-119 маркирует более значительную порцию реснички, чем NPHP-2::GFP.

Генном C. elegans кодирует гомологи многих из многих Unc119b челночных белков, включая Unc119b, Arl3 и RP2, и два myristoylated белка ресничек, необходимых для локализации в ресничке unc-119 [77]. arl-3 генетически взаимодействует с unc-119 и nphp-2, подтверждая, что у C. elegans компоненты челноков на месте. Эти компоненты челноков, по-видимому, не нужны для локализации NPHP-2, т.к. NPHP-2 импортирует в ресничку unc-119 и arl-3 у мутантов. У unc-119 мутантов NPHP-2 обнаруживает уникальный паттерн локализации в дистальных частях дендритов, который не может быть объяснен утечкой из TZ; неизвестно, представляет ли это популяцию NPHP-2, которая собственно не была импортирована в ресничку или доставленные неправильно NPHP-2.

The function of hdac-6

Как в системах млекопитающих, так и у C. elegans, Hdac6/hdac-6 действуют как антагонисты цилиогенеза и стабильности ресничек [16], [62]. В первичных ресничках млекопитающих, Hdac6 действует как α-tubulin K40 deacetylase, регулируя функцию и стабильность микротрубочек [62], [78]-[81]. Геном C. elegans кодирует одиночный α-tubulin со способным к ацетилированию остатком K40, MEC-12. Однако нет прямых доказательств, что экспрессия mec-12 в amphid и phasmid нейронах и что anti-α-tubulin-K40 антитела 6-11b-1 не метят amphid и phasmid реснички у животных дикого типа или мутантов hdac-6 (S10 Figure) [82]. Могут существовать альтернативные сайты ацетилирования тубулина, включая β-tubulin [83]; hdac-6 может деацетилировать эти вторичные сайты. NPHP-2 содержит предсказуемый N-терминальный сайт ацетилирования (на 2S), который может быть деацетилирован с помощью HDAC-6; это может модулировать связывание между NPHP-2 и его мишенями [84]. Кроме того, HDAC-6 может иметь и др. не идентифицированные мишени в ресничках [35]. Механизм детерминации, с помощью которого HDAC-6 действует как генетический модификатор генетических дефектов в InvC и регионе дублетов ещё предстоит выяснить.

Doublet region and InvC components modulate tubulin post-translational modification

Глютамилирование тубулина ассоциирует с проксимальными порциями микротрубочек B-трубочек в ресничках C. elegans, жгутиках сперматозоидов мышей и в жгутиках Chlamydomonas [47], [50], [85]. У C. elegans глютамилирование микротрубочек связано с ультраструктурой, стабильностью и поддержанием микротрубочек [50], [86]. Гены региона множественных дублетов регулируют глютамилирование микротрубочек, и мы наблюдали корреляцию между эктопическим глютамилированием и эктопическими дублетами микротрубочек. Кроме того, целенаправленная доставка белков региона дублетов не зависит от статуса глютамилирования. Следовательно, nphp-2, arl-13, hdac-6 и unc-119 функционируют выше глютамилирования микротрубочек, которое может позволять им осуществлять свое влияние на формирование паттерна микротрубочек, IFT, цилиогенез и в отношении unc-119 на биогенез региона синглетов. Эти пути могут быть законсервированы: у мутантных мышей Arl13b/hennin интенсивность глютамилировния микротрубочек ресничек снижено и микротрубочки B-трубок имеют ультраструктурные дефекты [38], [64].

Doublet region- and InvC-associated genes form genetic modules

У C. elegans, с TZ-ассоциированные гены, могут группироваться в два самостоятельные, частично перекрывающиеся генетические и физические модули [8], [17], [42]. Гены, ассоциированные с регионом дублетов и с InvC, могут быть сгруппированы сходным образом в nphp-2+klp-11 модуль и в arl-13+unc-119 модуль. Ген hdac-6, по-видимому, действует вне этих двух модулей, регулируя негативно оба: делеция hdac-6 у SynDyf двойных мутантов супрессирует фенотип SynDyf. В первичных ресничках млекопитающих, Hdac6 выполняет антагонистическую роль, дестабилизируя реснички посредством деацетилирования тубулина, пути, супрессируемого с помощью Inversin [16]. Ген arl-3 может действовать вне этих двух модулей зависимым от типа клеток образом; в phasmids он генетически взаимодействует с компонентами обоих модулей, но в amphids arl-3 взаимодействует гнетически только с arl-13+unc-119 модулем, но не с nphp-2+klp-11 модулем. В amphid ресничках, nphp-2 также не взаимодействует с сетью TZ SynDyf.

Странно, но существуют два др. генетических модуля организации между TZ генами и и генами InvC и региона дублетов. Двойные мутанты nphp-2 nphp-4, mks-3; nphp-2 и arl-13; nphp-4 вызывают серьёзные дефекты ресничек [17]. Делеция одного из TZ гена или из TZ модуля и одного гена из модуля региона дублетов дают фенотип SynDyf, хотя не все комбинации были проверены. TZ SynDyf сеть и сеть SynDyf из региона дублетов, как полагают, могут генетически взаимодействовать, давая "супер модули", состоящие каждый из трех подмодулей, описанных в этой и предыдущих работах [8], [17], [25], [42].

Origin of the Inversin Compartment

Локализация потребностей для множественных компонентов, локализации в InvC, определена ранее, но как InvC устанавливается изначально, неизвестно. i

У C. elegans InvC, скорее всего, устанавливается рано в развитии ресничек, поскольку NPHP-2 проксимально ограничивается в phasmid ресничек, начиная с первой личиночной ст. L1, непосредственно после вылупления (S9A Figure), и он неподвижен (S9B Figure), в отличие от динамической локализации, зависимой от личиночной стадии, ARL-13 [34]. Мы выявили несколько механизмов становления InvC. Ультраструктура реснички, по-видимому, не играет роли, т.к. у млекопитающих и C. elegans локализация Inversin/NPHP-2 ассоциирует только с частью региона дублетов, где отсутствуют распознаваемые ультраструктурные признаки [12]. Пост-трансляционные модификации тубулина также, по-видимому, не специфицируют InvC, т.к. nphp-2 (и генетически взаимодействующие компоненты региона дублетов) лежат выше путей глютамилирования. TZ, по-видимому, не играет существенной роли в спецификации InvC. NPHP-2 всё ещё расположен и ограничен проксимальной частью реснички у одиночных и двойных мутантов TZ. IFT является др. кандидатом на роль механизма, но мы обнаружили, что хотя компоненты IFT генетически взаимодействуют с генами, ассоциированными с InvC и регионом дублетов, Kinesin-II не нужен для локализации NPHP-2. В ресничках млекопитающих Unc119b челнок необходим для импорта в ресничку Nphp3; эта активность расположена выше действия Inversin в локализации Nphp3. В C. elegans phasmid ресничках, NPHP-2 не нуждается ни в unc-119 ни в его эффекторе arl-3 для импорта в ресничку или ограничения компартментом InvC (S2A Figure).

Остаются несколько механизмов для локализации InvC. Во-первых, кальций может играть роль. И Inversin, и NPHP-2 нуждаются в доменах связывания кальция для локализации InvC [12]; источник и природа сигналов кальция для этих доменов неизвестны. Во-вторых, InvC может быть также первоначально устанавливаться за счет диффузии факторов из основания реснички. В-третьих, существует возможность, что состав мембраны реснички может помогать определять InvC. Ресничка имеет отличающуюся композицию от плазматической мембраны и разные субрегионы реснички могут также обладать отличающимся составом мембраны.

Final summary

Мы полагаем, что логика становления компартмента NPHP-2/Inversin может быть одинаковой у C. elegans и млекопитающих, способом, не зависящим от ультраструктуры микротрубочек. Мы показали, что гены, ассоциированные с регионом дублетов и с InvC, взаимодействуют, чтобы направлять цилиогенез, размещение ресничек, ультраструктуру ресничек, белковый состав и пост-трансляционные модификации тубулина. Следующей задачей является определение, каков инициальный паттерн региона дублетов и InvC, и понять функцию этих регионов ресничек.

The nphp-2 and arl-13 Genetic Modules Interact to Regulate Ciliogenesis and Ciliary Microtubule Patterning in C. elegans • Simon R. F. Warburton-Pitt, • Malan Silva, • Ken C. Q. Nguyen, • David H. Hall, • Maureen M. Barr PLoS Genet 10(12): e1004866. doi:10.1371/journal.pgen.1004866

The nphp-2 and arl-13 Genetic Modules Interact to Regulate Ciliogenesis and Ciliary Microtubule Patterning in C. elegans
• Simon R. F. Warburton-Pitt, • Malan Silva, • Ken C. Q. Nguyen, • David H. Hall, • Maureen M. Barr
PLoS Genet 10(12): e1004866. doi:10.1371/journal.pgen.1004866