Посещений:
НАПРАВЛЕНИЕ НА ДЕГРАДАЦИЮ: ПРАВИЛО N-КОНЦА

Механизмы и функции

The eukaryotic N-end rule pathway: conserved mechanisms and diverse functions
Daniel J. Gibbs, Jaume Bacardit, Andreas Bachmair, Michael J. Holdsworth
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 10, October 2014, Pages 603–611

The N-end rule pathway of targeted proteolysis, which relates the stability of a protein to the nature of its N-terminus, has emerged as a key regulator of diverse processes in eukaryotes. Recent reports that N-terminally acetylated and methionine-initiating proteins can be targeted for degradation have uncovered novel branches of the pathway, and a wide range of protein substrates has now been identified in animals, fungi, and plants. Of particular interest is the finding that the N-end rule pathway mediates oxygen and nitric oxide (NO) sensing in plants and animals by controlling the stability of kingdom-specific substrates. These findings highlight how conserved degradation mechanisms of the N-end rule pathway underlie functional divergence throughout eukaryotes.


The N-end rule pathway of the ubiquitin proteasome system (UPS)


Регуляция оборота белков важна для контроля за клеточной реакцией и исходом развития. Соотв., целенаправленная деградация белка (протеолиз) выступает как фундаментальный механизм физиологической важности для всей природы. Целенаправленный протеолиз играет главную роль в контроле уровней регуляторных белков, а также в разрушении неправильно упакованных или поврежденных белков [1]. Ключевым свойством регулируемого протеолиза у эукариотических организмов является небольшой адаптерный белок ubiquitin, который будучи конъюгирован со специфическими лизиновыми (Lys) остатками в белках мишенях, образует полиубиквитиновые цепочки, которые могут действовать как сигнал для их деструкции с помощью состоящих из многих субъединиц 26S протеосомы, АТФ-зависимой протеазы 2 and 3. Этот строго нацеленный механизм деградации белков известен как UPS и является основным путем регулируемого протеолиза у эукариот 1, 2 and 4. Ферментативный каскад, контролирующий убиквитинирование белков, представлен E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating и E3 ubiquitin-ligase энзимами [3]. E3 лигазы обеспечивают специфичность этой системы, взаимодействуя с субстратом мишенью, инициируя полиубиквитинирование и тем самым маркируя их для деструкции с помощью протеосом.
E3 лигазы могут относиться к типам из одной или многих субъединиц (Figure 1) [4] , которые обеспечивают широкий круг онтогенетических и физиологических процессов у эукариот, от контроля за клеточным циклом и ходом мейоза до восприятия и трансдукции гормональных сигналов 4 and 5. Интересно, что растительный геном кодирует значительно большее количество компонентов UPS, чем др. царства, подтверждая, что целенаправленная деградация белков является сигнальным механизмом, обеспечивающим особо важную роль во время эволюции растений 5 and 6. Хотя многие работы были сфокусированы на E3s из одиночных и множественных субъединиц, которые взаимодействуют с субстратом посредством доменов межбелковых взаимодействий, существует др. класс E3 лигаз из одиночных субъединиц, N-recognins. Они действуют как компоненты уникальной и эволюционно более древней ветви UPS, известной как путь правила N-конца целенаправленного протеолиза (Figure 1). В противоположность остальным E3 типам лигаз, N-recognins метят субстраты для деструкции с помощью связывания с N-терминальной (Nt) аминокислотой каждого субстрата [7]. Субстраты для этого пути характеризуются присутствием сигнала деградации, наз. N-degron, который представлен дестабилизирующим Nt остатком, оптимально расположенным нижестоящим Lys (действующим как сайт убиквитинирования), и структурной конформацией, которая экспозирует N-конец белка. Взаимодействие между N-recognin и субстратом, обладающим N-degron осуществляется благодаря специфическим доменам распознавания в N-recognin, и приводит к полиубиквитинированию субстрата (Figure 1).

Figure 1. Functional comparison of different classes of E3 ubiquitin ligase. (A) Single-subunit RING and HECT E3 ligases directly interact with E2 ubiquitin-conjugating enzymes and target proteins to mediate substrate ubiquitination. (B) Multisubunit E3 ligases require the interaction of several proteins to facilitate ubiquitination. For example, in SCF E3 ligases, the F-box protein binds to the target and interacts with the scaffold protein cullin 1 via the adaptor protein SKP1. Cullin 1 associates with the RING protein RBX1, which recruits the E2 enzyme and leads to substrate ubiquitination. Interactions between E3 ligases and substrates in (A) and (B) are typically mediated by protein-protein interaction domains, such as armadillo or leucine-rich repeats, and may require a cofactor (such as a phytohormone) or specific modifications in the target protein (e.g., phosphorylation). (C) N-recognins are specialized single-subunit RING domain-containing E3 ligases that interact directly with E2 enzymes and protein substrates. In contrast to other E3 types, N-recognins function as part of the N-end rule pathway and bind to the N-terminal (Nt) residues of target proteins. Destabilizing Nt residues in N-end rule substrates are exposed by peptidase activity and may require enzymatic or chemical processing before interaction with the N-recognin. In all three cases the outcome is substrate polyubiquitination and degradation by the 26S proteasome. Abbreviations: ARM, armadillo repeats; CUL1, cullin 1, E2, ubiquitin conjugating enzyme; HECT, homologous to the E6AP carboxyl terminus; LRR, leucine-rich repeat; SCF, Skp, cullin, F-box containing complex; SKP1, S-phase kinase-associated protein 1; RBX1, RING box protein 1; RING, really interesting new gene/E3 ubiquitin ligase; Ub, ubiquitin; UBR, UBR (ubiquitin recognin) domain.

Путь N-end правила первоначально был открыт у Saccharomyces cerevisiae вследствие наблюдения, что химерные ubiquitin-β-galactosidase репортеры, которые экспозируют разные Nt аминокислоты после деубиквитинирования обнаруживают варьирующую стабильность in vivo 7 and 8. Это исследование привело к идентификации механизма, при котором период полу-жизни белка диктовался природой его N-конца (the 'N-end rule'), и Nt остатки были классифицированы как или стабилизирующие или дестабилизирующие (see next section and Figure 2) 7, 9 and 10. Интересно, что вариант пути правила N-конца существует также у прокариот, хотя меньшее количество остатков функционируют как дестабилизирующие остатки у бактерий [11]. Ubiquitin отсутствует у прокариот, а N-degron-несущие белки отбираются с помощью Clp (caseinolytic protease) S белка и доставляются на ClpAP протеазу для деградации [11]. Тем не менее, присутствие этого пути у бактерий характеризует правило N-как древний механизм для регулируемого протеолиза, который, по-видимому, был привлечен в UPS во время эволюции эукариот. Обзор концентрируется на успехах в понимании диапазона белковых Nt дестабилизирующих остатков и модификаций, а также в увеличении количества физиологических субстратов и процессов, контролируемых этим путем. Недавние исследования показали, что путь правила N-конца играет существенную роль в ощущении кислорода и NO. В свете этих находок мы обсудим появление этого пути как консервативного регулятора трансдукции газообразных сигналов у эукариот, который оперирует путем контроля специфичных для царств и процессов субстратов.

Figure 2. A general overview of the recently expanded Arg/and Ac/N-end rule pathways. (A) The eukaryotic Arg/N-end rule pathway recognizes protein substrates through their unacetylated N-terminal (Nt) residues. The general structure of the pathway is conserved across eukaryotes, although the number of individual enzymatic components does vary across species. Proteins are synthesized with Nt-Met, but new Nt residues can be exposed by peptidases. Particular Nt residues act as primary residues (type I basic residues in red, type II hydrophobic residues in green) and are bound and ubiquitinated by Arg/N-recognins before degradation by the 26S proteasome. Alternatively, the secondary residues Asp (D) or Glu (E) can be exposed, which are then arginylated by arginyl-tRNA transferases (ATEs) to produce primary Arg/N-degrons. Asn (N) and Gln (Q) are tertiary residues of the Arg/N-end rule pathway that must first be deamidated to Asp and Glu by Asn- or Gln-specific Nt amidases (NTAN/NTAQ). The Cys-division of the Arg/N-end rule pathway (blue box) is present in higher eukaryotes and has emerged as an important sensor of oxygen and nitric oxide (NO). Methionine aminopeptidases (MetAPs) or endopeptidases can expose the tertiary destabilizing residue Cys that can be oxidized by oxygen and NO to produce Cys-sulfinic or Cys-sulfonic acid (CysSO3H), which acts a secondary destabilizing residue due to its structural similarity to Asp (D). In plants, plant cysteine oxidase (PCO) enzymes can oxidize Nt-Cys using oxygen as a cofactor, but functionally conserved enzymes have not yet been identified in animals. The Cys-Arg/N-end rule pathway is absent from yeast, most likely due to the fact that yeast does not produce NO. Nt-Met has also recently been identified as a primary destabilizing residue of the Arg/N-end rule pathway when it is followed by a bulky hydrophobic residue (denoted by ?). (B) The Ac/N-end rule pathway of yeast recognizes specific Nt residues that have been acetylated (Ac) by Nt acetyltransferases (NATs). Nt residues that can be acetylated before recognition by Ac/N-recognins are shown in grey. Acetylated Met is targeted for degradation by the Ac/N-end rule when it is followed by a bulky hydrophobic residue (?), and thus Nt-Met-? can be selectively degraded by both the Arg/and Ac/N-end rule pathways depending on its acetylation status (its capacity to be regulated by both pathways is denoted by yellow). Single-letter amino acid codes are used to represent Nt residues.

Destabilizing N-termini and the Arg/N-end rule pathway


Зарождающиеся белки синтезируются с N-терминального метионина (Nt-Met), но пост-трансляционное расщепление белка с помощью пептидаз может давать новые Nt остатки [7]. Если второй остаток негромоздкий, то Nt-Met часто по ходу трансляции удаляется с помощью метионин аминопептидаз (MetAPs) [12]. Альтернативно, ряд эндопептидаз, включая caspases, calpains, separases и secretases, могут расщеплять белок внутренне 9,13-15. Если новая Nt аминокислота является преимущественно дестабилизирующим остатком, тогда белок непосредственно соединяется и убиквитинируется с помощью его соотв. N-recognin (Figure 2). Имеются два основных класса в первую очередь дестабилизирующих Nt остатков в 'классическом' эукариотическом пути правила N-конца: типа I основные остатки (arginine, Arg; lysine, Lys, histidine; His) и типа II гидрофобные остатки (tryptophan, Trp; phenylalanine, Phe; tyrosine, Tyr; leucine, Leu; isoleucine, Ile) [13]. У дрожжей оба типа распознаются и связываются с помощью дискретных распознающих доменов внутри одиночных N-recognin UBR1 (ubiquitin system recognition component 1), тогда как геномы млекопитающих кодируют несколько N-recognin изоформ (UBR1, 2, 4 и 5) 9, 13, 16 and 17. У растений идентифицированы два функционально консервативных, но структурно отличающихся N-recognins: PROTEOLYSIS (PRT)1 и PRT6, которые распознают типа II и I остатки (shown in green vs red in Figure 2A), соотв. 18-20. Т.о., растения распознают основные и гидрофобные остатки посредством отдельно кодируемых N-recognins, тогда как дрожжи и животные осуществляют это посредством дискретных сайтов связывания внутри одного и того же белка. Интересно, что путь правила N-конца прокариот касается в основном белков с гидрофобными Nt остатками, подтверждая, что типа I и типа II ветви пути правила N-конца могут быть филогенетически разделимы 7, 9 and 11. Недавно некоторые структуры N-recognins, соединяющиеся с субстратом, были выяснены, предоставив детальную молекулярную информацию о природе взаимодействий, которые возникают между доменами распознавания субстрата и N-концами белков мишеней 10,21 and 22.
В дополнение к преимущественно дестабилизирующим остаткам, как часть Arg ветви пути правила N-конца (Arg/N-end rule; Figure 2) существуют также вторичные и третичные дестабилизирующие остатки, которые дестабилизируются посредством серии зависимых от условий модификаций Nt перед распознаванием с помощью N-recognins 10 and 13. Эти модификации включают окисление цистеина (Cys) (у растений и животных, но не у дрожжей) или деаминирование аспарагина (Asn) или глютамина (Gln) с помощью Asn или Gln-специфичных Nt амидаз (NTAN/NTAQ), сопровождаемое Nt arginylation с помощью arginyl-tRNA transferases (ATEs) которая переносит Arg с Arg-tRNA на N-терминальную α-амино группой в Nt остатке 7, 9 and 13 (Figure 2). Работы на разных модельных видах показали, что структурные компоненты пути Arg/N-end правила (deamidases, ATEs и N-recognins) функционально законсервированы у эукариот, хотя сходство последовательностей и количества отдельно кодируемых компонентов варьирует между организмами 9, 13 and 16. Более того, классификация аминокислот как дестабилизирующих и стабилизирующих, в целом очень консервативна в этих царствах, за исключением Cys, который является стабилизирующим у дрожжей, благодаря тому факту, что его превращение во вторичный дестабилизирующий остаток требует NO, который, по-видимому, отсутствует у Saccharomyces cerevisiae 23 and 24.

The expanding range and diversity of Arg/N-end rule function and substrates


Благодаря природе пути правила N-конца, в особенности, благодаря взаимоотношениям между пептидазой и субстратом, идентификация субстратов в правиле N-конца является многообещающей. Однако, некоторые физиологические субстраты пути Arg/N-end правила теперь идентифицированы у животных, растений и грибов 7, 9 and 13. Они чрезвычайно разнообразны по структуре и функции и в противовес ферментативным компонентам пути, не являются, по-видимому, широко законсервированными между таксономическими группами. Напр., функционально не родственные белки regulator of G protein signaling (RGS) млекопитающих и специфическая для растений группа VII ethylene response factor (ERF) транскрипционных факторов являются хорошо охарактеризованными субстратами Cys ветви пути Arg/N-end правила 25-29 (Figure 2). Деструкция RGS и группы VII ERF белков требуют Nt-Met расщепления с помощью MetAPs, чтобы экспонировать Cys2 остаток, который затем действует как третичный дестабилизирующий остаток (Figure 2), связывает стабильность и функцию этих белков с доступностью кислорода и NO (discussed later). Помимо MetAP-зависимых мишеней, охарактеризовано несколько Arg/N-end rule субстратов, которые базируются на активности эндопептидаз, чтобы экспонировать дестабилизирующие остатки, включая у дрожжей субъединицу sister chromatid cohesion 1 (Scc1), которая регулирует стабильность хромосом [30], у Drosophila IAP1 (inhibitor of apoptosis 1) белок, важный регулятор апоптоза [31], белок животных USP1 (ubiquitin-specific protease), который регулирует геномную стабильность [32], а также большой набор calpain-генерируемых [15] и caspase-генерируемых натуральных белковых фрагментов [32] , обладающих дестабилизирующими Nt остатками и направляемыми на деградацию по пути правила Arg/N-конца. Путь правила N-конца оказался сцеплен с болезнями человека, включая синдром Johanson-Blizzard 33-35, и, как было установлено, регулируют продолжительность полу-жизни ключевых белков, ассоциированных с болезнью, таких как breast cancer-related tumor-suppressor gene BRCA1 [36] и Parkinson's disease-associated PINK1 (PTEN induced putative kinase 1) [37]. Интересно, что деградация PINK1 с помощью пути правила N-конца необходима для репрессии mitophagy, это вместе с недавними наблюдениями, что N-recognin UBR4 контролирует ткане-специфичную аутофагию во время развития желточного мешка млекопитающих [38], подтверждает, что путь N-end правила может играть двойную роль в регуляции массовой деградации с помощью лизосом и избирательной посредством UPS [39]. Помимо специфических регуляторных белков протеолиз, обеспечиваемый N-end правилом, как сегодня известно, контролирует деструкцию неправильно упакованных белков 40-44, также ка и белковых фрагментов, связанных с апоптозом [14], активностью calpain [15] и нейродегенеративными нарушениями [45].
Некоторые новые функции пути правила N-конца были недавно выявлены у грибов. FusariumN-recognin UBL1 (ubiquitin-ligase 1), как было установлено, позитивно регулирует патогенность кукурузы и пшеницы, подчеркивая консервативную роль пути в вирулентности грибов [46]. У Candida albicans, quorum-определяющая молекула farnesol, репрессор роста гифов, как было установлено, ингибирует UBR1-обеспечиваемую деградацию транскрипционного регулятора Cup9 (Cuprum [copper] resistance locus 9), который позитивно контролирует инициацию гифов [47]. Вместе с ранее идентифицированной ролью пути правила N-конца в качестве сенсора гема 48 and 49, кислорода и NO 23, 25, 27-29, это наблюдение указывает, что путь правила N-конца может участвовать в ощущении пока не идентифицированных малых сигнальных молекул.
В противоположность дрожжам и млекопитающим путь правила N-конца только недавно был исследован на растениях. Первоначальные исследования касались анализа мутантных Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) с нарушениями функции структурных компонентов пути правила Arg/N-end, таких как ATE (кодируемого у Arabidopsis двумя генами) и N-recognin PRT6. Эти исследования показали, что путь правила Arg/N-конца регулирует разнообразные онтогенетические процессы, включая прорастание семян и последующий разрыв oil body во время становления проростков [50], развитие цветоноса и листьев [51] и старение листьев [52]. Интересно, что хлоропласты, как было установлено, обладают функциональным путем N-end rule, который иногда сходен с таковым у прокариот 53 and 54. Более того, недавний глобальный анализ субстратов Arabidopsis metacaspase 9 (AtMC9) идентифицировал множество расщепленных пептидов, обладающих дестабилизирующими Nt остатками, показывая, что у растений правило N-конца также может регулировать уровни фрагментов белков, ассоциированных с активностью каспазы, как и у млекопитающих 14 and 55.

Nt acetylation and Nt-Met as novel signals for N-end rule-mediated substrate degradation


Ацетилирование Nt в основном необратимая модификация, которая обычно появляется одновременно с трансляцией у более чем 90% белков и обеспечивается за счет ассоциированных с рибосомами Nt-acetyltransferases (NATs), которые катализируют перенос ацетильных групп с acetyl-coenzyme A на Nt α-амино группу 56 and 57. Недавно идентифицирована новая ветвь пути правила N-конца, которая избирательно деградирует белки, обладающие Nt-ацетилированными остатками [58](Figure 2). Эта зависимая от ацетилирования ветвь пути правила N-конца обозначена как Ac/N-end правило её открытие породило исследования роли Cys как стабилизирующего Nt остатка у дрожжей. Было установлено, что хотя окисление Nt-Cys не происходит у дрожжей, его стабилизирующее влияние может быть также обусловлено сдерживанием используемой репортерной конструкции, особенно в отношении природы аминокислоты, которая непосредственно следует за Nt-Cys остаткомe [58]. Чтобы протестировать это предположение, осуществлен генетический скрининг с использованием искусственных репортеров N-end правила, начиная с остатков Nt-Cys-X- (где X любая из 20 природных аминокислот), это привело к открытию, что Nt-Cys может быть дестабилизирующим у дрожжей, если ему предшествует определенный набор аминокислот во второй позиции. Биохимический анализ установил, что Nt-Cys, ацетилированный с помощью NATs, когда сопровождается 'acetylation-permissive' аминокислотой и что эта модификация направляет эти белки на деградацию с помощью внедренной в endoplasmic reticulum (ER) трансмембранной E3 лигазы DOA10 (degradation of alpha 10) 56 and 58. Сегодня известно, что широкий круг Nt остатков (Met; alanine, Ala; valine, Val; serine, Ser; threonine, Thr), может направлять на деструкцию вследствие NAT-обеспечиваемого ацетилирования Nt и что помимо DOA10, вторая E3 лигаза, цитозольная NOT4 (negative regulator of transcription 4), также функционирует как 'Ac/N-recognin' у дрожжей (Figure 2) [56].
Было предположено, что многие, если не все, Nt-ацетилированные белки могут быть мишенями для обеспечиваемой с помощью Ac/N-end rule деструкции и что этот сигнал может вносить вклад в контроль качества белков (путем избирательной деструкции неправильно упакованных или поврежденных белков) и в регуляцию ввода стоихометрии субъединиц в гетеро-олигомерные белковые комплексы [56]. Чтобы протестировать последнюю гипотезу, два компонента субъединичных комплексов, несущих предполагаемые Ac/N-degrons, были проанализированы: COG1, субъединица законсервированная в олигомерном комплексе Гольджи и HCN1 (high copy suppressor for cut nine 1), субъединица anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) ubiquitin лигазы. Используя сложную 'subunit decoy technique', было показано, что оба эти белка являются условными субстратами для пути правила Ac/N-конца: будучи ассоциированными со своими соотв. мультисубъединичными белками партнерами, их N-концы оказываются защищены и тем самым белки оказываются стабилизированными, тогда как диссоциация комплекса или дисбаланс на уровне субъединиц экспонируют Ac/N-degron, что делает возможной деструкцию белка с помощью его соотв. Ac/N-recognin [56]. Это открытие выявило ранее не известную физиологически важную роль пути правила Ac/N-конца в регуляции субъединичной стоихометрии и деструкции неправильно упакованных и поврежденных белков, в которых Ac/N-degron не защищен.
NAT энзимы, которые катализируют ацетилирование Nt высоко консервативны у эукариот 59-61. Однако, роль этой модификации во время роста и развития плохо изучена [61]. Недавнее открытие пути правила Ac/N-конца, следовательно, идентифицировало новую и потенциально широко распространенную функцию для этих энзимов по контролю уровней клеточных белков. Гомологи Ac/N-recognins DOA10 и NOT4 имеются у многоклеточных животных и растений 62-64, и подобно механизму, зависимому от ацетилирования Nt, они д. поэтому существовать в этих двух разных группах для оборота белков. Дальнейшие исследования пути Ac/N-end rule у многоклеточных организмов д. пролить свет на консервацию и потенциалную функцию этих протеолитических путей у всех эукариоти.
Недавно было установлено, что не ацетилированный Nt-Met может также действовать как дестабилизирующий остаток, если он сопровождается соседством с массой гидрофобных остатков (Leu, Phe, Tyr, Trp or Ile, denoted by Φ), комбинация, которая возникает ~ 15% белков дрожжей и млекопитающих (Figure 2) [65]. Не ацетилированные Met-Φ-несущие субстраты распознаются с помощью тех же самых дрожжевых и животных N-recognins, которые распознают гидрофобные дестабилизирующие N-концы (UBR1 у дрожжей и UBR1 и 2 у мышей) [65], это существенно расширяет наши знания о диапазоне белков, которые могут быть деградированы посредством пути правила Arg/N-end. Некоторые физиологические Met-Φ-инициируемые субстраты N-end правила были идентифицированы и охарактеризованы, включая высоко консервативную Pre5 (Proteinase yscE 5) субъединицу из 20S протеосом и ассоциированную с Golgi цитозольную GTPase Arl3 (Arf-like 3) [65]. Белки с Met-Φ/N-degrons, как было показано, регулируются с помощью и Arg/ и Ac/N-end rule путей в зависимости от их статуса ацетилирования. Наблюдалось, что Ac-Met-Φ/N-degron содержащие белки, обнаруживают строгую ассоциацию со своими партнерами по комплексу, тогда как не ацетилированные белки склонны к быстрой диссоциации, приводящей к нестабильности комплекса [65]. Т.о., потенциально важная биологическая функция двойной доставки определенных субстратов с помощью обеих ветвей пути правила N-конца необходима, чтобы обеспечить ремоделирование белковых комплексов - др. словами, не ацетилированные белковые субъединицы диссоциируют и быстро деградируют и замещаются на Nt-ацетилированные белки, чтобы гарантировать поддержание стабильными и функциональными мультибелковых комплексов.
Эти недавние открытия существенно увеличили наше понимание взаимоотношений между N-концом белка и его периодом полу-жизни, и показали, что почти весь диапазон естественных аминокислот может функционировать как дестабилизирующие остатки в зависимости от контекста их последовательности и статуса модификации. Следовательно, возможно, что путь правила N-конца регулирует значительно большее количество белков, чем это предполагалось ранее и что регуляция посредством взаимодействия с любой ветвью пути правила N-конца сложна и функционально значима. Интересно, что недавнее сообщение идентифицировало ранее неизвестную роль N-recognin UBR1 в ER-associated protein degradation (ERAD) [66], протеолитическом пути для контроля за качеством белков, при котором Ac/N-recognin DOA10 также обнаруживает хорошо известную роль [64]. Вместе с наблюдением, что разные ubiquitin-activation/conjugation каскады могут взаимодействовать с N-recognins. чтобы обеспечить деструкцию пространственно отличающихся пулов того же самого субстрата [67], а находка, что пути N-end првила и ubiquitin fusion degradation (UFD) функционально взаимодействуют [68], делает ещё более ясным, что что имеются множественные уровни сложности при общении между разными ветвями UPS во время контроля стабильности регуляторных и неправильно упакованных белковых субстратов.

The Arg/N-end rule as a conserved system for oxygen and NO sensing in higher eukaryotes


Благодаря высоко реактивной природе Cys, его экспонирование на N-конце белка в не ацетилированном состоянии делает возможными S-nitrosylation и окисление, чтобы создасть Cys-sulfenic или Cys-sulfonic кислоту, которая направляется на arginylation с помощью ATEs, приводя к N-recognin-обеспечиваемому убиквитинированию [23]. Эта реакция, как полагают, является следствием структурного сходства между этими окисленными вариантами Cys и аспаратовой кислотой, вторичным дестабилизирующим остатком (Figure 2) [23]. Эта важная ступень окисления была первоначально идентифицирована у млекопитающих, где она, как было установлено, необходима для дестабилизации Met-Cys-инициирующих субстратов RGS4, RGS5 и RGS16, вследствие расщепления Nt-Met с помощью MetAPs 23 and 25. RGS белки, как было установлено, накапливаются в условиях гипоксии и в отсутствие NO, тогда Cys не окисляется 23, 25 and 69. Несколько работ исследовали физиологическое значение этой ступени окисления. Было показано, что обусловленная кислородом деградация белков RGS приводит к активации передачи сигналов G белков и к пролиферации клеток в кардиомиоцитах, тогда как уменьшение доступного кислорода (напр., в результате ограничения кровоснабжения) приводит к накоплению RGS и подавлению передачи сигналов G белков [26]. В подтверждение этой модели мышиные, ATE1-/- эмбрионы обнаруживают нарушения пролиферации кардиомиоцитов и передачи сигналов G белков, сопровождаемых эктопическим накопление RGS белков и нормальное развитие сердца может быть восстановлено у таких эмбрионов за счет эктопической экспрессии Gα q G белковой субъединицы [26]. Это наблюдение подтверждает, что N-end rule контролирует стабильность RGS, внося вклад в гомеостаз передачи сигналов G белка в ответ на доступность кислорода в циркулирующей крови. Было показано, что дестабилизация RGS4 может быть вызвана происходящим из эндотелия NO (produced by endothelial nitric oxide synthase; eNOS). чтобы скоординировать ангиогенез, способствуя росту кардиомиоцитов и гипертрофии сердца [70]. Этот детальный анализ показал, что RGS белки действуют как сенсор кислорода и NO посредством пути N-end rule, чтобы регулировать развитие сердечно-сосудистой системы у млекопитающих ( Figure 3).

Figure 3. Conserved oxygen- and NO-sensing mechanisms through kingdom-specific substrates of the N-end rule pathway in plants and mammals. Group VII ERFs (ethylene response factors) in plants and RGS (regulator of G protein signaling) proteins in mammals are functionally distinct, kingdom-specific proteins that act as sensors of oxygen and nitric oxide (NO) through the highly conserved Cys-Arg/N-end rule pathway. The Nt-Met of both sets of proteins is constitutively removed by methionine aminopeptidases (MetAPs) to expose Nt-Cys, a tertiary destabilizing residue. In the absence of either oxygen or NO, these proteins are stable and control a specific set of developmental responses. However, in the presence of both gases Nt-Cys is oxidized to produce the secondary residues Cys-sulfinic or Cys-sulfonic acid (CysSO3H). The predominant sources of NO that catalyze degradation via this pathway are nitrate reductases (NR) in plants and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in mammals, and in plants a group of plant cysteine oxidases (PCOs) can oxidize Nt-Cys using oxygen as a cofactor; it is currently unknown whether a similar oxidation enzyme functions in mammals. CysSO3H is arginylated by arginyl-tRNA transferases (ATEs) to produce a primary N-degron, which is bound and ubiquitinated by Arg/N-recognins before degradation by the 26S proteasome, leading to a different set of responses. Thus, conserved regulatory mechanisms underlie the function of these evolutionarily divergent proteins as sensors of oxygen and NO.

Недавно достигнут существенный успех в нашем понимании функции пути правила N-конца у растений в связи с передачей сигналов кислорода и NO. Гипоксия является состоянием, которое часто возникает у растений во время нормального развития вследствие вызываемого затоплением заболачивания или погружения в воду [71]. У животных HIF1α (hypoxia inducible factor 1α) транскрипционный фактор функционирует как ключевой сенсор гипоксии, чтобы регулировать транскрипционный ответ на низкий уровень кислорода [72]; однако, не существует ортолога HIF1α в царстве растений. Недавние исследования показали, что путь правила N-end является предпочтительным механизмом, который обеспечивает оценивание кислорода у растений 27 and 29. Анализ экспрессии генов у мутантов Arabidopsis Arg/N-end rule показал, что большая пропорция генов, чувствительных к гипоксии активируется эктопически в этих линиях 27 and 29. Эти альтерации экспресси и генов происходят как результат постоянной стабилизации группы VII ERF транскрипционных факторов, которые представляют собой первые идентифицированные физиологические субстраты пути правила N-конца у растений 27, 29 and 71. Подобно RGS белкам млекопитающих группа VII ERFs имеет Nt мотив, начинающийся с остатков Met-Cys and, и в нормотоксических условиях oxygen-replete, после отщепления Nt-Met они постоянно подвергаются превращениям и деградируют посредством пути правила N-конца 27, 29 and 71. Когда уровни кислорода снижаются, они накапливаются и способствуют транскрипции чувствительных к гипоксии генов 27 and 29 ( Figure 3). Мутирование Cys2 из группы членов VII ERFв Ala (стабилизирующий остаток) повышает стабильность белка и достаточно, чтобы модулировать долю выживших при гипоксии, подтверждая центральную роль этих белков в обеспечении гомеостатической реакции на гипоксию. По крайней мере, один член семейства VII ERF , RELATED TO APETALA (RAP)2.12, располагается на плазматической мембране в нормотоксических условиях, благодаря своему взаимодействию с локализованными в мембране Acyl-CoA binding proteins (ACBP1 и 2) [29]. Это закрепление на мембране может защищать специфический пул этих факторов от N-end rule-обеспечиваемой деградации в условиях нормотоксичности, подчеркивая потенциально новый механизм защиты N-degron за счет межбелковых взаимодействий.
Хотя важность окисления Cys перед arginylation была продемонстрирована in vitro неясно, возникает ли эта реакция спонтанно in vivo или она также нуждается в ферментативных компонентах 23 and 69. Недавнее исследование на растениях пролило свет на этот вопрос [73]. Анализ генома растений выявил консервативную группу белков, характеризующихся присутствием домена гомологии, общего с thiol-оксидазами, найденными в cysteine диоксигенезах животных. Показано, что эти plant cysteine oxidases (PCOs), которые представлены 5 генами у Arabidopsis, специфически окисляют Nt-Cys остатки, используя кислрод в качестве ко-субстрата [73]. Интересно, что гены двух этих PCOs, как было установлено, индуцируются гипоксией нацелены на группу VII ERFs, указывая тем, что окисление Cys перед arginylation у растений, по крайней мере, частично обусловлено ферментативной реакцией. Важно установить, влияют ли сходные ферментативные компоненты на путь Cys-Arg/N-end rule в др. царствах, поскольку PCOs ограничены геномами растений. Интересно отметить, что такое зависимое от ферментов окисление до некоторой степени аналогично зависимым от окисления модификациям HIF1α с помощью prolyl hydroxylases [72], подтверждая, что сравнимые ассоциированные с ферментами механизмы ощущения кислорода посредством различных протеолитических путей используются растениями и животными.
NO является важной внутриклеточной сигнальной молекулой у растений, регулируя широкий круг физиологических, онтогенетических и стрессовых реакций [74]. Хотя способность NO химически модифицировать специфичные для процессов белки и тем самым изменять их функцию хорошо известна у растений [75], до не давнего времени не был идентифицирован общий механизм, координирующий NO-реакции в ходе развития. Недавнее исследование на Arabidopsis показало, что мутанты пути правила Arg/N-конца нечувствительны к воздействию экзогенной NO в отношении некоторых ключевых процессов, регулируемых NO (включая alleviation of seed dormancy, inhibition of hypocotyl elongation и закрытие пор стом), демонстрируя, что функциональный путь правила N-конца необходим для нормальной реакции NO у растений [28]. Биохимический и генетический анализ выявил, что функция группы VII ERFs как сенсора NO посредством пути правила N-конца, чтобы координировать эти разные реакции и тем самым NO-обеспечиваемый оборот представляет собой первый пример общего молекулярного механизма для восприятия NO у растений, исходя из целенаправленной деградации белка [28]. Более того, группа VII ERFs, как было установлено, обеспечивает сигнальное взаимное общение между NO и стрессовым гормоном abscisic acid (ABA) [28]. Происхождение NO недостаточно известно у высших растений, поскольку они не содержат NOS ортологов [76]. Поэтому было бы интересно посмотреть у мутантных сеянцев Arabidopsis, дефицитных по активности nitrate reductase (единственный эндогенный источник NO), стабильность группы VII ERF. Существенно повышен HYPOXIA RESPONSIVE ERF (HRE)2, указывая на то, что продуцируемый nitrate reductase NO может быть преимущественным источником NO, участвующим в передаче сигналов [28]. Связанным с предыдущим открытием является то, что группа VII ERFs регулирует реакцию на гипоксию, эти находки идентифицируют такие специфичные для растений транскрипционные факторы как критические регуляторные ступицы (hubs) для восприятия и трансдукции газообразного сигнала посредством пути правила N-конца во время роста и развития.
Т.о. RGS млекопитающих и белки группы VII ERF растений выполняют двойную роль по восприятию кислорода и NO посредством пути правила Arg/N-конца, демонстрируя, что оперируют консервативные регуляторные механизмы у всех эукариот, чтобы контролировать специфичные для царств субстраты и процессы (Figure 3). Роль правила N-конца в восприятии этих двухатомных газов, по-видимому, выполняет более важную роль у растений, чем у современных известных животных. Интересно, что у животных роль пути правила N-конца в восприятии NO и кислорода может быть более важной, чем предполагалось.

The 'Met-Cys degradome': diversity is the spice of life?


Ключевое сходство между RGS и белками группы VII ERF, которое управляет их регуляцией с помощью пути правила N-конца является их Met-Cys N-окончание. MetAPs обладает эволюционно более законсервированной специфичностью к субстрату и расщепляет только Nt-Met, когда второй остаток не является многочисленным (non-bulky) [77]. Интересно, что Cys во второй позиции очень редко встречается у эукариот по сравнению с др. MetAP-пермиссивными остатками (Figure 4), обычно обнаруживается у менее чем 2% белков у большинства видов. Это наблюдение подтверждает, что Cys2 может иметь структурное или функциональное значение и сто это частично может быть связано с путем правила Arg/N-конца.

Figure 4. Diversity of the possible 'Met-Cys degradome' in eukaryotes. The presence of Cys at the second position is evolutionarily highly restricted compared to other methionine aminopeptidase (MetAP)-permissive second residues. Species are sorted by the NCBI taxonomy.

Законсервированная потребность в кислороде и NO для деградации Nt-Cys субстратов у растений и млекопитающих, кажется противоречащей разнообразии природы идентифицированных физиологических субстратов. Хотя Nt дестабилизирующие остатки единственные, нуждающиеся в N-degron, возможно, что др. Met-Cys белки также могут регулироваться с помощью пути правила N-конца и сравнение законсервированных Met-Cys белков при секвенировании геномов д. идентифицировать общую величину субфракции белков, которые могут функционировать как субстраты ( 'Met-Cys деградом'). Гены, кодирующие Met-Cys-инициирующие RGS и группы VII ERF субстраты, законсервированы у позвоночных и цветковых растений, соотв. Можно предположить, что RGS и группа VII ERF белков являются не только Met-Cys-инициирующими субстратами, а белки, которые сходным образом законсервированы, могут представлять новые субстраты. Т.о., сравнительный анализ предполагаемых Met-Cys деградомов в эволюционном контексте может привести к идентификации новых субстратов для правила N-конца и пролить свет на роль белков в восприятии NO и кислорода у эукариот.

Concluding remarks


It is becoming increasingly clear that the N-end rule pathway in all its different guises plays an extremely significant role in the control of protein stability in eukaryotes. Mainly due to the pioneering work of Varshavsky and colleagues, the scene is set for the discovery of a huge range of functional consequences of N-end rule regulation, including influences on enzyme and multiprotein complex homeostasis, hormone and second messenger signaling, and environmental and small-molecule sensing, to name a few. Some outstanding questions relating to the many recent papers in this research area are presented in Box 1. It is astonishing that the study of a pathway of such ancient origin continues to provide insight into tremendously diverse processes across eukaryotic kingdoms.