Развитие и функция многих тканей нуждается в координации клеточных характеристик в согласующемся направлении. Эта организация координат называется планарной клеточной полярностью (PCP). Большинство форм PCP регулируется с помощью двух консервативных путей: the Frizzled(Fz)/PCP и путь Fat (Ft)-Dachsous (Ds) PCP (rev. Axelrod, 2009; Goodrich and Strutt, 2011; Lawrence et al., 2007; Maung and Jenny, 2011; Thomas and Strutt, 2012). Ft и Ds являются крупными кадгеринами (Bryant et al., 1988; Clark et al., 1995;Mahoney et al., 1991), связывание которых регулируется с помощью киназы Four-jointed (Fj) (Brittle et al., 2010; Ishikawa et al., 2008; Simon et al., 2010). Ds и Fj экспрессируются в виде градиентов в глазах, регулируя активность Ft (Simon, 2004; Yang et al., 2002) (Fig. 1B). Ft, Ds и Fj также участвуют в регулирующем рост пути Hippo (rev. Grusche et al., 2010; Halder and Johnson, 2011; Lawrence et al., 2008; Staley and Irvine, 2012). Критическим вопросом является, как ориентация соседних клеток устанавливается и распространяется в ткани. Анализ клонов клеток, лишенных ft, ds или fj выявил, что мутантная ткань внутри клона и дикая ткань по соседству с клоном имеет измененную полярность (Casal et al., 2002;Casal et al., 2006; Fanto et al., 2003; Ma et al., 2003; Rawls et al., 2002; Strutt and Strutt, 2002; Yang et al., 2002). Реорганизация полярности в ткани дикого типа, наз. доминирование неавтономности (Krasnow et al., 1995; Vinson and Adler, 1987), может распространиться на несколько диаметров клеток, указывая, что путь Ft-Ds играет роль в передаче информации о полярности в ткани.
Недавнее исследование показало, что Ft, Ds и атипичный миозин Dachs (D) распределены асимметрично (Ambegaonkar et al., 2012; Bosveld et al., 2012; Brittle et al., 2012; Mao et al., 2006; Rogulja et al., 2008). Локализация D перераспределяется на несколько клеточных диаметров от границы экспрессии Ds или Fj (Ambegaonkar et al., 2012; Bosveld et al., 2012; Brittle et al., 2012; Mao et al., 2006; Mao et al., 2011). Эти данные вместе с предыдущими исследованиями привели к созданию модели, согласно которой информация о полярности распространяется от клетки к клетке за счет поляризованного распределения Ft и Ds, которое в свою очередь реорганизует Ft, Ds и D в соседних клетках (Casal et al., 2006; Ma et al., 2003; Matakatsu and Blair, 2006; Strutt and Strutt, 2002; Yang et al., 2002).
Альтернативная модель для объяснения распространения полярности от Ft- и Ds-экспрессирующих клеток предполагает, что связывание Ft-Ds ведет к продукции второго сигнала, который ответственен за распространение полярности. Находка, что цитоплазматический домен Ft соединяется с транскрипционным корепрессором Atrophin (Atro), привела к предположению, что этот второй сигнал транскрипционно регулируется с помощью активности Ft (Fanto et al., 2003). Потеря или ft или atro ведет к повышению экспрессии fj, указывая на потенциальный механизм регуляции PCP.
Мы решили, что количественный анализ нарушений полярности, вызываемых мутантными клонами
ft, ds и atro сможет предоставить информацию о механизмах, лежащих в основе распространения полярности и позволит нам сделать выбор между моделями. С помощью этого анализа мы показали, что асимметричная субклеточная локализация Ft и Ds не может объяснить распространение полярности в глазах
Drosophila. Далее мы показали, что цитоплазматические домены Ft и Ds могут генерировать сигнал, который может распространяться в ткани независимо от изменений в локализации Ft, Ds или D. Мы продемонстрировали, что atro регулирует полярность только в регионах вблиз экватора, указывая, что другие, пока неизветсные регуляторы полярности обеспечивают передачу сигналов Ft в полярных регионах. Мы показали, что потеря D не блокирует распространение дефектов полярности и что повышенная экспрессия fj не может объяснить нарушений полярности, вызываемых потерей ft или atro. Эти данные подтверждают модель, согласно которой дальнодействующее распространение полярности в Ft-Ds пути обеспечивается с помощью второго сигнала, регулируемого за счет взаимодействий Ft-Ds.
DISCUSSION
Ft и Ds могут регулировать субклеточную локализацию др. др., а изменения в их уровнях в клонах могут вызывать перераспределение вне границ клона (Ambegaonkar et al., 2012;Bosveld et al., 2012; Brittle et al., 2012; Ma et al., 2003; Matakatsu and Blair, 2004; Strutt and Strutt, 2002). Недавно было предположено, что каскад перераспределения может быть ответственен за дальнодействующее распространение полярности (Ambegaonkar et al., 2012; Brittle et al., 2012). Каскад перераспределения не может конечно возникнуть внутри ft или ds клонов, и пока мы наблюдали очень строгую реорганизацию полярности также внутри этих клонов. Это может возникнуть только, если дальнодействующая передача сигналов возникает посредством перераспределения иного, нежели Ft или Ds. Неожидано мы установили, что распротранение полярности осуществляется значительно дальше в отсутствие Ft или Ds, по сравнению с такнью дикого типа. В клонах ft и ds, восстановление или возникновение с противоположным может в некоторых случаях может распространятьсяна расстояние приблизительно в 4 ряда омматидий или ~ 40 клеточных диаметра вдоль DV оси. Увеличение ранга полярности делается обратным в отсутствие Ft или Ds, указывая тем самым, что обычное распределение Ft и Ds вне клона предоставляет сигнал, который противодействует и подавляет распространение полярности от края клона. Т.о., хотя обычное асимметричное распределение Ft и Ds д. играть роль в создании или ориентации сигнала полярности, это не обязательно для трансмиссии сигнала.
Неожиданным результатом стало то, что омматидии вдоль границы мутантного ft клона, который параллелен экватору с большей готовностью меняют ориентацию, чем те, что располагаются вдоль наклоненных границ. Какова основа подобных отличий? Мы полагаем, что это обусловлено разной степенью накопления Ft-Ds взаимодействий в параллельных и наклоненных границах. Внутри ft клона, Ds распределяется диффузно. На границе ft клона, все доступные Ds перераспределяются, чтобы соединиться с Ft в клетках дикого типа, соприкасающихся с клоном (Ma et al., 2003; Simon et al., 2010; Strutt and Strutt, 2002). В ft клонах, имеюшщих границу, которая распространяется на несколько клеточных диаметров вдоль AP оси, параллельно экватору, это вызывает перераспределение Ds только в один клеточный диаметр от границы вдоль DV оси. Хотя в наклоненных границах, напротив, перераспределение Ds рассеивается на DV и AP сторонах клеток, снижая степень накопления (Fig. 8).
Мы также проверяли эффекты экспрессии FtΔECD и DsΔECD на неавтономность полярности вне клонов. Мы наблюдали лишь легкие изменения в полярности после экспрессии FtΔECD. Однако мы обнаружили четкие эффекты на неавтономную полярность после клональной экспрессии DsΔECD. Неожиданно, это вызывало изменение полярности, качественно сходное с таковым при потере ds в клонах, подтвердив, что DsΔECD оказывает доминантно-негативный эффект на передачу сигналов полярности. Важно, что передача сигналов DsΔECD происходит Ft-зависимым способом как при потере нарушений экваториальной полярности в ft клонах. Поскольку отсутствует внеклеточный домен Ds в DsΔECD, то это указывает на то, что Ds ICD взаимодействует с Ft ICD в цис положении, чтобы регулировать неавтономное распространение полярности.
Почему ds ft вызывают смену полярности, которая являетсяслабой версией того, что вызывается ft клонами? Одиночные мутантные ft и ds клоны вызывают сильное накопление Ds или Ft, соотв., в мутантных клетках непосредственно внутри границы клона. В двойных мутантных клонах ds ft, однако, не должно происходить подобнго сильного накопления на границе (Fig. 8). Существует потеря сигнала только внутри клона, это вызывает более слабые нарушения полярности.
Почему пограничные эффекты в ft и ds клонах противоположны по своей ориентации? Мы полагаем, что Ft-Ds гетеродимеры формируются как в цис- (в одной и той же клетке) , так и в транс-положении (соседними клетками). В клетках дикого типа существуют цис и транс формы. Однако внутри ft клонов, хотя Ds белок в ft-/- клетках может соединяться с Ft соседних клеток, он не может формировать цис-гетеродимеры. Сходным образом, в ds клонах, хотя Ft может соединяться с Ds в соседних клетках, эта Ft молекула не может связать цитоплазматический домен Ds в цис-положении. Мы полагаем, что сигналы, продуцируемые после соединения Ft-Ds влияют на цис- и транс-взаимодействия. Эти различия в передаче сигналов цис и транс димерами д. приводить к дифференциальной регуляции оной и той же дальнодействующей сигнальной молекулы или к регуляции двух разных сигнальных молекул. Хотя Ft и Ds оба являются кадгеринами, они имеют очень отличающиеся цитоплазматические домены, указывая тем самым, что они могут передавть информацию о соединении разными способами.
Что стоит ниже передачи сигналов Ft-Ds? Внутриклеточный домен Ds, как известно, влияет на мишени пути Hippo в крыльях (Matakatsu and Blair, 2012), и необходим для получения пограничных сигналов, которые регулируют Hippo мишени в глазу (Willecke et al., 2008). Однако потеря генов пути Hippo не ведет к нарушениям неавтономной полрности в клонах (Blaumueller and Mlodzik, 2000; Harvey et al., 2003; Tapon et al., 2002; Udan et al., 2003; Wu et al., 2003). Хотя локализация D может изменяться в ответ на уровни Ds (Ambegaonkar et al., 2012; Brittle et al., 2012), мы установили, что d клоны не вызывают нарушений неавтономной полярности, а ft d мутантные клоны обнаруживают сходные нарушения полярности, что и клоны ft. Т.о., D не является компонентом распространения сигнала полярности в глазу.
Atro соединяется с Ft ICD и клоны atro качественно фенокопируют ft клоны (Fanto et al., 2003) (Fig. 6), подтверждая, что Atro может обеспечивать передачу сигналов полярности Ft-Ds. Потеря atro не ведет к изменениям в уровнях или локализации Ft или Ds (supplementary material Fig. S8), показывая, что atro не влияет на полярность путем изменения накопления Ft-Ds. Интересно, мы установили, что atro в основном функционирует вблизи экватора, т.к. потеря atro вблизи полюсов оказывает незначительный эффект. Это подтверждает, что atro функционирует ниже Ft и Ds вблизи экватора, при этом др. неустановленный регулятор полярности действует как эффектор Ft-Ds полярности вблизи полюсов.
Взаимодействия Ds, Ft и Fj активно изучали у Drosophila в брюшке, крыльях, глазах и личиночных зубчиках (Ambegaonkar et al., 2012; Bosveld et al., 2012; Brittle et al., 2012; Casal et al., 2002; Casal et al., 2006; Donoughe and DiNardo, 2011; Harumoto et al., 2010; Ma et al., 2003; Repiso et al., 2010; Simon, 2004; Strutt et al., 2004; Yang et al., 2002). Однако, эффекты потери fj на неавтономную полярность, вызываемые с помощью ft и ds клонов не были исследованы. Уровни fj изменялись в ft, ds и atro мутантных клонах (Fanto et al., 2003; Yang et al., 2002). Если изменения в уровнях fj были достаточными для изменения сигналов полярности на границах клонов ft, ds или atro, то фенотипы таких клонов должны быть слабее у fj-животных. Вместо этого мы обнаружили, что нарушения неавтономной полярности ft, ds или atro клонов усиливаются у fj-животных. Т.о., изменения в экспрессии fj не могут быть ответственны за их эффекты на неавтономную полярность. Усиление эффектов на полярность может быть объяснено в терминах убывания градиента устойчивой полярности в клетках дикого типа, окружающих клон, т.к. fj и ds устанавливают комплементарные и перекрывающиеся градиенты полярности в глазах (Simon, 2004; Zeidler et al., 1999). Потеря fj строго усиливает фенотип полярности Ft, Ds, а избыточная экспрессия Ds-ECD согласуется с этим заключением (Casal et al., 2006; Simon, 2004; Strutt et al., 2004).
Мутантные клоны ds, экспрессирующие atro-RNAi вызывают смену как на полюсах, так и на экваторе неавтономной полярности. Анализ фенотипов после нокдауна осложнен, но наблюдение смены полярности на обеих сторонах подтверждает некоторую параллельность функции между ds и atro. Анализ клонов ds , экспрессирующих fz-RNAi подтвердил сходные взаимоотношения между ds и fz.
Итак, мы наблюдали, что: (1) информация о полярности передается на большие (но не безграничные) расстояния внутри ft и ds клонов; и (2) размер клона не влияет на фенотип, но (3) форма клона влияет на генерацию PCP сигнала. Эти данные вместе с предыдущими наблюденияими изменений в локализации Ft и Ds на границах клонов (Ma et al., 2003; Matakatsu and Blair, 2004; Strutt and Strutt, 2002), подтверждают модель, согласно которой сигналы полярности от границ клонов действуют сочетанно с изменениями в передаче сигналов внутри мутантных клонов. Мы полагаем, что нормальная передача сигналов Ft-Ds действует в виде градиента из-за градированной экспрессии ds и fj, приводя в результате к градированной продукции дальнодействующего вторичного сигнала. Это создает устойчивый градиент информации полярности. Внутри ft и ds клонов, градиент информации полярности понижается или исчезает. Эти изменения усиливаются накоплением Ds или Ft на границах клонов. Возникающие в результате изменения во вторичном сигнале противоположны устойчивому (standing) градиенту в окружающей ткани дикого типа, что ведет к смене направления неавтономной полярности вне клона. Внутри клона в отсутствие устойчивого градиента в качестве оппозитного, аберрантный сигнал от границ клона ведет к сильной смене или восстановлению полярности.
Согласно нашим данным, строго подтверждающим существование дальнодействующего сигнала, но он пока не идентифицирован. Путь Fz/PCP сам по себе является очевидным кандидатом, но д. быть др. сигнальный путь или ещё неизвестный фактор. В отсутствии четкой механистической связи между Ft-Ds и Fz/PCP путями, или иежду этими путями и их нижестоящими эффекторами полярности, определение вторичного сигнала остается нерешенным вопросом.
Обширный структурно-функциональный анализ идентифицировал регионы внутриклеточного домена Ft, которые участвуют в регуляции PCP (Matakatsu and Blair, 2012; Pan et al., 2013). Однако эти работы исследовали полностью мутантные ткани. Необходимы дальнейшие исследования для выявления специфических регионов внутриклеточных доменов Ft и Ds, важных для регуляции дальнойдействующей передачи сигналов полярности.
Интересно понять, как одни и те же факторы, Ft, Ds и Fj, работают в направлении одной и той же цели, т.е. становления тканевой полярности, по-видимому, работают др. способами в др. контекстах (Casal et al., 2006; Matakatsu and Blair, 2012; Willecke et al., 2008). Напр., мы установили, что FtΔECD не восстанавливает эффекты полярности ft клонов в глазу, в отличие от крыльев и живота (Casal et al., 2006; Matakatsu and Blair, 2006; Matakatsu and Blair, 2012). Это указывает на то, что внеклеточный дломен Ft важен для регуляции полярности в глазу, вообще-то благодаря связыванию Ds. На животе, ds ft клоны не обнаруживают эффектов на полярность вне клонов, тогда как имеются четкие, хотя и ограниченные нарушения полярности вне ds ft клонов в глазу. Casal and co-workers полагают, что Ds и Ft оба необходимы клеткам для распространения Ft и Ds информации полярности на животе (Casal et al., 2006). Это может быть обусловлено тканеспецифическими отличиями в передаче сигналов.
Наши данные подтверждают модель передачи сигналов Ft-Ds в глазах Drosophila, причем разные уровни Ft и Ds ведут к модуляции дальнодействующих эффекторов полярности, которые управляют далее становлением полярности в глазу. Распространение этого сигнала не зависит от изменений в асимметричном распределении Ft и Ds. По крайней мере, частично в глазах этот процесс может быть опосредован с помощью трансдукции Ft-связанной информации в ядро с помощью Atro.
