Посещений:
ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ Wnt

Роль модуля R-spondin/Lgr5/Rnf43

The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module: regulator of Wnt signal strength
Wim de Lau, Weng Chuan Peng, Piet Gros и Hans Clevers
Genes & Dev. 2014. 28: 305-316

Lgr5 was originally discovered as a common Wnt target gene in adult intestinal crypts и colon cancer. It was subsequently identified as an exquisite marker of multiple Wnt-driven adult stem cell types. Lgr5 и its homologs, Lgr4 и Lgr6, constitute the receptors for R-spondins, potent Wnt signal enhancers и stem cell growth factors. The Lgr5/R-spondin complex acts by neutralizing Rnf43 и Znrf3, two transmembrane E3 ligases that remove Wnt receptors from the stem cell surface. Rnf43/Znrf3 are themselves encoded by Wnt target genes и constitute a negative Wnt feedback loop. Thus, adult stem cells are controlled by an intricate interplay of potent Wnt agonists, antagonists, и anti-antagonists.

Рис. 1
Рис.1. Architecture of the intestinal epithelium. The small intestinal lumen is lined with a specialized simple epithelium consisting of crypts and villi. Four types of differentiated epithelial cells cover these villi: the absorptive enterocytes, mucous-secreting goblet cells, hormone-secreting enteroendocrine cells, and tuft cells. The crypts of Lieberkuhn, epithelial invasions into the underlying connective tissue, harbor Lgr5 stem cells and their progeny, the TA cells. Cycling Lgr5 stem cells are interspersed with terminally differentiated Paneth cells at crypt bottoms. Small numbers of noncycling secretory progenitors located near the crypt bottom have recently been demonstrated to represent a noncycling “reserve” stem cell population (Buczacki et al 2013).

Рис. 2
Рис.2.Canonical Wnt signaling (Nusse 2012). In cells devoid of a Wnt signal, free cytoplasmic β-catenin is actively targeted for deβ?-catenin. They reside in the so-called destruction complex. Two kinases (CkI and Gsk3?) present in the same destruction complex sequentially phosphorylate a set of highly conserved Ser and Thr residues of β-catenin. Phospho-modified ?-catenin becomes a substrate of the ubiquitin E3 ligase β-Trcp and is subsequently degraded in proteasomes. In the absence of Wnt signaling, Groucho proteins determine the nuclear DNA-binding proteins of the Tcf/Lef family to act as transcriptional repressors of Wnt target genes. Secreted Wnt proteins (19 family members) can induce signaling by interacting with Wnt receptor complexes consisting of a member of the Frizzled family (10 members) and the low-density lipid receptor family members Lrp5 or Lrp6. Wnt binding inactivates the destruction complex. As a direct consequence, β-catenin accumulates in the cytoplasm and nucleus and binds to members of the Tcf/Lef family, converting these into transcriptional activators. The Wnt signaling pathway is regulated extensively at the receptor–ligand level (Cruciat and Niehrs 2013). Secreted Frizzled-related proteins (Sfrp and Frzb) and Wnt inhibitory factor (WIF) can bind Wnt directly to prevent activation of receptors. Other Wnt antagonists, DKK1 and Wise, inhibit by binding to the LRP coreceptor. Recently discovered additional stem cell-specific regulators of canonical Wnt signaling (including Lgr4–6; the R-spondins; Rnf43; and its paralog, Znrf3) are the subject of this review.

Рис. 3
Рис.3. Schematic representation of the domain composition of Lgr1–8, R-spondin1–4, and Rnf43/Znrf3. The eight members of the Lgr family of GPCRs are characterized by the presence of a large ECD composed of LRRs. This domain is flanked by N-terminal and C-terminal caps and a C-terminal Hinge region connecting the LRR domain with the 7TM. They can be further subdivided into classes A, B, and C. The class A receptor family comprises Lgr1, Lgr2, and Lgr3, which are receptors for the glycoprotein hormones follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, and thyroid-stimulating hormone, respectively. Individual human A-type receptors contain nine LRRs and a relatively long Hinge domain. The class B receptor family consists of Lgr4, Lgr5, and Lgr6. The ECD consists of 17 LRRs, and their Hinge domain is of intermediate length. Lgr7 and Lgr8 constitute the class C receptor family. Both bind insulin-like peptide hormones. They exhibit a very short Hinge domain. They are distinguished by the presence of an LDLa N-terminal domain that is essential for signaling. R-spondin proteins harbor two Furin repeats, both required for Wnt signal enhancement. The Furin-1 domain interacts with RNF43/ZNRF3, while the Furin-2 domain binds Lgr4–6. The TSR-1 domain binds Syndecan-type cell surface receptors. RNF43 and ZNRF3 are homologous RING-type E3 ligases and are structurally related to Grail. Typically, these single-pass transmembrane proteins have an extracellular PA domain and a cytoplasmic RING domain. The E3 ubiquitin ligase activity exerted by the RING domains of Rnf43 and Znrf3 targets lysine residues in the 7TM loops of Frizzled receptors. Substrate recognition may be dependent on an interaction of their associated PA domain with the Frizzled–LRP5/6 Wnt receptor complex..

Рис. 1
Рис.4. Crystal structures of the Lgr4/5, Rspo1/2, and Znrf3/Rnf43 complexes. (A–F) Crystal structures of various complexes in cartoon and surface representation. (A) Lgr5–Rspo1 (Protein Data Bank [PDB] 4BSR) (Peng et al. 2013a). (B) Lgr4–Rspo1 (PDB 4KT1) (Wang et al. 2013a). (C) Lgr5–Rspo1–Rnf43 (PDB 4KNG) (Chen et al. 2013). (D) Znrf3–Rspo1 (PDB 4CDK) (Peng et al. 2013b). (E) Rnf43–Rspo2 (PDB 4C9V) (Zebisch et al. 2013). (F) Lgr4 (PDB 4LI1) (Xu et al. 2013). (G) Overview of the binding interfaces of Lgr5–Rspo1 and Rnf43–Rspo1, based on the crystal structure of Lgr5–Rspo1–Rnf43 (PDB 4KNG) (Chen et al. 2013). Shown are the contact footprints of Lgr5 on Rspo1 (in green) and Rnf43 on Rspo1 (in blue) in orthogonal views..

Рис. 5
Рис.5. Regulation of Wnt receptor availability on stem cells. (Panels represent stills from animation that can be found at http://www.nymus3d.nl/video/rspondin.) (A) Upon binding of Wnt to the Fz/LRP receptor complex, some 100 Wnt target genes are activated, including Lgr5. Two other Wnt target genes, Rnf43 and Znrf3, encode transmembrane E3 ligases containing a cytoplasmic RING domain. These serve as components of a negative feedback loop. (B) Enzymatic interaction of the Rnf43/Znrf3-associated RING domain with the Fz/LRP complex leads to polyubiquitination of the intracellular loops of the 7TM domain of Fz. (C) The resulting endocytosis of Fz/Lrp abrogates Wnt signaling. The contribution of the PA domain in the specificity of this process is unclear. Whether Rnf43/Znrf3 are endocytosed with the Wnt receptor complex or segregate after their action is also unknown. When R-spondin is present (D), it is recruited to Lgr5 or its homolog, Lgr4 (E). This high-affinity interaction involves the Furin-2 repeat (Fu2) of R-spondin. This then enables the Furin-1 repeat (Fu1) of R-spondin to interact with Rnf43/Znrf3 (E), resulting in the membrane clearance of the latter (F). As a consequence, Wnt/Fz/Lrp receptor complexes persist on the plasma membrane, enhancing Wnt signal strength and duration..

После открытия у мышей Wnt1 его гомолога у мух, wingless, в качестве онкогена и морфогена, соотв., исследования передачи сигналов Wnt сконцентрировались в первую очередь на развитии животных. В самом деле, Wnts были обнаружены повсеместно в качестве инструктивных сигналов во время развития, управляющим выбором клеточных судеб и формирование паттерна у всех животных (Clevers и Nusse 2012). Два одновременных наблюдения сдвинули внимание к взрослому организму: (1) ген супрессор колоректального рака APC был открыт в качестве негативного регулятора пути Wnt, а (2) генетическое устранение передачи сигналов Wnt приводило к неспособности строить компартменты стволовых клеток в криптах кишечника. Сходные находки были впоследствии описаны в нескольких дополнительных тканях. Здесь будут описаны физические и функциональные взаимодействия трех недавно открытых семейств белков, контролирующих активность стволовых клеток путем регуляции экспрессии на поверхности рецепторов Wnt: seven-transmembrane (7TM) рецептора Lgr5 и его гомологов, однопроходных трансмембранныхE3 лигаз Rnf43 и Znrf3, и секретируемых R-spondin лигандов.

Intestinal crypt homeostasis


Эпителий кишечника формирует в один слой клеток барьер между опасным химическим и биологическим содержимым просветом кишечника и нашим телом. По-видимому, из-за этого он повергается интенсивному самообновлению. При этом цикл его обновления 4-5 дней, самый быстрый среди пролиферирующих тканей у взрослых животных (Leblond и Stevens 1948; Clevers 2013). Эпителий тонкого кишечника (Fig. 1) организован в повторяющиеся единицы, состоящие из ворсинок, которые выступают в просвет и окружены в своем основании криптами Либеркюна, инвагинациями в подлежащую соединительную ткань. Ворсинки необходимы, что максимизировать поверхность эпителия для потребления питательных веществ (Fig. 1). Новые эпителиальные клетки постоянно зарождаются в криптах (Fig. 1). Стволовые клетки располагаются на дне крипт, тогда как transit-amplifying (TA) клетки составляют остальную часть крипт. TA клетки быстро делятся от 4-х до 5 раз перед их дифференцировкой после пересечения границы между криптой и ворсинкой (Marshman et al. 2002). Такая организация приводит к непрерывной миграции клеток вдоль оси крипта-ворсинка по способу ленточного конвейера. Клетки в конечном итоге достигают кончика ворсинки и слущиваются в просвет. Пролиферативная активность и приобретение определенной клеточной судьбы скоординированы за счет небольшого количества консервативных сигнальных путей, из них наиболее заметны сигнальные пути Wnt/β-catenin и Notch. Figure 1.

Wnt signals drive self-renewal of the healthy intestinal epithelium


Первый генетический эксперимент на мышах, касательно передачи сигналов Wnt в биологии стволовых клеток взрослых (Fig. 1) использовал делецию гена Tcf4/Tcf7l2 (Korinek et al. 1998). Tcf4 представляет собой ядерный эффектор передачи сигналов Wnt, который будучи связанным с помощью ключевого регулируемого белка β-catenin, активирует экспрессию генов мишеней для Wnt (Fig. 2). Отсутствие этого транскрипционного фактора полностью блокирует развитие кишечных крипт. Тот же фенотип был описан для трансгенных мышей, у которых передача сигналов Wnt была ингибирована с использованием Dickkopf-1 (Dkk1) (see Fig. 2; Pinto et al. 2003; Kuhnert et al. 2004), Dkk1 является секретируемым антагонистом Wnt (Glinka et al. 1998). В согласии с этим индуцированная делеция у взрослых мышей гена β-catenin (Ireland et al. 2004; Fevr et al. 2007) или Tcf4 (Fig. 2; van Es et al. 2012) блокирует активность стволовых клеток всех крипт. Figure 2.
В качестве зеркального отображения этого феномена было установлено, что опухолевый супрессор рака толстой кишки adenomatous polyposis coli (APC) служит в качестве негативного регулятора стабильности β-catenin. Уровни свободного цитоплазматического β-catenin обычно чрезвычайно низки, но быстро увеличиваются после передачи сигналов Wnt, после чего β-catenin может участвовать и активировать Tcf4. APC, как было установлено, связывает β-catenin (Rubinfeld et al. 1993; Su et al. 1993). В Apc мутантных клетках рака толстой кишки уровни β-catenin увеличиваются аномально (Munemitsu et al. 1995), приводя к несоотв. активации генов мишеней для Tcf4 (Korinek et al. 1997). Тот же самый эффект возникает, когда ген β-catenin содержит активирующую точковую мутацию (Morin et al. 1997;Rubinfeld et al. 1997). Управляемая Wnt/Tcf4 генетическая программа в раковой опухоли колона впервые определена при анализе микромассивов в 2002 (van de Wetering et al. 2002). После дальнейшей обработки эта программа, как было установлено, состоит из стержня ~ в 80 Tcf4 генов мишеней. Большинство из них экспрессируются пролиферирующими TA клетками крипт. Ограниченные количества обнаруживаются специфически в пост-митотических клетках Paneth, которые располагаются на дне крипт (Van der Flier et al. 2007).

Lgr5 marks intestinal stem cells


Один из генов мишеней для Tcf4, Lgr5/Gpr49, экспрессируется уникальным образом; т.e., в тонком кишечнике, в делящихся клетках в основании крипт. Эти т. наз. "crypt base columnar" (CBC) клетки были идентифицированы первоначально Paneth в 1887 (Paneth 1887), и были описаны детально Cheng и Leblond (1974) помощью ЭМ и и было предположено, что они представляют стволовые клетки кишечника. Мышиные модели с LacZ и GFP knock-in подтвердили специфичную для CBC экспрессию Lgr5. Lgr5 локус-специфичные CreERT2 мыши затем были скрещены с Rosa26-LacZ Cre репортерными мышами. Этот базирующийся на отслеживании Lgr5 клона эксперимент предоставил определенные доказательства стволовости CBC клеток. В течение 5 дн, были сформированы голубые "ленты", распространяющиеся вдоль всей оси крипта-ворсинка, которые сохранялись в течение всей жизни (Barker et al. 2007). Включенными в эти ленты оказались все известные типы дифференцированных клеток. Эти эксперименты продемонстрировали, что делящиеся Lgr5+ стволовые клетки являются долго живущими и мультипотентными. Небольшие количества неделящихся секреторных предшественников были расположены вблизи основания крипт, а недавно было продемонстрировано, что они представляют собой популяцию неделящихся "резервных" стволовых клеток (Buczacki et al. 2013).
Используя ту же самую стратегию отслеживания клонов, впоследствии было установлено Lgr5 маркирует стволовые клетки и многих др. органов и тканей, включая желудок (Barker et al. 2010), поджелудочную железу (Huch et al. 2013a), печень (Huch et al. 2013b), почки (Barker et al. 2012), и молочные железы (de Visser et al. 2012; Plaks et al. 2013). Lgr4, близкий гомолог Lgr5, экспрессируется совместно с Lgr5 в клетках CBC, но экспрессируется также во всех др. клетках крипт (de Lau et al. 2011). Такой паттерн - Lgr5 маркирует активные стволовые клетки, а Lgr4 маркирует весь компартмент - является, по-видимому, повторяющимся феноменом в компартментах Wnt-управляемых стволовых клеток у взрослых.

Lgr4, Lgr5, и Lgr6 are members of the Rhodopsin family of GPCRs


Триада рецепторов, экспрессируемых стволовыми клетками и клетками предшественниками, принадлежит к подгруппе из 8 LGRs в сверхсемействе Rhodopsin GPCRs (Fig. 3). Семейство LGR характеризуется крупным extracellular domain (ECD) состоящим из цепочки из leucine-rich repeat (LRR) единиц. Этот LRR регион фланкирован N-терминальным и C-терминальным cap модулями. 8 LGRs могут быть далее подразделены на классы рецепторов A, B и C (Van Loy et al. 2008; Van Hiel et al. 2012). A-типа рецепторы содержат 7-9 LRRs и длинный шарнирный (Hinge) регион, соединяющий LRR регион с доменом 7TM . Они включают Lgr1, follicle-stimulating hormone receptor (FSHR); Lgr2, luteinizing hormone receptor (LHR); и Lgr3, thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) (Fig. 3). Типа C рецепторы Lgr7 и Lgr8 напоминают рецепторы типа A, но имеют более короткий Hinge регион и характеризуются присутствием LDLa мотива (Fig. 3). Они связывают инсулин-подобные relaxins, пептидные гормоны, которые действуют как важные факторы, регулирующие беременность и роды. Связывание лиганда рецепторами типа A и типа C приводит к конформационным изменениям в Rhodopsin-подобном трансмембранном регионе с последующим, управляемым G-белком подъёмом внутриклеточного цАМФ (Hsu et al. 2005; Park et al. 2005). В каждом типа животных, содержащем типа A или типа C Lgrs, за исключением Cnidaria, обнаруживаются последовательности, родственные их предполагаемым лигандам. Это подтверждает существование совместной эволюции соотв. пар рецептор/лиганд. Для типа B Lgrs, эта ситуация менее очевидна. Наиболее охарактеризованный B-типа рецептор это у Drosophila Lgr2. Его лиганд, Bursicon, похожий на гликопротеин гетеродимерный cysteine knot белок, участвует в дублении, затвердении кутикулы и экспансии крыла на взрослой стадии (Luo et al. 2005). Этот гормон хорошо законсервирован у насекомых, моллюсков и иглокожих, но не у более примитивных хордовых. Figure 3.
В отсутствие известного лиганда функции Lgr4/5/6 были впервые исследованы с помощью реверсивной генетики. Для мышиного Lgr4, отмечен широкий паттерн экспрессии с особенно строгой активностью в хрящах, сердце, волосяных фолликулах, почках, репродуктивном тракте и клетках нервной системы (Van Schoore et al. 2005). Кроме того, окрашивание антителами тканей человека выявляет панкреатические островки (Yi et al. 2013). С направленно измененным Lgr4 мыши обнаруживают тяжелую задержку внутриматочного роста. Большинство животных доживали до рождения и погибали в первые дни после этого (Mazerbourg et al. 2004; Kato et al. 2006). Неонатальные нулевые мыши обнаруживали разнообразные аномалии: бесплодие самцов (Mazerbourg et al. 2004; Hoshii et al. 2007; Li et al. 2010; Mohri et al. 2010; Qian et al. 2013), нарушения развития простаты (Luo et al. 2013), аномальное развитие матки (Sone et al. 2013), задержку развития протоков молочных желез (Oyama et al. 2011; Wang et al. 2013c), тяжелые аномалии переднего сегмента глаз (Song et al. 2008; Weng et al. 2008), аномалии эритропоэза (Song et al. 2008), дефектную дифференцировку остеобластов (Luo et al. 2009), дефекты почек (Kato et al. 2006; Mohri et al. 2011), дефектное развитие желчного пузыря (Yamashita et al. 2009), фенотип открытых глаз (Kato et al. 2007; Jin et al. 2008), и аномалии волосяных фолликулов (Mohri et al. 2008). Кроме того, устранение Lgr4 у мышей, по-видимому, способствует переключению с белого жира на коричневый, приводя к энергетическими тратам (Wang et al. 2013b). Гипоморфные Lgr4 мыши, экспрессирующие 10% от нормы Lgr4 mRNA, обнаруживали эмбриональную/перинатальную гибель и бесплодие самцов и обнаруживали морфологические аномалии, сходные с таковыми у Lgr4-нулевых мышей (Hoshii et al. 2007; Yamashita et al. 2009). Интересно, что несмысловые C376T мутации, наблюдаемые в исландской популяции ассоциируют с несколькими болезнями человека, напоминающими фенотипы мышей (Styrkarsdottir et al. 2013).
Экспрессия Lgr5 происходит в стволовых клетках в местах активной пролиферации и является прямым следствием активной передачи сигналов Wnt. Не является неожиданностью то, что экспрессия Lgr5 происходит также в раковой опухоли колона (van de Wetering et al. 2002; McClanahan et al. 2006). Сходным образом, как и в результате мутаций пути Wnt, Lgr5 также строго экспрессируется при раке яичников, печени и лёгких (Yamamoto et al. 2003;McClanahan et al. 2006; Zucman-Rossi et al. 2007; Tanese et al. 2008). Гомозиготное разрушение Lgr5 приводит к неонатальной летальности, обусловленной анкилоглоссией, слиянием языка с дном ротовой полости (Morita et al. 2004). Источник этой аномалии соответствует экспрессии Lgr5 в эпителии языка и нижней челюсти развивающихся эмбрионов. Условная делеция Lgr5 в кишечнике взрослых мышей не выявляет очевидного фенотипа, тогда как делеция Lgr4 уменьшает пролиферацию CBC клеток в криптах кишечника (de Lau et al. 2011). Комбинированное удаление Lgr4 и Lgr5 ухудшает этот фенотип, устраняя компартмент стволовых клеток крипт. Анализ микромассивов показывает, что удаление Lgr4 и Lgr5 специфически затрагивает экспрессию Wnt-управляемой программы крипт, подразумевая функциональную связь между двумя Lgrs и Wnt путями. Наконец, гомозиготные мутантные Lgr6 мыши не обладают очевидным фенотипом (Snippert et al. 2010).

R-spondins, vertebrate-specific Wnt-agonists


4 секретируемых R-spondin белков являются уникальными агонистами Wnt-инициируемой передачи сигналов (Fig. 3). Первые экспериментальные доказательства, вывившие эту роль R-spondins при скрининге экспрессии у ранних эмбрионов лягушек (Kazanskaya et al. 2004). Истощение R-spondin2 в одиночных бластомерах на 8-клеточной стадии эмбрионов лягушек или истощение на стадии гаструлы приводили к неспособности транскрипционно активировать гены myoD и myf5, приводя к нарушению мышечного развития. Манипуляции в базовой активностью Wnt на этих стадиях развития у эмбрионов кур и млекопитающих фенокопировали эти эффекты (Cossu и Borello 1999; Borycki и Emerson 2000). Подходы с Wnt репортером в HEK293T клетках подтвердили функциональную связь между канонической передачей сигналов Wnt/β-catenin и активностью R-spondin (Kazanskaya et al. 2004). R-spondins, как было установлено, действуют непосредственно выше Wnt белков. Соотв., R-spondin-управляемая активация Wnt была чувствительной к присутствию внеклеточного ингибитора Wnt рецептора Dkk1 (Fig. 2). В последующем исследовании были получены трансгенные мыши, у которых в крови циркулировали лимфоциты, постоянно секретирующие R-spondin-1. Такие мыши обнаруживали громадную экспансию своих кишечных крипт. То же исследование подтвердило, что R-spondin-1 увеличивает силу сигналов Wnt, как было измерено с помощью стабилизации β-catenin и фосфорилирования Wnt/Frizzled корецептора Lrp6 (Kim et al. 2005). Интересно, что слияние генов, которые затрагивали R-spondin-2 и R-spondin-3 и приводило к более высоким уровням экспрессии функционального R-spondin в ряде раковых опухолей толстой кишки у человека (Seshagiri et al. 2012).
R-spondin-1 является существенным компонентом трехмерной (3D) культуральной системы, которая делает возможной долговременный рост кишечных эпителиальных органоидов из Lgr5+ CBC клеток (Sato et al. 2009). В этой системе культивирования изолированные одиночные стволовые клетки помещали в суспензию из Matrigel, 3D богатый ламинином и коллагеном матрикс, воспроизводящий базальную ламину. Коктейль из R-spondin, EGF и Noggin предоставляет важные сигналы для поддержания стволовых клеток. R-spondin был выбран благодаря его активности, усиливающей сигналы Wnt, хотя механизм его действия всё ещё остается неизвестным. Возникающие в результате органоиды ("мини-кишка") воспроизводят по существу все аспекты самообновления эпителия крипт-ворсинок и могут поддерживаться годами в культуре, в то же время оставаясь генетически и фенотипически стабильными (Sato и Clevers 2013). Сходные протоколы были разработаны для Lgr5 стволовых клеток из печени (Huch et al. 2013b), желудка (Barker et al. 2010) и поджелудочной железы (Huch et al. 2013a).
R-spondins являются членами большого семейства белков, характеризующихся присутствием thrombospondin repeats (TSRs) (Fig. 3). R-spondins уникально комбинируют TSR с двумя N-терминальными Furin повторами (de Lau et al. 2012). Префикс R у членов R-spondin означает экспрессию мышиного R-spondin1 в эмбриональной эпителиальной ткани (R)oof нервной пластинки (Kamata et al. 2004). Два Furin-подобных богатых цистеином повтора вблизи N конца зрелого белка представляют "business end" зрелого белка, поскольку присутствие обоих повторов в R-spondin обязательно и достаточно для осуществления активности по усилению Wnt (Kazanskaya et al. 2004). TSR-1 домен в R-spondin может служить для связывания glycosaminoglycan/proteoglycan, как это обнаружено для др. белков. Недавно соотв. находкой стала идентификация трансмембранного протеогликана syndecan-4 как рецептора для R-spondin-3 (Ohkawara et al. 2011). R-spondin гомологи определяются как белки, обладающие двумя доменами Furin, скомбинированными с TSR-1 доменом, они присутствуют у всех позвоночных и некоторых примитивных хордовых (de Lau et al. 2012). Не найдено гомологов у беспозвоночных модельных организмов, таких как Drosophila и Caenorhabditis. Учитывая такое филогенетическое распределение первые подобные R-spondin гены, скорее всего, возникли вторичноротых. Две геномные дупликации сгенерировали присутствующие на сегодняшний день разнообразие R-spondin у видов позвоночных (de Lau et al. 2012).

R-spondins in embryogenesis


Уникальная способность усиления Wnt у R-spondins, комбинирует с их динамичными паттернами экспрессии в эмбриональных тканях, предсказывая важные и плейотропные роли R-spondins во время эмбриогенеза (Nam et al. 2007b).
Мутации, затрагивающие функцию R-spondin-1 приводят к редкому синдрому у человека, который комбинируется с SRY-независимыми, трансформацией пола XX в самцов, сопровождаемой гиперкератозом ладоней и стоп и предрасположенностью к плоскоклеточной карциноме кожи (Parma et al. 2006). Развитие женского пола у эмбрионов непосредственно контролируется с помощью сильных сигналов Wnt во время дифференцировки бипотентных гонад. У XY индивидов, HMG-box-содержащий транскрипционный фактор SRY индуцирует транскрипцию HMG-box члена Sox-9. Этот транскрипционный фактор специфически активирует программу развития семенников. Тогда как у индивидов XX ось Wnt4/R-spondin гарантирует развитие женского пола путем супрессии развития Sox9-управляемых семенников (Kashimada и Koopman 2010). Трансформация пола происходит вследствие неспособности достигать высоких уровней R-spondin-1 специфически во время дифференцировки гонад у затронутых XX индивидов. Сходный фенотип трансформации пола наблюдается у мышей, лишенных R-spondin-1 или Wnt4 (Vainio et al. 1999;Tomizuka et al. 2008).
Важная роль R-spondin-2 во время развития была раскрыта у мутантных мышей с инсерцией, наз. "footless" (Rspo2Tg/Tg), и у мышей гомозиготных по целенаправленной инактивации гена R-spondin-2 (Nam et al. 2007a; Bell et al. 2008). Наблюдались перекрывающиеся фенотипы в апикальной эктодермальном гребне развивающихся конечностей и ы развитии легких. Наблюдаемые дефекты легких возникают в результате уменьшения ветвления бронхиол в легких мышей Rspo2Tg/Tg. Это мнение было подкреплено in vitro R-spondin-обеспечиваемым восстановлением мутантных лёгочных эксплантов. Участие канонической передачи сигналов Wnt далее было подтверждено путем взаимного скрещивания Rspo2Tg/Tg мышей с мутантными Lrp6 мышами (Bell et al. 2008). Wnt-управляемый LacZ репортер у мышей выявил предполагаемое существенное снижение активности Wnt в дистальных кончиках ветвящегося эпителия. Снижение экспрессии Wnt гена-мишени Irx3, как известно, необходимо для ветвления, это предоставляет молекулярное объяснение характеристик этого фенотипа (van Tuyl et al. 2006). Теперь мы знаем о важной роли R-spondin-1в развитии гонад у XX индивидов. Недавно эксклюзивная экспрессия R-spondin-2 была описана в ооцитах овариальных фолликулов. Происходящий из ооцитов R-spondin, по-видимому, управляет развитием первичных фолликулов до вторичной стадии паракринным способом. Эти наблюдения согласуются с экспрессией множественных Wnt лигандов и соотв. Frizzled рецепторов в яичниках (Cheng et al. 2013).
R-spondin-3 играет доминирующую роль во время развития плаценты, которое у мышей начинается на эмбриональный день 8.5 (E8.5) со слияния между хорионом и аллантоисом, двух внеэмбриональных тканей. Впоследствии, хорион-аллантоисные разветвления формируют функциональный лабиринт, способный к обмену газами, питательными веществами и отходами между эмбриональными и материнскими кровеносными сосудами. Недостаточное проникновение плодных кровеносных сосудов и несоответствующее расположение по отношению к материнским кровеносным синусам в зоне лабиринта вызывает эмбриональную гибель у R-spondin-3 нокаутных животных примерно на ст. E10. Этот фенотип напоминает фенотипы, продуцируемые или делецией генов Frizzled5 или Wnt2 (Monkley et al. 1996; Ishikawa et al. 2001). Наконец, мутация гена R-spondin-4 у человека вызывает врожденную anonychia, отсутствие ногтей на пальцах рук и ног во всём остальном здоровых людей (Blaydon et al. 2006; Khan et al. 2012).

Lgr4, Lgr5, и Lgr6 are receptors for R-spondins


Первоначально было предположено, что Fzd (Nam et al. 2006), Lrp6 (Wei et al. 2007) или Kremen рецептор (Binnerts et al. 2007) выступают в качестве рецепторов для R-spending. Окончательная deorphanization Lgrs (Fig. 3) была описана в 2012. Liu и колл. (Carmon et al. 2011) первоначально проверяли серию кандидатов лигандов, используя классические GPCR-ассоциированные вторичные мессенджеры в линиях клеток с избыточной экспрессией Lgr4 и Lgr5. Из-за отсутствия ответа, они затем обратились к R-spondins, исходя из их роли, способствующей Wnt. Специфическое физическое связывание Fc-нагруженных версий R-spondins с линиями клеток, избыточно экспрессирующими Lgr4 и Lgr5 и дальнейшие функциональные и биохимические эксперименты выявили взаимодействия высокого сродства между Lgr4 или Lgr5 и R-spondins. В независимом подходе (de Lau et al. 2011), меченные версии R-spondin-1 были использованы как молекулы приманки для поверхностных рецепторов на HEK293T клетках. Масс-спектрометрия отловленных белков идентифицировала Lgr4 (de Lau et al. 2011). В самом деле, нокдаун гена Lgr4 в тех же самых клетках приводил к снижению чувствительности к R-spondin. Этот дефект мог быть устранен с помощью Lgr4, Lgr5 и Lgr6, но не др. членов подсемейства Lgr. Все 4 R-spondins обнаруживали связывание с высоким сродством со всеми тремя Lgrs. В интактных клетках это приводит к усилению фосфорилирования Lrp5/6 и стабилизации β-catenin, но не затрагивает передачи сигналов G-белков (Carmon et al. 2011; de Lau et al. 2011). Третье исследование идентифицировало Lgr4 и Lgr5 при геномном siRNA скрининге на рецепторы R-spondin и отметило, что R-spondin-запущенная передача сигналов β-catenin требует Clathrin, указывая тем самым, что интернализация рецепторов играет механистическую роль в передаче сигналов R-spondin (Glinka et al. 2011). 4-е исследование подтвердило, что Lgr4 является рецептором R-spondin (Ruffner et al. 2012).

Norrin, a Wnt-agonistic alternative Lgr4 ligand


Bursicon, лиганд для Drosophila типа B Lgr, является гликопротеин-подобным гетеродимерным cysteine knot белком (Luo et al. 2005). Идентификация R-spondins в качестве лигандов для типа B рецепторов Lgr4, Lgr5 и Lgr6 подразумевает изменение класса лигандов. Кроме того, неспособность становления передачи сигналов посредством G белков указывает на изменение в механизме сигнальной трансдукции. Недавнее исследование Hsueh и коллег (Deng et al. 2013) ставит под сомнение это мнение. Они полагают, что Wnt агонист Norrin является ортологом Drosophila Bursicon, исходя из сходства последовательностей и законсервированной 11-cysteine структуры. Соотв., Norrin д. служить в качестве подходящего лиганда для Lgr4 в дополнение к его хорошо известному взаимодействию с Frizzled4 рецептором (Xu et al. 2004). Norrin, связанный с Lgr4, обнаруживает прямую инициацию передачи сигналов Wnt или agonized с Wnt. Norrin, по-видимому, не стимулирует продукцию с G-protein-купированного цАМФ посредством Lgr4, это контрастирует с dLgr2/Bursicon (Luo et al. 2005).

E3 ubiquitin ligases implied in Wnt-Lgr/R-spondin signaling


Регуляция силы сигнала Wnt на уровне рецептора становится даже более сложной с идентификацией двух высоко гомологичных генов мишеней для Wnt: Rnf43 и Znrf3. Специфическая экспрессия Rnf43 ранее была выявлена в раке толстой кишки человека (Ivanov et al. 2007). Обе E3 лигазы, как было установлено, специфичны для стволовых клеток Lgr5 крипт (Koo et al. 2012) и обогащены в раке толстой кишки (Hao et al. 2012). Оба белка обнаруживают по своей базовой структуре последовательностям родство с Grail (Rnf128). Эта однопроходная трансмембранная E3 лигаза с внеклеточным PA доменом регулирует экспрессию на клеточной поверхности специфических мембранных рецепторов на T лимфоцитах. Grail принадлежит семейству Goliath RING доменовых E3 лигаз. Эволюционная история, реконструированная по данным Ensembl Compara database (Vilella et al. 2009) выявила исходный белок с той же самой архитектурой доменов у растений, грибов и разных простейших. Ранняя эволюция метазоа затем создала два кластера. Из одного из этих кластеров возникли семейства Goliath и Godzilla. Самым ранним оставшимся представителем второго кластера является C. elegans белок PLR-1 (Y47D3.B11). Последующие удвоения у вторичноротых в этом кластере, которые создали Znrf3 и Rnf43, прослеживаются к основанию расхождения их у позвоночных (de Lau et al. 2012). Rnf43 и Znrf3 специфически обеспечивают мультиубиквитинирование лизинов в цитоплазматических петлях 7TM домена в Frizzleds (Hao et al. 2012; Koo et al. 2012). Это приводит к быстрому эндоцитозу Wnt рецепторов и их деструкции в лизосомах. Сходный на E3 лигазе базирующийся механизм регулирует плотность Frizzled рецепторов на плазматической мембране для ортолога C. elegans PLR-1 E3 лигазы (Moffat et al. 2014). Структурная основа того, как PLR-1, Rnf43 и Znrf3 идентифицируют Frizzleds в качестве своего специфического субстрата, пока в точности неизвестно.
Rnf43 и Znrf3 специфически обеспечивают мультиубиквитинирование лизинов в цитоплазматических петлях 7TM домена Frizzleds (Hao et al. 2012; Koo et al. 2012). Это приводит к быстрому эндоцитозу Wnt рецепторов и их деструкции в лизосомах. Структурной основой того, как Rnf43 и Znrf3 идентифицируют Frizzleds в качестве своего специфического субстрата пока неизвестно.
Поскольку Rnf43 и Znrf3 кодируются генами-мишенями для Wnt, то они, как полагают, функционируют как регуляторы негативной обратной связи экспрессии рецепторов Wnt. Потеря экспрессии этих двух E3 лигаз, как полагают, будут приводить к избыточной чувствительности к эндогенным Wnt сигналам. Поэтому одновременная делеция этих двух Wnt модуляторов в кишечном эпителии индуцирует образование необычных аденом, состоящих целиком из Lgr5 стволовых клеток и их ниш (Koo et al. 2012). В самом деле, мутации в Rnf43 обнаруживаются в некоторых клеточных линиях из раковой опухоли толстого кишечника человека (Koo et al. 2012) и разнообразные типы опухолей затрагивают желчные протоки человека (Ong et al. 2012), поджелудочную железу (Furukawa et al. 2011; Wu et al. 2011; Jiang et al. 2013), и яичники (Ryland et al. 2013; Zou et al. 2013). Интересно, что небольшая молекула ингибитора Wnt секреции LGK974 подавляет пролиферацию и индуцирует дифференцировку линии клеток RNF43 мутантной панкреатической аденокарциномы, даже при тестировании у xenograft моделей (Jiang et al. 2013).
Серия биохимических экспериментов показывает, что Rnf43/Znrf3-обеспечиваемая очистка мембран от Wnt рецепторов приводит к обратному после добавления R-spondin (Hao et al. 2012),указывая тем самым, что R-spondin/Lgr-обеспечиваемое усиление передачи сигналов Wnt использует обе E3 лигазы. Наблюдалось слабое, но специфическое взаимодействие R-spondin с Znrf3. Затем была сформулирована модель, в которой связывание Lgr5 и Rnf43/Znrf3 с помощью Furin доменов R-spondin должна приводить к очистке мембран от Rnf43/Znrf3. Т.о., R-spondin-Lgr комплексы должны нейтрализовать Rnf43/Znrf3, делая возможным нахождение на поверхности Frizzled рецепторов и усиление силы сигнала Wnt.

The structural basis of R-spondin signaling


Недавнее кристаллографическое исследование выявило структуру R-spondin или одного или связанного с Lgr4/5 и Rnf43/Znrf3 и предоставило основу для механизма, с помощью которого эти молекулы коллективно контролируют силу сигнала Wnt (Fig. 4A-F). Figure 4.

R-spondin


к передаче сигналов R-spondin-1 и R-spondin-2, представлены Furin доменами 1 и 2, были визуализованы с разрешением в 2 Â. 5 структурных исследований подтвердили единодушно, что повторы furin-1 и furin-2 каждый содержит три сходно сконструированные cysteine-knotted β шпильки (hairpins) (Chen et al. 2013; Peng et al. 2013a;Wang et al. 2013a; Xu et al. 2013; Zebisch et al. 2013), при этом паттерн дисульфидных связей, выглядит одинаково с Furin доменами, наблюдаемыми в др. белках (Garrett et al. 1998; Ogiso et al. 2002). В целом, два furin повтора, которые образуют компетентный к передаче сигналов фрагмент (Kazanskaya et al. 2004) дают вытянутую структуру, хотя гибкий шарнир между furin-1 и furin-2 приводит к разным ориентациям относительно домена.

Lgr/R-spondin


Крупный ECD из Lgr4 и Lgr5 формирует ожидаемую подкова-образную структуру с 17 LRRs, фланкированных Lgr1-типа N-терминальной и C-терминальной шапочкой, богатой цистеином. Однако, подковообразная форма искривлена и изогнута между LRR10 и LRR11. Связывающая позиция R-spondin-1 с вогнутой поверхностью Lgr4 и Lgr5 представлена LRR доменами 3-9. Первая β шпилька из Furin-2 повтора R-spondin-1 содержит 106FSHNF110 петлю, из которой ароматические остатки Phe106 и Phe110 образуют зажим (clamp) нацеленный на Ala190 и участвуют в гидрофобном взаимодействии с окружающими остатками Lgr5. Одиночные F106E или F110E мутации в F зажиме полностью устраняют связывание рецептор-лиганд , а также функциональную активность R-spondin, как обнаруживает Wnt репортер и клеточные культуры стволовых клеток тонкого кишечника (Peng et al. 2013a). Сходным образом, F106A и F110A мутации нарушают взаимодействие с Lgr4 (Wang et al. 2013a; Xie et al. 2013). Второй сайт взаимодействия с Lgr5 в R-spondin имеет заряженный характер и располагается вокруг Lys59 (Furin-1) и Arg87 (Furin-1). Мутации этих остатков, хотя и существенно снижают, но не полностью устраняют передачу сигналов. Место взаимодействия R-spondin-1/Lgr очень консервативное для всех 4-х R-spondins и Lgr4-6 у разных видов (Chen et al. 2013; Peng et al. 2013a; Wang et al. 2013a; Xu et al. 2013). Это сравнимо с ранее описанной разнородностью взаимодействий рецептор/лиганд.

R-spondin Rnf43/Znrf3


Одна группа представила кристаллы трехмерного комплекса, состоящие из ECD от Rnf43 помимо пары Lgr5/R-spondin (Fig. 4C; Chen et al. 2013). Lgr5 и Rnf43 рецепторы, по-видимому, физически связаны посредством furin(1 + 2) доменов в R-spondin (Fig. 4G), при этом физический контакт между рецепторами отсутствует. Кроме того, два исследования представили структурные данные, полученные для R-spondin-1/Znrf3 (Fig. 4D;Peng et al. 2013b) и R-spondin-2/Rnf43-Znrf3 (Fig. 4E; Zebisch et al. 2013). Описанные находки устранили сомнения о ранее подтвержденном взаимодействии R-spondin с RNF43 и и его паралогом, Znrf3. Эктодомены Rnf43 и Znrf3 образуют типичную PA доменовую складку. Структурное совмещение показывает высокое сходство с RMSD of 0.75Å. Их 3D складка сравнима с таковой Grail, основателя семейства Goliath, несмотря на сильное расхождение в белковых последовательностях (Zebisch et al. 2013). Ключевыми элементами электростатических взаимодействий Rnf43 и Znrf3 при контакте с R-spondin являются Gln84, His86, Lys108, и Glu110 (позиции 100, 102, 125, и 127 в Znrf3 человека, соотв.). Законсервированными остатками в интерфейсе на R-spondin-1 являются Ser48, Asn51, Arg66 и Gln71. Одновременные исследования систематических мутаций всех консервативных остатков Furin повторов независимо установили, что R66A и Q71A мутации в домене Furin1 полностью устраняют связывание R-spondin-ZNRF3. Все исследования сошлись в том, что остатки R-spondin-4, которые мутантны при anonychia у пациентов, располагаются в центре этого интерфейса (Chen et al. 2013; Peng et al. 2013b; Xie et al. 2013; Zebisch et al. 2013). Эти наблюдения объясняют неактивность связанных с болезнью R-spondins в подходах с репортером Wnt, несмотря на интактное связывание Lgr5 (Peng et al. 2013a; Xie et al. 2013; Zebisch et al. 2013).
Несколько исследований достигли соглашения о 2-5 nM сродстве взаимодействия для гидрофобного интерфейса R-spondin/Lgr и о 1-10 nM сродстве взаимодействия для в основном гидрофильного взаимодействия с RNF43. Сравнение сродства с использованием продуцируемых бактериями компонентов также подтвердили эти находки (Moad и Pioszak 2013). Хотя Frizzled рецептор безусловно является субстратом для ферментативной активности, ассоциированной с Rnf43/Znrf3 и их физическое взаимодействие действительно обнаружено (Hao et al. 2012), точный механизм этого взаимодействия неизвестен. Слабое взаимодействие E3 лигаз с R-spondin подтверждает модель молекулярной конкуренции PA домена с Wnt/Lrp/Fz комплексом. Конечно, PA домены PLR-1 и GRAIL также участвуют в распознавании субстрата (Lineberry et al. 2008; Moffat et al. 2014).

Quaternary arrangements


Неожиданным аспектом кристаллографического анализа нескольких комплексов стала изменчивость наблюдаемого расположения четырех частей (Fig. 4). В растворе Lgr4/5 ECD-R-spondin комплексы являются мономерными (Peng et al. 2013a; Wang et al. 2013a), тогда как Lgr4 ECD сам по себе, как было установлено, ведет себя как димер (Xu et al. 2013). Во многих отличающихся кристаллах комплексов Lgr5/R-spondin-1 мы обнаружили димерный, "охват (embracing)" Lgr5 ECDs (Fig. 4A; Peng et al. 2013a). Обе молекулы R-spondin в комплексе, по-видимому, связаны в транс-положении с Lgr5 C-терминальной цистеиновой шапочкой (cysteine caps). Такое расположение не наблюдалось в кристаллических структурах, описанных другими. Однако , Xu et al. (2013) описали два head-to-tail Lgr4 ECDs в асимметрической единице их кристаллов (Fig. 4F, left panel). Проверка этой кристаллической решетки снова показала C-терминальное "embraced" расположение (Fig. 4F, right panel). Хотя и похожий, этот Lgr4 ECD охват не идентичен тому, что наблюдается для Lgr5/R-spondin (Fig. 4A; Peng et al. 2013a). Полностью отличныйt, "back-to-back" димер Lgr4/R-spondin (data not shown) обнаружен в исследовании Xu et al. (2013) делает ситуацию ещё более запутанной. Наблюдаемое димерное расположение Lgr5-R-spondin (Fig. 4A), по-видимому, несовместимо со связыванием Rnf43/Znrf3. Место взаимодействия Rnf43/Znrf3 на R-spondin перекрывается с интерфейсом димеризации, включая остатки, связанные с мутациями при anonychia. Это перекрывание подразумевает, что димеризация должна конкурировать со связыванием Rnf43/Znrf3. Кроме того, как Zebisch et al. (2013) так и Peng et al. (2013b) наблюдали димеры Zrnf3-rspo1 (data not shown), но не димеры Rnf43-rspo1. Сегодня неясно, имеет ли физиологичское значение организация высшего порядка (в любой форме) изученных рецепторов.

Concluding statements


Taken together (Fig. 5; animation at http://www.nymus3d.nl/video/rspondin), these observations paint a scenario in which the Lgr4, Lgr5, и Lgr6 receptors serve to efficiently recruit R-spondin ligands и bring these into position for interaction with Rnf43/Znrf3. This interaction leads to membrane clearance of the Ring finger proteins, the consequent persistence of surface Frizzled receptors, и the boosting of Wnt signal strength. The canonical Wnt signal cascade is encoded by all animal genomes, while an Rnf43/Znrf3 homolog capable of down-regulating Frizzled surface expression has been described in at least one invertebrate; i.e., PLR-1 in the roundworm C. elegans. However, the R-spondin/Lgr5/Rnf43 module appears to be a relatively recent evolutionary "add-on" seen only in vertebrates. It will be of interest to understand why this exquisite regulatory system was added to an already very complex Wnt receptor/ligand system. Answers may be found in the appearance of sophisticated stem cell/TA cell compartments in vertebrates coinciding with a general increase in body size. Figure 5.