Известно, что миокард тракта оттока происходит из внекардиального региона (Viragh & Challice 1973; Arguello et al. 1975; de la Cruz et al. 1977), но только недавно стало известно, что внекардиальный регион вносит вклад в миокард тракта оттока эмбрионов кур и мышей (Kelly et al. 2001; Mjaatvedt et al. 2001; Waldo et al. 2001). Mjaatvedt et al. (2001) установили, что anterior heart field (AHF) располагается в мезодерме, окружающей аортальный мешок, который располагается впереди примитивной кардиальной трубки и предоставляет миокардиальные клетки тракту оттока (OFT) у эмбрионов кур. В том же году др. исследование продемонстрировало, что AHF содержит мезодермальный центр бранхиальных дуг и спланхнический эпителий в дорсальной стенке перикардиальной полости и формирует OFT и right ventricle (RV) в эмбриональном сердце мыши (Kelly et al. 2001). Между тем введено др. определение, вторичное поле сердца, которое располагается в фарингеальной мезодерме, каудальнее по отношению к OFT и продуцирует только миокард дистальной части OFT и корень крупных артерий (Waldo et al. 2001). Позднее, second heart field (SHF) было определено как популяция клеточных предшественников дорсальнее сердечной трубки. Его клетки вносят вклад в OFT, RV и частично в левый желудочек и регион притока (Buckingham et al. 2005; Laugwitz et al. 2008). Итак. эти исследования доказали, что часть сегментов сердца происходит из AHF или SHF. Т.о., традиционный кардиальный лунный серп назван как first heart field (FHF). Более того, было установлено, что AHF, вторичное поле сердца и SHF не только дает миокард предсердия, часть левого желудочка и межжелудочковой перегородки (Cai et al. 2003; Verzi et al. 2005; Sun et al. 2007), но и также дифференцируется в клетки эндокарда и гладкомышечные клетки (Verzi et al. 2005; Waldo et al. 2005). Идентификация AHF, вторичного поля сердца и SHF оказало существенное влияние на наше понимание некоторых признаков врожденных болезней сердца, таких как двойной выход из правого желудочка и тетрада Фалло (Ward et al. 2005). Однако, различия границ и вкладов в эмбриональное сердце необходимо отметить между SHF, AHF, и вторичным полем сердца. Причина может заключаться в различиях между видами животных, наблюдаемыми стадиями и методами мечения. Но SHF обычно определяет более широкие пределы, чем AHF и вторичное поле сердца. В данном исследовании мы вынуждены выбрать номенклатуру SHF для дискриминации от FHF. Недавно, исследования были сфокусированы на сигнальной регуляции SHF, включая аутокринные сигналы и сигналы от фарингеальной энтодермы и кардиального нервного гребня (Black 2007; Dunwoodie 2007; Rochais et al. 2009; Vincent & Buckingham 2010; Zaffran & Kelly 2012).

В данной работе мы намереваемся рассмотреть пространственно-временное распределение SHF и его вклад в развитие артериального полюса эмбрионального сердца человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ

The spatiotemporal distribution of Isl-1 positive SHF at CS10 to CS14 in human embryo

Хорошо известно, что поле стадии кардиальной трубки, Isl-1 является надежным маркером SHF (Cai et al. 2003; Sun et al. 2007), а Nkx2.5 и GATA4 являются ключевыми транскрипционными регуляторами в FHF и SHF (Dodou et al. 2004; Klaus et al. 2007; Prall et al. 2007). Следовательно, чтобы исследовать паттерн пространственно-временного распределения SHF у эмбрионов человека, мы намереваемся отслеживать экспрессию Isl-1, GATA4 и Nkx2.5 и развитие OFT на тех же самых стадиях.

В данном исследовании результаты показывают, что Carnegie stage 10 (CS10), представлена петлеобразной сердечной трубкой, состоящей из OFT, первичным желудочком, предсердием и венозным синусом. Её артериальный полюс окружен первой бранхиальной дугой (Fig. 1A). Пространство между примитивной глоткой и дорсальной стенкой перикардиальной полости заполнено бесклеточным матриксом. Поток Isl-1 позитивных клеток в билатеральной фарингеальной мезенхиме является продолжением дорсальной стенки перикардиальной полости (Fig. 1A, arrow and arrowhead), тогда как транскрипционные факторы Nkx2.5 и GATA4 экспрессируются слабо (Fig. 1B,C, arrow and arrowhead). Isl-1 позитивные клетки также обнаруживаются в бранхиальных дугах (Fig. 1A, asterisk). В дистальной стенке OFT, которая reflected с дорсальной стенкой перикардиальной полости, Isl-1 экспрессируется сильно (Fig. 1A, red arrow), но маркеры ранней дифференцировки кардиомиоцитов, Nkx2.5 и GATA4 были слабо позитивными, и маркер кардиомиоцитов, MHC, также экспрессирован слабо (Fig. 1B-D, red arrow). Одновременная экспрессия Isl-1, Nkx2.5 и GATA4 и MHC в дистальной стенке OFT показывает, что Isl-1 позитивные клетки д. дифференцироваться в кардиомиоциты, чтобы принять участие в развитии миокарда дистального полюса OFT. Для зрелых миокардиальных клеток OFT, экспрессия MHC, Nkx2.5 и GATA4 усиливалась, но экспрессия Isl-1 подавлялась (Fig. 1A-D, blue arrow). Figure 1.

Между CS11 и CS12, артерии аортальных дуг (AAs) 1, 2, 3 становятся видимыми и соединенными с аортальным мешком (Fig. 2A,B). Артериальный полюс кардиальной трубки всё ещё расположен на уровне бранхиальных дуг (Fig. 2B). На ст. CS11, Isl-1 позитивные клетки накапливаются, чтобы сформировать конденсированный мезенхимный тяж бранхиальных дуг (Fig. 2A-C, arrowhead), который является продолжением таких же клеток на вентральной стенке аортального мешка (Fig. 2B,C, arrow). Между тем вентральная стенка аортального мешка начинает слабо экспрессировать Nkx2.5 и GATA4 (Fig. 2D,E, arrow). Известно, что OFT непосредственно соединен с аортальным мешком. Различие между их стенками в том, что первый содержит миокард, маркированный MHC, а последний является мезенхимной структурой. Согласно нашим результатам Isl-1, Nkx2.5 и GATA4 позитивная экспрессия в вентральной стенке аортального мешка указывает на то, что Isl-1 позитивные клетки могут дифференцироваться в клетки миокарда, чтобы стенку аортального мешка наделенной миокардиоцитами и добавить их в стенку OFT. Поток Isl-1 позитивных клеток от мезенхимного тяжа (core) бранхиальных дуг 1, 2 также являются продолжением с дистальной стенкой OFT (Fig. 3A,B). Итак, конденсированная сердцевина бранхиальных дуг может поставлять Isl-1 позитивные мезенхимные клетки в аортальный мешок и OFT. По сравнению с экспрессией Isl-1, экспрессия Nkx2.5 или GATA4 спорадическая как в бранхиальных дугах без образования мезенхимного тяжа (Fig. 2B-E), и экспрессия слабая в дорсальной стенке перикардиальной полости (Fig. 2D,E, arrowhead). Figure 2.3.

На ст. CS13, усадка энтодермы ведет к образованию щели между глоткой и её вентральной мезенхимой, чего не наблюдается между фарингеальной энтодермой и её билатеральной мезенхимой (Fig. 4A-C). Между тем, часть латеральной фарингеальной энтодермы теряет свою базальную мембрану и некоторые энтодермальные клетки становятся маленькими округлыми и рассредотачиваются в соседние Isl-1 позитивные мезенхимные клетки (Fig. 4C,D, frame). В отличие от CS11, Isl-1 позитивные клетки в основном распределяются в билатеральной и вентральной мезенхиме примитивной глотки (Fig. 4A,B). Isl-1 экспрессия также обнаруживается в дорсальной стенке перикардиальной послости, которая тесно прилегает к вентральной фарингеальной мезенхиме и reflected с OFT миокардиальной стенкой (Fig. 4A,B, arrow). На ст. CS14, AAs 4, 6 могут быть идентифицированы и они связаны с аортальным мешком (Fig. 5A). Из-за того, что артериальный полюс эмбрионального сердца транслоцируется каудально по отношению к бранхиальным дугам (Fig. 5B), Isl-1 позитивные клетки в мезенхимном тяже (core) бранхиальных дуг 3, 4, 6 теряют непосредственную связь с дорсальной стенкой перикардиальной полости и OFT (Fig. 5A). На этой стадии из передней кишки формируется трахея. Большинство Isl-1 позитивных клеток концентрируются, чтобы сформировать область конуса в билатеральной и вентральной мезенхиме трахей (Fig. 5A, asterisk, B), которая расширяется каудально и становится постепенно уменьшающейся (Fig. 5G, asterisk). Isl-1 позитивные клетки обнаруживаются также в дорсальной стенке перикардиальной полости и являются продолжением клеток дистального полюса стенки OFT (Fig. 5B, C). Сестринские окрашенные срезы показывают, что GATA4, Nkx2.5 и MHC экспрессируются слабо в стенке дистального полюса OFT (Fig. 5D-F). Эти находки подтверждают, что Isl-1 позитивные клетки продолжают предоставлять миокардиальные клетки для развития OFT, которые сходны с таковыми ст. CS13. Однако не наблюдается область GATA4 или Nkx2.5 позитивной области конуса в вентральной трахейной мезенхиме (data not shown). Figure 4.5

SHF cells formed two condensed prongs in the OFT

Хорошо известно, что стенка OFT состоит из миокарда, эндокарда и кардиального геля между ними. По мере развития мезенхимные клетки мигрируют в кардиальный гель и вносят вклад в образование эндокардиальных подушек. В данном исследовании, сопровождаемые дифференцировкой кардиомиоциты из OFT, частично Isl-1 позитивные клетки, концентрируются в кардиальном геле каудальной части стенки OFT и образуют Isl-1 позитивный конденсированный клеточный зубец (prong) (Fig. 5B, C, asterisk). Тем временем, некоторые Isl-1 позитивные клетки формирую др. конденсированный клеточный зубец в краниальной чати стенки OFT (Fig. 5G, H, arrow). Следовательно, на этой стадии два зубца обращены др. к др. и увеличиваются от дистального полюса к проксимальному полюсу OFT (Fig. 5C, H, I). Необходимо гарантировать, что клетки зубцов окрашиваются негативно за исключением Isl-1 (Fig. 5C-J). В то же самое время множество мезенхимных клеток оказываются в кардиальном геле и образуют двк эндокардиальные подушки, которые соседствуют с двумя зубцами (prongs) (Fig. 5I, asterisk). Соседние срезы показывают, что часть клеток в подушках экспрессирует α-SMA (Fig. 5J).

Isl-1 positive SHF cells distributed in the artery wall and the aortic-pulmonary septum

На ст. CS15 - CS16, область Isl-1 позитивного конуса всё ещё очевидна (Fig. 6A asterisk). Длина OFT более не увеличивается. Образутся аортико-пульмональная перегородка и перегородка разделяет аортальный мешок на восходящую аорту и пульмональный ствол (pulmonary trunk) (Fig. 6A, B). Обе артериальные стенки содержат множество Isl-1 позитивных клеток (Fig. 6A-C), и часть из них является продолжением клеток области конуса (Fig. 6C, arrow). Соседние срезы показывают, что немногие α-SMA позитивные гладкомышечные клетки формируются в обеих артериях (Fig. 6D, E, arrow). Мы также наблюдали спорадические Isl-1 позитивные клетки в аорико-пульмональной перегородке, которые соседствовали с кончиком области конуса (Fig. 6B).

SHF of the human embryo shows dynamic spatiotemporal distribution pattern

У эмбрионов кур и мышей было продемонстрировано, что SHF распределяется в спланхнической мезенхиме, соседствующей с энтодермой передней кишки, которая вносит вклад в миокард OFT и правого желудочка (Cai et al. 2003; Verzi et al. 2005; Sun et al. 2007). Однако менее известно о SHF эмбрионов человека (Abu-Issa et al. 2004). В данном исследовании между ст. CS10 и CS12, Isl-1 позитивные клетки обнаруживались в билатеральной фарингеальной мезенхиме, мезенхимной сердцевине (core) бранхиальных дуг и в спланхнической мезодерме дорсальной стенки перикардиальной полости. Т.к. Isl-1 был использован для маркирования клеток предшественников SHF после образования кардиальной трубки, то мы пришли к выводу, что во время ст. CS10 - CS12, SHF эмбрионов человека состоит из Isl-1 позитивной области, упомянутой выше. В др. исследовании было сообщено, что экспрессия Isl-1 может наблюдаться вне энтодермы вентральной части передней кишки после ст. CS12 у эмбрионов человека, это позднее, чем у эмбрионов мышей (Golzio et al. 2012). Но наши результаты показывают, что Isl-1 начинает экспрессироваться в билатеральной фарингеальной мезенхиме и спланхнической мезодерме со ст. CS10, соответствующей 8.5-9.0 дневным эмбрионам мыши. Поэтому мы можем настаивать на выводе, что паттерн распределения SHF на ранних стадиях эмбриогенеза человека совпадает с таковым у эмбрионов кур и мышей (Cai et al. 2003; Tirosh-Finkel et al. 2006; Sun et al. 2007; Nathan et al. 2008).

На ст. CS13 и CS14, спланхническая мезодерма дорсальной стенки перикардиальной полости всё ещё обнаруживается как Isl-1 позитивная. В билатеральной и вентральной фарингеальной мезенхиме Isl-1 позитивные клетки драматически умножаются и формируют конусообразную область (cone area). Показано, что пролиферация SHF нуждается в некоторых регуляторных сигналах из фарингеальной энтодермы, таких как sonic hedgehog (Shh) (Dyer & Kirby 2009). Согласно нашим результатам, на ст. CS13, некоторые клетки фарингеальной энтодермы обнаруживают морфологические изменения и смешиваются с соседними Isl-1 позитивными мезенхимными клетками. Полученные результаты подтверждают, что клетки фарингеальной энтодермы могут дифференцироваться в Isl-1 позитивные мезенхимные клетки. Это указывает на то, что роль фарингеальной энтодермы в пролиферации в SHF не ограничивается предоставлением сигналов. На ст. CS14, Isl-1 позитивная мезенхимная сердцевина бранхиальных дуг 4, 6 неспособна служить продолжением стенки OFT. Эти находки показывают, что мезенхимная сердцевина бранхиальных дуг, являющаяся частью SHF, не включает все бранхиальные дуги, а только первые три. На ст. CS16, Isl-1 позитивная область конуса становится более отчетливой. Данные показывают, что со ст. CS13, в отличие от ст. CS10 - CS12, SHF состоит из Isl-1 позитивной области конуса и спланхнической мезодермы дорсальной стенки перикардиальной области. Это означает в соответствии с транслокацией первичной кардиальной трубки в торакс, что меняется и паттерн распределения SHF. Т.о., SHF должно рассматриваться как динамическая структура.

SHF contributes to the development of the distal wall of the OFT in human embryo

Наши предыдущие результаты и др. сообщения выявили, что у эмбрионов человека на ст. CS14, стенка OFT состоит из MHC позитивного миокарда, эндокарда и эндокардиальных подушек между ними. Некоторые мезенхимные клетки в подушках обнаруживают α-SMA (Moorman et al. 2003; Yang et al. 2009). Т.о., эндокардиальные подушки могут быть идентифицированы по их морфологии и экспрессии α-SMA. Наши результаты показывают, что на ст. CS14, формируются два зубца (prongs) и обращены лицом др. к др. на стенке OFT. Более того, часть мезенхимных клеток в зубцах экспрессирует α-SMA. Это д. означать, что они являются эндокардиальными подушками OFT. Но в то же самое время, др. пара зубцов обнаруживается на стеке OFT,которая сосуществует с эндокардиальными подушками. Но зубцы экспрессируют только Isl-1 и лишены кардиомиоцитов или α-SMA позитивных мезенхимных клеток. Следовательно, функция зубцов д. быть отличной от эндокардиальных подушек. Хорошо известно, что зубцы не были описаны др. Трехмерная реконструкция показывает, что дистальный край MHC позитивного миокардиального OFT является седлообразной структурой с двумя пиками по бокам разделенными с помощью краниальных и каудальных вдавлений (Bartelings & Gittenberger-de Groot 1989; Ya et al. 1998), но механизм образования неизвестен. Наши находки показывают, что на дистальном полюсе часть стенки OFT лишена миокарда и аккуратно заполнена двумя зубцами. Следовательно, наши результаты предоставляют объяснение образованию седлообразной структуры и также показывают, что Isl-1 позитивные клетки участвуют в развитии дистальной части OFT. Однако необходимы дальнейшие исследования для прояснения судьбы Isl-1 позитивных клеток в зубцах.

The function of Isl-1 positive cells of SHF in human embryo

Во время CS10 - CS14, Isl-1 позитивные клетки предшественники SHF вносят вклад в образование миокардиальных клеток, чтобы сделать OFT более длинным. На ст. CS15 и CS16 у эмбрионов человека аортальный мешок разделяется аортико-пульмональной перегородкой на восходящую аорту и пульмональный тракт. Наши результаты показывают, что Isl-1 позитивные клетки распределены в стенках обеих артерий. Между тем, α-SMA позитивные гладкомышечные клетки также образуются в артериальной стенке. Эти находки подразумевают, что на этих стадиях Isl-1 позитивные клетки SHF могут вносить вклад в дифференцировку в гладкомышечные клетки. На тех же самых стадиях Isl-1 позитивные клетки также распространяются в аортико-пульмональную перегородку. Было продемонстрировано, что перегородка происходит из клеток кардиального нервного гребня (Jiang et al. 2000; Engleka et al. 2005; Nakamura et al. 2006). Согласно нашим результатам лишь немногие клетки в перегородке экспрессируют Isl-1. Т.о., необходимо дальнейшее исследование того, происходят ли клетки кардиального нервного гребня из клеток, экспрессирующих Isl-1 или клетки SHF также участвуют в образовании аортико-пульмональной перегородки. Как упоминалось выше, во время ст. CS10 - CS14, Isl-1 позитивное SHF предоставляет клетки предшественники для образования миокарда в дистальной стенке OFT. На ст. CS15 и CS16, Isl-1 позитивные клетки распределены в артериальных стенках и аортико-пульмональной перегородке, они могут вносить вклад в дифференцировку гладкомышечных клеток. Итак, наши результаты предоставляют убедительные доказательства, что распределение и дифференцировка мощного Isl-1 позитивного SHF осуществляется с пространственно-временной специфичностью.

Nkx2.5 and GATA4 expression pattern in SHF of human embryo

Было продемонстрировано, что Nkx2.5 и GATA4 являются ключевыми транскрипционными факторами в FHF и SHF (Dodou et al. 2004; Klaus et al. 2007; Prall et al. 2007). Isl-1 является ранней узловой точкой и может регулировать Nkx2.5 и GATA4 во время развития SHF (Black 2007; Nathan et al. 2008). Мы отметили, что по сравнению с Isl-1, экспрессия Nkx2.5 или GATA4 ограничена частью SHF, такой как спланхническая мезодерма дорсальной стенки перикардиальной полости. Но не получено доказательств позитивных Nkx2.5 и GATA4 клеток, вносящих вклад в образование стенки корня восходящей аорты и пульмонального ствола и в аортико-пульмональную перегородку. В дифференцированных кардиомиоцитах стенки OFT Nkx2.5 и GATA4 сохраняют строгую экспрессию с CS10 по CS16. Др. исследование сообщает, что временное окно экспрессии GATA4 в стенке OFT эмбрионов человека приходится с CS13 по CS15 (Golzio et al. 2012), это короче, чем временной промежуток, установленный нами. Было продемонстрировано, что Nkx2.5 или GATA4 мутантные эмбрионы обнаруживают гипоплазию OFT (Kuo et al. 1997; Molkentin et al. 1997; Prall et al. 2007). Итак, можно предполагать, что Nkx2.5 и GATA4 регуляция дифференцировки из клеток предшественников в миокардиальные клетки SHF происходит в раннем развитии эмбрионов. Во время более позднего развития, Nkx2.5 and GATA4 могут способствовать прогрессивному созреванию дифференцированных миокардиальных клеток после миграции в стенку OFT. Подавление экспрессии Isl-1 в зрелых кардиомиоцитах подтверждает, что Isl-1 вносит вклад только в дифференцировку из мезенхимных клеток в миокардиальные клетки и не играет важной роли в прогрессивном созревании дифференцированных миокардиальных клеток.

Second heart field and the development of the outflow tract in human embryonic heart Yan-Ping Yang,Hai-Rong Li,Xi-Mei Cao,Qin-Xue Wang,Cong-Jin Qiao,Jing Ya Development, Growth & Differentiation 2013 Volume 55, Issue 3 Pages 359–367

Second heart field and the development of the outflow tract in human embryonic heart
Yan-Ping Yang,Hai-Rong Li,Xi-Mei Cao,Qin-Xue Wang,Cong-Jin Qiao,Jing Ya
Development, Growth & Differentiation 2013 Volume 55, Issue 3 Pages 359–367