Посещений:
СТАРЕНИЕ

Стволовые клетки

Human stem cell aging: do mitochondrial DNA mutations have a causal role?
Holly L. Baines, Douglass M. Turnbull, Laura C. Greaves
Aging Cell Volume 13, Issue 2, Pages 201-205 2014

A decline in the replicative and regenerative capacity of adult stem cell populations is a major contributor to the aging process. Mitochondrial DNA (mtDNA) mutations clonally expand with age in human stem cell compartments including the colon, small intestine, and stomach, and result in respiratory chain deficiency. Studies in a mouse model with high levels of mtDNA mutations due to a defect in the proofreading domain of the mtDNA polymerase ? (mtDNA mutator mice) have established causal relationships between the accumulation of mtDNA point mutations, stem cell dysfunction, and premature aging. These mtDNA mutator mice have also highlighted that the consequences of mtDNA mutations upon stem cells vary depending on the tissue. In this review, we present evidence that these studies in mice are relevant to normal human stem cell aging and we explore different hypotheses to explain the tissue-specific consequences of mtDNA mutations. In addition, we emphasize the need for a comprehensive analysis of mtDNA mutations and their effects on cellular function in different aging human stem cell populations


Рисунки к статье




Stem cell aging


Старение это стохастический процесс, характеризующийся снижением гомеостатических и регенеративных процессов в тканях (Kirkwood, 2005). Общие признаки старения, такие как снижение заживления ран на коже, снижение иммунитета, поседение волос и потеря волос, всё это результат снижения тканевого гомеостаза и регенерации с возрастом из-за снижения функции соматических стволовых клеток (Sharpless & DePinho, 2007).
В нормальных условиях стволовые клетки делятся асимметрично и дают др. стволовую клетку для самообновления и одну дочернюю клетку, которая дифференцируется в эффекторную клетку предшественник (Liu & Rando, 2011) для поддержания функции нормальной ткани. По мере нашего старения стволовые клетки получают повреждения, обусловленные хронологическим и репликативным старением, особенно стволовых клеток в быстро реплицирующихся тканях, таких как кишечник, кожа и кровь (Liu & Rando, 2011). В некоторых реплицирующихся тканях это вызывает истощение пула стволовых клеток или из-за репликативного старения или снижения способности к самообновлению, обычно наблюдаемому в нейральных стволовых клетках (Maslov et al.,2004) и стволовых клетках меланоцитов (Nishimura et al., 2005). Альтернативно, стволовые клетки могут подвергаться злокачественной трансформации, повышающей риск раковых опухолей с возрастом (Liu & Rando, 2011). Однако в большинстве случаев стволовые клетки выдерживают альтерации в своей обычной судьбе и функции их потомства, обусловленные нарушениями их дифференцировки, как это видно на hematopoietic stem cells (HSCs) (Rossi et al., 2005). Понимание молекулярных механизмов, ответственных за такие связанные с возрастом изменения в нормальной судьбе и функции популяции стволовых клеток у взрослых важно, если мы имеем целью удержание от дегенерации ткани, продолжения регенерации и улучшения здоровья в старости.
Повреждения mitochondrial DNA (mtDNA), приводящие к дисфункции дыхательной цепи, как полагают, вносит важный вклад в старческий фенотип (Linnane et al., 1989). Многочисленные исследования предоставляют доказательства взаимосвязи между дефектами mtDNA и старением стволовых клеток человека (Taylor et al.,2003; McDonald et al., 2008; Fellous et al., 2009); однако, эти данные могут быть случайными и дефекты mtDNA могут быть просто биомаркерами процесса старения.

Mitochondria


Митохондрии являются динамическими, внутриклеточными органеллами, которые прежде всего действуют, чтобы генерировать АТФ с помощью процесса оксидативного фосфорилирования. Митохондриальный геном является единственным внеядерным источником ДНК в клетке и ковалентно замкнут, это молекула в 16 596 пар оснований кодирует 37 генов, включая 13 важных субъединиц дыхательной цепи, 2 rRNAs (12s и 16s) и 22 tRNAs (Anderson et al., 1981).

Mitochondria and aging


Митохондриальная теория старения базируется на принципе, что соматические мутации в mtDNA накапливаются в течение всей жизни и приводят к снижению митохондриальной функции и функции дыхательной цепи (Miquel et al., 1980). Впоследствии возникает дисфункция ткани из-за дефектов в энергетическом метаболизме, апоптозе и старении, приводящих в конечном счете к связанной с возрастом ломкости и болезни (Taylor & Turnbull, 2005). Теория старения из-за митохондриальных свободных радикалов предполагает, что они активируют порочный цикл, благодаря чему дисфункция системы оксидативного фосфорилирования вызывает усиление продукции ROS и дальнейшее повреждение mtDNA, приводящее к прогрессивному накоплению соматических мутаций mtDNA с возрастом и к дальнейшим оксидативным повреждениям, приводящих в конечном счете к гибели клеток (Harman, 1972). Однако существует множество противоречий, связанных с теорией старения из-за митохондриальных свободных радикалов, т.к. длительно живущие виды иногда демонстрируют более низкие уровни ROS (Chen et al., 2007) а долго живущие млекопитающие, такие как голые слепши, демонстрируют безусловно высокие уровни ROS и высокие уровни оксидативных повреждений липидов, ДНК и белков (Andziak et al., 2006). Более того, отсутствуют доказательства, подтверждающие, что показатель оксидативного повреждения mtDNA выше, чем ядерной ДНК (Lim et al., 2005).
Альтернативно, было предположено, что мутации мтДНК принципиально индуцируются в результате ошибок репликации, вызываемых полимеразой Y в мтДНК (Zheng et al.,2006). Данные компьютерных моделей (Elson et al., 2001) и исследований митохондриальных мутаций (Coller et al., 2005) подтвердили, чо такие ошибки репликации возникают во время раннего развития и накапливаются в течение всей жизни с помощью механизма клональной экспансии и случайного генетического дрейфа (Elson et al., 2001). Учитывая мудьтикопийную природу мтДНК в клетках, большинство точечных мутаций оказывается высоко рецессивным и проявляется только, когда точковая мутация клонально размножится и достигнет критического порога, после которого обнаруживаются дефекты дыхательной цепи. Эти пороги отличны для разных типов мутаций мтДНК, но в целом ~60% для делетированных мтДНК (Sciacco et al., 1994) и ~85% для точковых мутаций (Boulet et al., 1992). Такой дефект может быть действительно обнаружен за счет отсутствия гистохимического окрашивания на cytochrome c oxidase (COX) (Old & Johnson, 1989).

Somatic MtDNA mutations in aging human mitotic tissues


Мутации мтДНК первоначально были обнаружены в постмитотических тканях старых людей с мозаичным паттерном дефицита COX в сердце (Muller-Hocker, 1989), мышцах (Muller-Hocker, 1990) и головном мозге (Cottrell et al., 2001). Недавно дефекты дыхательной цепи, как было установлено, накапливаются до значительных уровней в митотических тканях старых людей, включая толстую кишку (Taylor et al., 2003), печень, поджелудочную железу (Fellous et al., 2009), желудок (McDonald et al., 2008) и тонкий кишечник (Gutierrez-Gonzalez et al., 2009). Анализ одиночных COX-дефицитных клеток в этих исследованиях выявил, что клеточный дефект непосредственно вызывается клонально размноженными точковыми мутациями соматической мтДНК. В толстом кишечнике человека COX-дефицитные крипты редко обнаруживаются до 30-го возраста (Taylor et al., 2003) , а большинство точковых мутаций мтДНК идентифицируется как замена оснований, которые, скорее всего, обусловлены ошибками во время репликации мтДНК (Greaves et al., 2012). Это ещё больше подкрепило гипотезу, что соматические мутации мтДНК принципиально возникают во время ранней жизни и накапливаются в течение всей взрослой жизни за счет клональной экспансии (Elson et al., 2001; Coller et al., 2005). Более того, в старости соматические мутации мтДНК в толстом кишечнике человека появляются случайно и обычно они не синонимные или это мутации сдвига рамки считывания, которые существенно более патогенны, чем варианты зародышевой линии (Greaves et al., 2012). Это указывает на отсутствие селективных ограничений, репликации и/или избирательной клональной экспансии соматических мутаций мтДНК в митотических тканях. В митотических тканях единственными долгоживущими клетками являются стволовые клетки и раз так, то мутации мтДНК д. появляться и фиксироваться только в этих клетках, строго указывая на роль мутаций мтДНК в старении стволовых клеток.
При старении мутации мтДНК в толстом кишечнике человека и недостаточность дыхательной цепи ассоциируют с измененным клеточным фенотипом, характеризующимся снижением в криптах количества клеток и клеточной пролиферации (Nooteboom et al., 2010). Однако это единственное исследование функциональных последствий дисфункции митохондрий в реплицирующихся тканях человека, т.к. исследования на людях ограничены из-за трудной доступности выборок ткани человека и из-за отсутствия маркеров здоровых стволовых клеток. Поэтому остается в основном неизвестным, как дефекты мтДНК вносят вклад в старение стволовых клеток у человека.

Use of animal models


Чтобы исследовать потенциальную роль точковых мутаций мтДНК при старении необходимо использование животных моделей. Совершенствование мтДНК mutator мышей предоставило определенные доказательства причинной взаимосвязи между мутациями мтДНК и старением. Такие мыши были гомозиготными по мутации (D257A) в считываемом (proofreading) домене мтДНК polymerase γ, существенно снижающей proofreading активность и приводящей к ускоренному накоплению мутаций в мтДНК сильной недостаточности дыхательной цепи (Trifunovic et al., 2004; Kujothet al., 2005). MtDNA mutator мыши обнаруживают укороченную продолжительность жизни и фенотип преждевременного старения, который сильно напоминает обычное старение у людей и характеризуется сгорбленностью (kyphosis), уменьшением подкожного жира, выпадением волос, потерей веса, анемией, остеопорозом, пониженной плодовитостью и увеличенным сердцем (Trifunovic et al., 2004; Kujoth et al., 2005).

Premature aging is driven by stem cell dysfunction in мтДНК mutator mice


Соматические мутации мтДНК у мтДНК mutator мышей возникают в результате ошибок репликации во время развития (Ameur et al., 2011), ряд исследований показал, что это вызывает дисфункцию стволовых клеток с ранним началом, это приводит к тканеспецифическим фенотипам старения у таких мышей.
Аномалии в популяциях стволовых клеток у мтДНК mutator мышей существенно варьируют в зависимости от ткани; при этом некоторые обнаруживают непосредственный эффект на пул стволовых клеток, а др. демонстрируют эффекты на нижестоящие события дифференцировки и на ранних предшественников. В гематопоэтической системе мтДНК mutator мыши, мутации в мтДНК вызывают блокирование событий ранней дифференцировки и приводят к аномалиям нижестоящих клеток гематопоэтических предшественников, но не оказывают непосредственного влияния на пул hematopoietic stem cell (HSC) (Norddahlet al., 2011). Нарушения дифференцировки и возникающие в результате аномальне миелоидные клоны непосредственно связаны с анемией и лимфопенией у мтДНК mutator мышей, которые являются принципиальными, управляющими факторами преждевременного старения, у этих животных (Ahlqvist et al., 2012). При сравнении, аномалии нейральных стволовых клеток оказывают непосредственный эффект на функцию стволовых клеток, характеризующийся снижением количества покоящихся стволовых клеток и снижением у них способности к самообнослению в ответ на накопление мутаций мтДНК (Ahlqvist et al.,2012). Исследования клеток эпителиальных крипт в тонком кишечнике у мтДНК mutator мышей показали повышенные уровни апоптоза, снижение количества пролиферирующих клеток и нарушения развития происходящих из стволовых клеток органоидов in vitro (Fox et al., 2012). Эти аномалии соответствуют потере активности дыхательной цепи и вносят вклад в снижение абсорбции пищевых липидов в кишечнике (Fox et al., 2012).
так, эти исследования показали, что старение управляется с помощью дисфункции стволовых клеток в ответ на накопление точковых мутаций мтДНК. Однако всё ещё остается неизвестным, как точковые мутации мтДНК приводят к дисфункции стволовые клетки и, кроме того, почему мы наблюдаем тканеспецифичные альтерации в их стволовых клетках непосредственно или в судьбе стволовых клеток и в нижестоящих событиях дифференцировки? Известно. что реализуются разные клеточные судьбы у поврежденных стволовых клеток; однако, мы не знаем, что предопределяет, будут ли поврежденные стволовые клетки подвергаться клеточной гибели, старению или злокачественному превращению в ответ на мутации мтДНК.

Proposed mechanisms for the effect of somatic мтДНК mutations on stem cell function


Одним из возможных объяснений является индивидуальные ниши стволовых клеток и микроокружение. Поддержание соматических стволовых клеток базируется на балансе между самообновлением и дифференцировкой, который регулируется частично с помощью передачи сигналов и физиологических ROS молекул (Hamanaka and Chandel, 2010). Альтерации в передаче сигналов ROS оказывают значительные эффекты на молчащее и активное состояние популяций стволовых клеток, вызывая сдвиги в пролиферации или дифференцировке, в частности в HSCs (Shao et al., 2011). У мтДНК mutator мышей аномальные фенотипы, наблюдаемые в нейральных стволовых клетках и клетках гематопоэтических предшественников, устранялись при добавлении антиоксиданта N-acetyl-L-cysteine (Ahlqvist et al., 2012). Это указывает на то, что мутации мтДНК могут вызывать незначительные изменения в redox статусе, к которому стволовые клетки чрезвычайно чувствительны, это воздействует на их способность к регенерации и восстановлению (Ahlqvist et al.,2012). Необходимо подтверждение, что N-acetyl-L-cysteine, широко используемый фармацевтами и участвующий в многообразных физиологических процессах, отличных от очистки ROS, часть из которых включают модулирование клеточной пролиферации, регулирование иммунного ответа и метаболизм prostaglandins и leukotrienes (Samuni et al., 2013). Т.о., лечение N-acetyl-L-cysteine может приводить к устранению аномальных фенотипов стволовых клеток у мтДНК mutator мышей, используя др. физиологические механизмы помимо правильного redox статуса. Тем не менее, очень вероятно, что мутации мтДНК могут вызывать умеренные альтерации в передаче сигналов ROS и что существуют специфические ниши стволовых клеток и стволовые клетки в активном или покоящемся состоянии, что и предопределяет, как как стволовые клетки бвдут реагировать на изменения с статусе redox и последующие изменения в клеточных судьбах и в тканеспецифической дисфункции (Fig. 1). Напр., в кишечнике, в ткани с высокой пролиферацией, стволовые клетки довольно активны и поэтому альтерации в передаче сигналов ROS, скорее всего, будут влиять на события пролиферации, как это наблюдается у мтДНК mutator мышей (Fox et al., 2012). Это находится в контрасте с гематопоэтической системой, где HSCs поддерживаются в основном в спящем и покоящемся состоянии (Shao et al., 2011), а изменения в передаче сигналов ROS могут оказывать эффект только в момент активации и дифференцировки стволовых клеток, как это наблюдается у мтДНК mutator мышей (Norddahl et al., 2011; Ahlqvist et al., 2012).
Альтернативно мутации мтДНК могут не только непосредственно воздействовать на стволовые клетки в момент дифференцировки ранних стволовых клеток, приводя к продукции аномального потомства клеток, но и приводя к потере поддержки для соматической ткани (Fig. 1). У мтДНК mutator мышей точковые мутации мтДНК, как было установлено, затрагивают клетки гематопоэтических предшественников во время дифференцировки, а HSCs остаются незатронутыми, несмотря на присутствии того же самого уровня мутаций мтДНК (Norddahl et al., 2011; Ahlqvist et al., 2012). Доказательства подтверждают, что соматические стволовые клетки могут быть полностью резистентны к дисфункции митохондрий, т.к. они поддерживаются в основном спящем/покоящемся состоянии, содержат мало митохондрий и зависят в основном от гликолиза, продуцирующего энергию, чем от оксидативного метаболизма (Simsek et al., 2010; Shao et al., 2011). Только во время дифференцировки, когда содержание митохондрий и уровни АТФ увеличиваются, предположительно оксидативное фосфорилирование играет лишь минорную роль в покоящихся стволовых клетках и при самообновлении, но нижестоящие предшественники нуждаются в нормальной функции митохондрий (Inoue et al., 2010). Т.о. могут существовать тканеспецифические процессы дифференцировки стволовых клеток и чувствительное потомство клеток, которые обеспечивают разные фенотипы старения, вызываемые точковыми мутациями мтДНК.

Concluding remarks


In this review, we have presented evidence that somatic мтДНК mutations and respiratory chain deficiency accumulate to significant levels in aging human replicative tissues, and evidence from the мтДНК mutator mice demonstrates that мтДНК mutations directly cause stem cell dysfunction and induce age-related phenotypes. It has been shown that somatic mutagenesis is influenced by pre-existing germline мтДНК mutations in mice that can accelerate the clonal expansion of somatic мтДНК mutations and have life-long consequences, causing certain features of premature aging (Ross et al., 2013). Low-level heteroplasmic мтДНК mutations are also commonly inherited through the female germline in humans (Li et al., 2010; Payne et al., 2013) and are thus likely to aggravate somatic mutagenesis and the aging process in subsequent generations.
Studies in the мтДНК mutator mice have also highlighted the importance of interactions between the nuclear and mitochondrial genome, when considering the role of somatic мтДНК mutations in aging. In the two strains of мтДНК mutator mice, the different nuclear backgrounds appear to play a significant role in the severity of the premature aging phenotypes, the levels of COX deficiency detected in tissues (H.L. Baines & L.C. Greaves, unpublished data from our lab), and lifespan, with the European strain (C57Bl/6N background) (Trifunovic et al., 2004) displaying a more severe phenotype than the American strain (C57Bl/6J background) (Kujoth et al., 2005). Thus, it is likely that variation between human nuclear genomes will influence the effects and extent to which somatic мтДНК mutations and mitochondrial dysfunction play a role in tissue dysfunction and aging.
While the incidence of mitochondrial dysfunction is higher in the мтДНК mutator mice than in normal human aging, the development and types of мтДНК mutation, the clonal expansion, and the respiratory chain deficiency are similar. Thus, somatic мтДНК mutations are likely to contribute to stem cell dysfunction and age-related phenotypes in a similar manner in normal human aging, but to a lesser effect. Nevertheless, in мтДНК mutator mice, aging is driven solely by мтДНК mutations, whereas normal human aging is a complex, multifactorial process driven by multiple molecular mechanisms including not only мтДНК defects but also ROS, senescence, and damaged proteins.
To truly understand the role of мтДНК point mutations in human stem cell aging, future research should focus on establishing a comprehensive overview of clonally expanded мтДНК point mutations and respiratory chain deficiency in all aging human replicative tissues, in particular concentrating on any associated changes in markers of stem cell function such as proliferation, differentiation, and self-renewal. Furthermore, studies should be performed in replicative tissues of mitochondrial disease patients with different мтДНК point mutations as this would have profound implications for our understanding of mutation and tissue-specific effects in stem cell compartments. Only then will we be able to determine the consequences and contribution of мтДНК defects in stem cell aging and how this may influence the human aging phenotype as a whole.