Нейроанатомические и функциональные различия между левой и правой сторонами нервной системы законсервированы и являются важным признаком, предоставляющим селективные преимущества для нейрональных вычислительных операций и эффективности поведения (Concha et al., 2012). Одним из центральных вопросов, привлекающим внимание исследователей, является, как развиваются асимметричные нервные связи (circuits) в эмбриональной нервной системе. У позвоночных этот вопрос начал систематически исследоваться с использованием рыбок данио, модельного организма, пригодного для генетических манипуляций и прямого наблюдения за процессами развития, также имеющих бросающуюся в глаза асимметрию в эпиталямусе диэнцефалона (Concha, 2004;Concha et al., 2009; Roussigne et al., 2011). Регион эпиталямуса формируется двумя главными группами нейронов: комплекс шишковидной железы (состоящий из шишковидной железы и parapineal ядер) и habenula (Hb) (Concha and Wilson, 2001). Среди этих ядер Hb функционирует в качестве ретрансляционной станции, которая связывает лимбические (limbic) и исчерченные (striatal) ядра переднего мозга с моноаминергическими системами вентральной части среднего мозга (Bianco and Wilson, 2009; Aizawa et al., 2011). У рыбок данио Hb представлена дорсальным (d-Hb) и вентральным (v-Hb) доменами, которые гомологичны медиальной и латеральной Hb млекопитающих, соотв. (Aizawa et al., 2005; Aizawa et al., 2011). В противоположность млекопитающих d-Hb рыбок данио дает выраженную клеточную и молекулярную асимметрию, начиная с 36 hours post-fertilisation (hpf), которая, по-видимому, базируется на латерализованных различиях во время нейрогенеза (Aizawa et al., 2007). Такая генетически закодированная асимметрия, как полагают, зависит, по крайней мере, частично от ранних взаимодействий, устанавливаемых между Hb и расположенным на левой стороне parapineal ядром (Concha et al., 2003; Gamse et al., 2003;Bianco et al., 2008), и приводит к асимметричной организации молекулярных маркеров, которые определяют латеральный (d-HbL) и медиальный (d-HbM) клеточные субдомены в d-Hb (Gamse et al., 2003; Aizawa et al., 2005; Agetsuma et al., 2010). Важным дополнительным признаком, обнаруживаемым однополярными нейронами d-HbL и d-HbM, является их отличающаяся окончательная морфология аксонов и избирательность мишеней для дорсального и вентрального доменов interpeduncular nucleus (IPN) (Gamse et al., 2003; Aizawa et al., 2005; Bianco et al., 2008). Как следствие такой избирательности и асимметричной организации d-HbL и d-HbM доменов, проекции нейронов от левой (главным образом d-HbL) и правой (главным образом d-HbM) в основном сегрегируют внутри дорсального и вентрального доменов в IPN, соотв. (Aizawa et al., 2005; Gamse et al., 2005), и этот отличительный нейрональный субстрат, по-видимому, играет важную роль в модуляции поведенческих реакций страха, боязни и индуцируемых стрессами стимулов (Facchin et al., 2009; Agetsuma et al., 2010; Lee et al., 2010; Jesuthasan, 2011).

Помимо наблюдаемой клеточной и молекулярной асимметрии у рыбок данио d-Hb также развивает структурные асимметрии в размере и организации доменов нейропилей (Concha et al., 2000), внутри которых дендритные отростки от habenular нейронов смешиваются и образуют синапсы с центростремительными аксонами, приходящими из др. регионов переднего мозга посредством stria medullaris (Hendricks and Jesuthasan, 2007a; Bianco et al., 2008; Miyasaka et al., 2009). Образование habenular нейропиля начинается ~48 hpf, после спецификации клеточных доменов d-HbL и d-HbM и прогрессивно увеличивается на левой стороне, достигая заметной асимметрии построений на 4-й день развития (Concha et al., 2000; Concha et al., 2003). Эта организация асимметрии нейропиля напоминает асимметричное распределение транскриптов kctd12.1 (Gamse et al., 2003), подтверждая причинную связь между организацией нейропиля и асимметричным распределением подтипов клеток в d-Hb. В соответствии с этой идеей, потеря или избыток функции Kctd12.1 затрагивает образование habenular нейропиля (Taylor et al., 2011), и асимметрия habenular нейропиля становится нарушенной в условиях, которые влияют на асимметричную экспрессию kctd12.1, как после устранения parapineal ядра (Concha et al., 2003; Bianco et al., 2008) и у мутантов с дефектной передачей сигналов Fibroblast growth factor 8 (Fgf8) (acerebellar^-/-, ace^-/-) (Regan et al., 2009) или с Wnt/β-catenin (masterblind^-/-, mbl^-/-) (Carl et al., 2007). В этих случаях d-Hb развивается в почти билатерально симметричную структуру.

Несмотря на наше возрастающее понимание сигнаьных событий, которые специфицируют асимметрию нейронов в d-Hb, всё ещё известно очень мало о том, как возникает структурная асимметрия в распределении нейропилей. В данном исследовании мы идентифицировали новый генетический компонент пути, который контролирует асимметрию образования нейропиля в d-Hb рыбок данио. Фактор dishevelled associated activator of morphogenesis 1a (daam1a) был выделен с помощью обратного генетического скрининга по поиску генов, дифференциально экспрессирующихся на левой и правой стороне головного мозга рыбок данио. Ген daam1a кодирует Diaphanous-related formin (Drf) белок, относящийся к филогенетически законсервированному семейству Formin актин ассоциирующих факторов (Wallar and Alberts, 2003). Степень экспрессии Daam1a соответствует асимметричному росту habenular нейропиля во время эмбриональной и личиночной стадии рыбок данио. Локальная потеря или избыток функции Daam1a в левой части Hb до начала образования нейропиля ведет к снижению или увеличению левого habenular нейропиля, соотв., без нарушения нейрогенеза или спецификации типов клеток. На уровне одиночных habenular нейронов, нокдаун Daam1a ведет к нарушению роста как дендритных, так и аксональных отростков. Наши результаты показывают, что Daam1a является ключевым модулятором асимметричного habenular морфогенеза, обеспечивая рост дендритных и аксональных отростков дорсальных habenular нейронов.

DISCUSSION

В данном исследовании мы использовали обратный генетический подход, чтобы идентифицировать daam1a в качестве нового генетического компонента пути, который контролирует асимметричный habenular морфогенез. Экспрессия daam1a в развивающемся Hb сопровождает спецификацию клеточных подтипов и отражает асимметричные изменения в росте нейропиля на эмбриональной и личиночной стадиях. В соответствии с ролью Daam1a, стоящего ниже основных путей, которые контролируют развитие асимметрии головного мозга (напр. Fgf и Wnt) и его анизотропность (Nodal) в головном мозге, экспрессия habenular daam1a становится асимметричной у ace^-/- и mbl^-/- мутантов и рандомизированной после потери функции Spaw или Ntl. Важно, что потеря или избыток функции Daam1a снижает и увеличивает, соотв., образование habenular нейропиля и центробежных аксональных связей с IPN без нарушения habenular нейрогенеза или спецификации типов клеток. Эти находки и тот факт, что Daam1a способствует росту нейропиля посредством нижестоящего Ulk2, показывают, что Daam1a играет ключевую роль в асимметричном habenular морфогенезе, обеспечивая рост habenular нейропиля и центробежные аксональные связи с IPN.

Противоположный модулирующий эффект, демонстрируемый потерей и избытком функции Daam1a в отношении способности обеспечивать рост дендритов и аксонов предоставляет строго доказательство в подтверждение роли Daam1a в качестве ключевого модулятора нейронального морфогенеза в Hb. Точечное распределение экспрессии Daam1a в развивающемся habenular нейропиле и более специфически в дендритах habenular нейронов, также согласуется с участием Daam1a в росте нейрональных отростков. В самом деле, функциональное устранение Daam1a заметно нарушает образование дендритных отростков, определяемых в одиночных habenular нейронах, приводя к неполному или менее полному формированию паттерна окончаний аксонов в IPN. В соответствии с этим, Drosophila Daam (dDaam) и мышиный Daam1 (mDaam1) регулируют образование филоподий и выросты нейритов в развивающихся нейронах (Matusek et al., 2008; Salomon et al., 2008;Gon?alves-Pimentel et al., 2011). dDaam обнаруживает точечное распределение в структурах, богатых F-actin в конусах роста культивируемых первичных нейронов (Matusek et al., 2008), в то время как точечная экспрессия mDaam1 , наблюдается также в древке дендритов пирамидальных клеток гиппокампа и в синаптических регионах, где Daam1 локализуется совместно с пресинаптическими (Sv2) и постсинаптическими (Psd95; also known as Dlg4) маркерами (Salomon et al., 2008). Важно, что dDaam необходим для филоподиальных выростов в ростовых конусах аксонов (Matusek et al., 2008; Gon?alves-Pimentel et al., 2011), тогда как mDaam1, по-видимому, играет роль и в выросте дендритов (Salomon et al., 2008). У рыбок данио, habenular нейроны нуждаются в Daam1a для морфогенеза дендритов и аксонов, хотя эти два события, по-видимому, обнаруживают разную потребность в Daam1a, т.к. они затрагиваются в разной степени после нокдауна Daam1a (dendritic>axonal) и могут быть восстановлены в разной степени избыточной экспрессией hDAAM1 (опять же, dendritic>axonal). Кроме того, вытягивание дендритных отростков, по-видимому, является предметом локального контроля роста в зависимости от стороны Hb. Напр., местная электропортация C-DAAM1 индуцирует рост habenular нейропиля только, когда нацелена на L сторону, это подтверждает механизм, который сдерживает влияние Daam1 на рост нейропиля в R Hb, не нарушая его способность способствовать вытягиванию аксонов к IPN. Эти результаты, по-видимому, согласуются с недавно предложенной моделью асимметричной локальной модуляции роста habenular нейропиля, обеспечиваемого белками Kctd у рыбок данио (Taylor et al., 2011). В этой модели Kctd12.1 и Kctd12.2 экспрессируются прежде всего в L aи R Hb, соотв., оказывая более сильное ингибирование на рост нейропиля в R, чем на L стороне Hb путем взаимодействия с Ulk2, киназой, которая экспрессируется билатерально в Hb с 48 hpf (Taylor et al., 2011). Ингибируют ли Kctd белки способность Daam1a обеспечивать рост нейропиля в R Hb ещё предстоит определить. Однако, начало асимметричной экспрессии daam1a совпадает с началом экспрессии ulk2 и оба конкурируют за влияние на рост нейропиля в Hb, подтверждая связь между этими событиями. В самом деле, Daam1a и Ulk2 выполняют синергичные роли в обеспечении проста нейропиля. Более того, избыточная экспрессия hDAAM1 устраняет нарушенный фенотип нейропиля, вызванный функциональной потерей Ulk2 (тогда как Ulk2, по-видимому, неспособен восстанавливать фенотип, вызванный нокдауном Daam1a ) подтверждая, что Daam1a работает ниже Ulk2. Хотя эти находки согласуются с совместной ролью Daam1a и Ulk2 в обеспечении роста нейропиля посредством нижестоящих путей, которые устанавливают спецификацию клеточных подтипов в Hb. Где и как такое сотрудничество осуществляется, предстоит определить. Интригующая возможность заключается в пути эндоцитоза, поскольку Ulk1 и Ulk2 локализуются в везикулярных структурах ростовых конусов и регулируют рост нейрональных отростков посредством ранней доставки эндосом к будущим нейритам (Tomoda et al., 2004; Zhou et al., 2007; Toda et al., 2008), тогда как у рыбок данио Daam1a активно транспортируется в эндоцитотические пузырьки, а его асимметричная субклеточная локализация, по-видимому, имеет отношение к движениям конвергенции и вытягивания клеток хорды (Kida et al., 2007).

На уровне эффектора, Daam1a регулирует как F-actin, так и сборку микротрубочек во время habenular морфогенеза. Первая роль согласуется с предыдущим сообщением, показавшим, что Daam1 участвует в закреплении (нуклеации) F-actin и фактора элонгации, индуцируемого с помощью Rho GTPases (Prokop et al., 2011), и что dDaam кооперирует с Arp2 и Arp3 в общем механизме образования филоподий, который зависит от Enabled и регулируется посредством активности Profilin (Chickadee - FlyBase) (Gon?alves-Pimentel et al., 2011). Сообщения, связывающие Daam1 со сборкой микротрубочек и стабилизацией, однако, редки (Ju et al., 2010). Наблюдаемое увеличение в интенсивности мечения α-tubulin (+) после экспрессии hDAAM1 подтверждает, что у рыбок данио Daam1a регулирует динамику микротрубочек в Hb. Регуляция F-actin и динамики микротрубочек может быть результатом того, что Daam1a взаимодействует с др. сигнальными путями , такими как передача сигналов Wnt/PCP, которая, как известно, модулирует рост аксонов и дендритов (Wang and Nathans, 2007; Tissir and Goffinet, 2010). Daam1 работает как промежуточной звено в передача сигналов Wnt/PCP, это ведет к активации Rho и последующему ремоделированию цитоскелета во время гаструляции Xenopus и рыбок данио (Habas et al., 2001; Kida et al., 2007), а некоторые лиганды и стержневые компоненты Wnt/PCP экспрессируются в развивающемся Hb во время формирования нейропиля (data not shown).

Здесь мы продемонстрировали, что Daam1a играет ключевую роль в асимметричном habenular морфогенезе, регулируя рост дендритов и аксонов в дорсальных habenular нейронах, возможно посредством модулирования динамики цитоскелета. Хотя Daam1 и Ulk2 выполняют синергичную роль в обеспечении роста habenular нейропиля, нижестоящие пути, которые устанавливают спецификацию асимметричных типов клеток, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять как эти два фактора взаимодействуют и оказываются по-разному модулируемыми на L и R сторонах Hb.